涂金晶，張 鑫，劉 青

(延安大學附屬醫(yī)院超聲科，陜西 延安 716000)

·論 著·

乳腺癌超聲征象與P120ctn、Ki67表達水平的相關性

涂金晶，張 鑫，劉 青

(延安大學附屬醫(yī)院超聲科，陜西 延安 716000)

目的探討連環(huán)蛋白P120ctn和核增殖相關蛋白Ki67表達對乳腺癌超聲征象的影響。方法選擇乳腺癌患者組織標本124例，對相關生物樣本的分析按照乳腺癌診治規(guī)范進行。分析所有樣本的超聲征象，如腫塊邊緣、大小、形態(tài)、鈣化區(qū)域、淋巴結轉移、血流顯像分級等；采用免疫組織化學法檢測組織樣本中P120ctn和Ki67的表達水平；分析其與乳腺癌超聲征象的相關性。結果Ki67在乳腺癌組織中呈現(xiàn)陽性表達，P120ctn在乳腺癌組織中呈現(xiàn)陰性表達；在不同腫塊直徑和邊緣存在毛刺的組織中，P120ctn和Ki67的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在不同腫塊形態(tài)、不同分布的微小鈣化點、不同血流顯像分級和發(fā)生淋巴結轉移與否的組織中，P120ctn和Ki67的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達與超聲征象中的腫塊形態(tài)、微小鈣化點分布、血流顯像分級和淋巴結轉移特點存在聯(lián)系。Ki67和P120ctn蛋白表達之間呈正相關(P<0.05)。結論超聲征象與P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達之間存在一定的聯(lián)系，可以作為無創(chuàng)性預測乳腺癌患者P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達的方式，為乳腺癌惡變程度和預后的判斷提供更多的依據(jù)。

乳腺腫瘤；連環(huán)蛋白；核增殖相關蛋白

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，乳腺本身不是維持人體生命活動的重要器官，故原位乳腺癌并不致命；但若失去了正常細胞特性的乳腺癌細胞發(fā)生脫落，成為游離的癌細胞，則有可能隨血液或淋巴液播散全身，轉移到肝、肺、腎等其他重要的組織器官中，危及生命[1]。近年來，由于環(huán)境污染的加劇和生活壓力的加大，女性罹患乳腺癌的比例逐年升高，且患病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢[2]。目前，為了能及時診斷出乳腺癌，并在早期即開始治療，影像學手段和分子生物學技術都被運用到乳腺癌的早期診斷中[3]。彩色多普勒超聲檢查是在乳腺癌早期診斷中運用最廣泛的影像學手段。Ki67是一種用來有效評估乳腺腫瘤細胞增殖活性的核增殖相關蛋白，它已被廣泛地運用到乳腺癌診斷和病情發(fā)展判斷中。研究顯示Ki67在乳腺癌發(fā)生發(fā)展和轉移過程中都起到了重要的作用[4]。連環(huán)蛋白既是一種細胞黏附分子，又同時參與細胞信號轉導過程，P120ctn是連環(huán)蛋白家族的一員，P120ctn可以與轉錄抑制因子kaiso結合，參與到Wnt信號通路的信號轉導中。研究表明Wnt信號通路與細胞正常增殖、生長和分化密切相關[5]。細胞內(nèi)P120ctn表達的缺失也與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關。Ki67和P120ctn同時與腫瘤細胞的增殖生長有關，共同研究這兩者在乳腺癌組織中的表達，將有助于了解兩者之間是否存在聯(lián)系。本研究旨在探討連環(huán)蛋白P120ctn和核增殖相關蛋白Ki67的表達對乳腺癌超聲征象的影響，從而揭示乳腺癌發(fā)病可能的生物學機制。

1 資料與方法

1.1 一般選擇 選擇2012年3月—2015年3月在我院進行檢查和治療的乳腺癌患者124例，得到124例符合要求的乳腺癌組織標本。患者均為女性患者，年齡34～67歲，平均(49.8±4.6)歲；其中浸潤性導管癌84例、浸潤性小葉癌27例、勃液腺癌13例。

1.2 納入標準和排除標準 納入標準：①診斷符合衛(wèi)生部2011年8月12日正式頒布的《乳腺癌診斷》標準[6]：②心智健全，有自主判斷能力；③手術取組織樣本前未接受任何形式的放療或化療。排除標準：①存在肝腎等其他主要臟器耗損性疾病患者；②凝血系統(tǒng)功能異?；蚪?個月內(nèi)服用過抗凝藥物的患者。

本研究所有組織樣本均經(jīng)過患者本人確認同意，所有參與者均簽署知情同意書，整個研究過程在醫(yī)院倫理委員會監(jiān)督下完成。

1.3 研究方法 所有受試者術前均進行彩色多普勒超聲檢查，受試者取仰臥位，根據(jù)由乳腺到腋窩的順序采用高頻探頭進行檢查。記錄腫塊邊緣清晰與否，腫塊大小和形態(tài)，腫塊周邊血流分布情況，血流顯像的Adler分級處于0～1級或是2～3級，是否存在淋巴結轉移，鈣化區(qū)域的分布位置和形態(tài)。

所有受試者手術中切除的組織樣本均放入10%的中性甲醛溶液中進行固定，并進行石蠟包埋，而后將其制成4 μm的組織切片，用于檢測P120ctn和Ki67表達，檢測方法為免疫組織化學的鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶連接法(streptavidin-perosidase,SP)。陰性對照為PBS代替一抗?？贵w來源于美國Invitrogen 公司的Ki67兔多克隆抗體(SP5)，北京博奧森生物技術有限公司的P120連接素鼠抗人單克隆抗體。組織切片置入緩沖液中進行抗原高溫修復，持續(xù)20 min后用PBS進行沖洗，每次持續(xù)5 min，沖洗次數(shù)為3次。加入相應抗體，在4 ℃環(huán)境下放置超過8 h。再用PBS進行沖洗，每次持續(xù)2 min，沖洗次數(shù)為3次。加入聚合物輔助劑pv-9000，放置20 min，再用PBS進行沖洗，每次持續(xù)2 min，沖洗次數(shù)為3次。加入pv-9000試劑二，放置20 min，再用PBS進行沖洗，每次持續(xù)2 min，沖洗次數(shù)為3次。染色。

1.4 觀察指標 本研究主要觀察免疫組織化學檢測結果，在顯微鏡下觀察，若細胞中出現(xiàn)棕黃色的細小顆粒即為P120ctn蛋白和Ki67蛋白的陽性染色。每一張切片取400倍鏡下的任意10個視野，計數(shù)每一個視野中的100個細胞的染色狀況。計算出現(xiàn)陽性染色的細胞數(shù)目、染色強度，并進行評分。細胞數(shù)目項：若陽性染色細胞數(shù)目<10%，計1分；若陽性染色細胞數(shù)目在10%～50%，計2分；若陽性染色細胞數(shù)目>50%～75%，計3分；若陽性染色細胞數(shù)目>75%，計4分。染色強度項：顆粒為淡黃色計1分；顆粒為棕黃色計2分；顆粒為棕褐色計3分。最終得分為細胞數(shù)目項得分與染色強度項得分之積。結果判定：最終得分≥3分，表示陽性；<3分，表示陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關性采用Spearman分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 乳腺癌患者超聲惡性征象檢查結果 超聲檢查惡性征象結果顯示：124例患者中，腫塊直徑<2 cm的51例，腫塊直徑≥2 cm的73例；腫塊形狀規(guī)則的44例，腫塊形狀不規(guī)則的80例；腫塊邊緣出現(xiàn)毛刺的93例；腫塊出現(xiàn)微小鈣化點的102例，其中微小鈣化點呈簇狀分布的36例，呈散狀分布的30例，沿導管走向分布的有36例；乳腺癌出現(xiàn)淋巴結轉移的57例；血流顯像分級處于0～1級的32例，2～3級的92例。

2.2 P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達情況 124例乳腺癌患者的免疫組織化學結果顯示，P120ctn蛋白和Ki67蛋白主要在細胞核內(nèi)陽性表達，只有極少部分在細胞漿中表達(圖1～2)。其中，P120ctn蛋白在83例患者的乳腺癌組織中呈陰性表達，陰性表達率達66.94%；而Ki67蛋白在108例患者的乳腺癌組織中的陽性表達，其陽性表達率高達87.10%。

圖1 Ki67在細胞中的染色情況

Figure 1 The staining of Ki67 in cells

圖2 P120ctn在細胞中的染色情況

Figure 2 The staining of P120ctn in cells

2.3 不同超聲征象之間2種蛋白的表達 在腫瘤的不同大小、不同形態(tài)、不同邊緣，P120ctn的表達陰性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；沿血管走向的微小鈣化點P120ctn陰性表達率高于散在分布的微小鈣化點者(P<0.05)；血流分級2～3級的P120ctn的陰性表達率高于血流分級0～1級者(P<0.05);有淋巴結轉移者腫塊P120ctn的陰性表達率高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。腫瘤塊不同大小、不同邊緣、不同鈣化分布之間Ki67的表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，不規(guī)則腫塊Ki67的表達陽性率高于規(guī)則者(P<0.05)；血流分級2～3級的Ki67的表達陽性率高于0～1級者(P<0.05)； 有淋巴結轉移者Ki67的表達陽性率高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。見表1。

表1 不同超聲征象之間2種蛋白的表達

*P<0.05與散在分布比較(χ2檢驗)

2.4 相關性分析 在124例乳腺癌患者的組織切片中，P120ctn和Ki67同時陽性表達的有26例，只有P120ctn陽性表達的有15例，只有Ki67陽性表達的有82例，還有2種蛋白均為陰性表達的1例。Spearman相關分析顯示，乳腺癌組織中，P120ctn蛋白表達與Ki67蛋白表達之間呈負相關(P<0.05)。

表2 P120ctn蛋白與Ki67蛋白在乳腺癌組織中表達的相關性

3 討 論

在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中，基因P120ctn和Ki67的表達都在不同程度上與腫塊的生長、浸潤和轉移有關。而乳腺癌腫塊的不同病理時期，在影像學檢查結果上又將呈現(xiàn)出不同的征象。Ki67是一種用來有效評估乳腺腫瘤細胞增殖活性的核增殖相關蛋白，它已被廣泛運用到乳腺癌診斷和病情發(fā)展判斷中。研究顯示，Ki67在乳腺癌發(fā)生發(fā)展和轉移過程中都起到了重要的作用[7]，若在乳腺癌早期即檢出Ki67表達率顯著增大，則提示該乳腺癌的惡變程度大，發(fā)生轉移可能性大，腫塊生長快，侵襲能力強。P120ctn是連環(huán)蛋白家族中的一員，連環(huán)蛋白既是一種細胞黏附分子，又同時參與細胞信號轉導過程。P120ctn可以轉移進入細胞核，與細胞核內(nèi)的轉錄抑制因子kaiso結合，參與到Wnt信號通路的信號轉導中。研究表明，Wnt信號通路與細胞正常增殖、發(fā)育和分化密切相關[8-9]。研究顯示，若P120ctn表達缺失，則細胞發(fā)生癌變的概率將顯著增加[10]。Ki67和P120ctn同時與腫瘤細胞的增殖生長有關，本研究聯(lián)合檢測這兩者在乳腺癌組織中的表達，并分析兩者的表達與乳腺癌超聲征象之間的聯(lián)系。

本研究124例乳腺癌患者的免疫組織化學結果顯示，P120ctn蛋白的陰性表達率達66.94%，而Ki67蛋白的陽性表達率高達87.10%。將2種蛋白表達結果與患者的超聲征象聯(lián)合起來看，當超聲征象提示患者的乳腺癌存在淋巴結轉移或其血流顯像處于2～3級時，其組織切片中P120ctn蛋白的陰性表達率顯著提高，而Ki67蛋白的陽性表達率顯著提高。超聲征象提示乳腺癌存在淋巴結轉移或乳腺癌血流顯像處于2～3級時，表明該乳腺癌周圍血流豐富，發(fā)生淋巴結轉移的概率非常高，侵襲周圍健康組織的可能性大，腫塊惡變程度高。由此說明，淋巴結轉移和血流顯像分級超聲征象提示的乳腺癌惡變程度與Ki67和P120ctn不同表達水平提示的乳腺癌惡變程度相一致。Ki67還在腫塊形態(tài)規(guī)則的組織切片中高表達。在本研究中，規(guī)則的腫塊主要呈現(xiàn)類圓形，Ki67在這類組織切片中高表達。提示類圓形的腫塊惡變程度高，發(fā)生轉移和侵襲的可能性大。類圓形腫塊從形態(tài)上來看與周圍組織黏附度較低，其內(nèi)部組織結構紊亂，容易發(fā)生轉移[11-13]。表明腫塊形態(tài)上的超聲征象也與Ki67的表達相關。P120ctn蛋白在微小鈣化點沿導管走向的乳腺癌組織中陰性表達率最高。微小鈣化點沿導管走向的腫塊通常提示其具有明顯的壞死組織，且極易進一步鈣化，這類乳腺癌的惡變程度往往也較高[14-15]。由此說明，腫塊微小鈣化點的分布狀況上的超聲征象也與P120ctn蛋白的表達相關。P120ctn蛋白和Ki67蛋白在存在淋巴結轉移和血流顯像處于2～3級2種征象上的表達恰好相反，Ki67在類圓形腫塊組織中顯著陽性表達，P120ctn在微小鈣化點沿導管分布的腫塊組織中顯著陰性表達。進一步分析P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達的相關性顯示，這2種蛋白表達存在負相關，說明在進行乳腺癌分子生物學物質(zhì)檢查時，將這2種蛋白聯(lián)合檢查可以對檢查結果相互印證，并相互補充，有助于為乳腺癌惡變程度和預后的判斷提供更多的依據(jù)。

綜上所述，對乳腺癌患者進行彩色多普勒超聲檢查，得到的部分超聲征象可以反映乳腺癌的惡變程度；對乳腺癌患者進行分子生物學檢查，測定P120ctn蛋白和Ki67蛋白在組織中的表達也能體現(xiàn)乳腺癌的惡變程度；超聲征象與P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達之間存在一定的聯(lián)系，可以作為無創(chuàng)性預測乳腺癌患者P120ctn蛋白和Ki67蛋白表達的方式，為乳腺癌惡變程度和預后的判斷提供更多的依據(jù)。

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(本文編輯：許卓文)

Correlation between ultrasonic sign and the expression level of Ki67 and P120ctn in patients with breast cancer

TU Jin-jing， ZHANG Xin, LIU Qing

(DepartmentofUltrasound,AffiliatedHospitalofYan′anUniversity,Yan′an716000，China)

Objective To investigate the effect of P120ctn and Ki67 expression on breast cancer ultrasonography. Methods The breast cancer tissues of 124 patients with breast cancer who were examined and treated in our hospital. Analysis of the relevant biological samples was in accordance with the standard of diagnosis and treatment of breast cancer. The ultrasonic features of all the samples were analyzed, such as the edge, size, shape, calcification, lymph node metastasis, blood flow imaging and so on. The expression level of Ki67 and P120ctn in tissue samples was detected by immunohistochemical method, and their correlation with the ultrasonic features of breast cancer were analyzed. Results The expression of Ki67 in breast cancer tissues was positive, and the expression of P120ctn in breast cancer tissues was negative. There was no significant difference in the expression levels of P120ctn and Ki67 between the tissues with different diameters and edges(P>0.05). However, the expression of P120ctn and Ki67 were significantly different in the tissues with different shape, different distribution of microcalcifications, different blood flow imaging grade and lymph node metastasis(P<0.05). The expression of P120ctn protein and Ki67 protein was related to the shape of the tumor, the distribution of micro calcification, the grade of blood flow imaging and the characteristics of lymph node metastasis. The expression of P120ctn and Ki67 were negatively correlated(P<0.05). Conclusion The results showed that there was a certain relationship between ultrasonic signs and the expression of P120ctn protein and Ki67 protein. Ultrasonographic signs can be used as noninvasive prediction of the expression of P120ctn and Ki67 protein in patients with breast cancer to provide more evidence for the degree of malignancy and prognosis of breast cancer.

breast neoplasms; serial protein; nuclear proliferation related proteins

2016-06-29；

2016-07-11

涂金晶(1983-)，女，陜西延安人，延安大學附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學學士，從事超聲醫(yī)學診斷研究。

R737.9

A

1007-3205(2017)03-0316-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.017