王文偉，田露露，熊艷文，陳啟菁，彭 文，殷佩浩

(1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,上海 201210；3.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200333；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200062；5.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所，上海 200062)

·論 著·

慢性腎臟病血管鈣化小鼠模型的建立

王文偉1，田露露2，熊艷文3，陳啟菁2，彭 文4，殷佩浩5*

(1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,上海 201210；3.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200333；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200062；5.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤介入研究所，上海 200062)

目的提供一種慢性腎臟病血管鈣化小鼠模型的建立方法。方法利用昆明種小鼠，采用腺嘌呤聯(lián)合維生素D3，配合高磷飲食，建立慢性腎臟病血管鈣化模型。結(jié)果以腺嘌呤聯(lián)合維生素D3，配合高磷低蛋白飲食喂養(yǎng)小鼠6周后，模型組60只小鼠中，死亡6只，10只小鼠胸主動脈發(fā)生明顯鈣化(成功率約17%)；模型小鼠血清中尿素氮、血肌酐、尿酸、血磷和血鈣均較對照小鼠顯著增加(P<0.05)。未發(fā)生明顯鈣化的小鼠血管均發(fā)生血管壁明顯增厚、中層纖維變形的血管病變。結(jié)論采用腺嘌呤聯(lián)合維生素D3和高磷飲食6周可導(dǎo)致慢性腎病血管鈣化。 此方法簡便易行、成模時間短、穩(wěn)定性好，適于慢性腎病及血管鈣化的研究。

腎疾?。谎茆}化；疾病模型,動物

慢性腎臟病-礦物質(zhì)和骨異常 (chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)是指由CKD引發(fā)的礦物質(zhì)水平失調(diào)和機體系統(tǒng)骨代謝紊亂，具有鈣、磷、維生素D、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)代謝異常，骨翻轉(zhuǎn)、骨質(zhì)礦化、骨體積、骨強度或骨線性生長異常，血管及其他軟組織鈣化[1]等表現(xiàn)。成年CKD患者血管壁鈣化幾乎都是在中層[2-5]。目前有腺嘌呤大鼠腎毒性模型和六分之五腎切除(5/6 nephrectomy,5/6Nx)大鼠模型，但藥物用量大且成模率不高，小鼠基因敲除模型制備耗時久、成本高，故無法廣泛應(yīng)用[6]。國內(nèi)外尚未見腺嘌呤或5/6Nx切除誘導(dǎo)小鼠血管鈣化模型的報道，本研究提供一種CKD血管鈣化小鼠模型的建立方法，報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組 昆明種小鼠80只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量20 g，隨機分為模型組60只，對照組20只。所有小鼠均飼養(yǎng)在無特定病原體級動物房，光照每12 h明暗交替，溫度(23±3) ℃，濕度60%，自由飲水，飲食。

1.2 造模方法 模型組：腺嘌呤100 mg/kg劑量每隔2 d灌胃1次，持續(xù)1周；第2周至第6周，每周給同樣劑量的腺嘌呤1次；第2周至第6周，每隔2 d腹腔注射活性維生素D3骨化三醇1 μg/kg；第2周至第6周，模型鼠全部采用高磷飲食，含磷量為1.2%。

1.3 組織取材和血液指標(biāo)測定 各組動物眼眶取血分離血清，小心分離胸主動脈，取雙腎臟。所有組織分成兩部分，一部分置于4%的多聚甲醛中，做常規(guī)石蠟包埋、切片，供病理和免疫組化檢查，另一部分腎置于-80 ℃冰箱中備用。血清用自動生化分析儀測定血鈣、血磷、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)、尿酸(uric acid,UA)含量。

1.4 石蠟切片的制備 小鼠組織在4%多聚甲醛中固定48 h以上；乙醇梯度脫水：70%乙醇24 h，80%乙醇12 h，95%乙醇12 h，100%乙醇1 h，使石蠟滲透至組織內(nèi)部；二甲苯(透明)∶二甲苯∶乙醇(1∶1∶1)10 min，二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min；浸蠟：石蠟Ⅰ 40 min，石蠟Ⅱ 90 min；石蠟包埋：將融化的石蠟倒入包埋框，用加溫的鑷子將浸蠟的組織塊放入，控溫在56 ℃；切片：每個標(biāo)本取10張切片，每張切片厚3 μm。用0.1%多聚賴氨酸處理過的玻片貼片，烤片過夜，保存于4 ℃冰箱。

1.5 HE染色 石蠟切片置于二甲苯，脫蠟5～10 min；移入二甲苯和純乙醇(1∶1)混合液，5 min；移入100%、95%、85%、70%乙醇，各2～5 min，最后經(jīng)蒸餾水，水洗5 min后轉(zhuǎn)入染液；Harris蘇木精染5～10 min；水洗5 min；0.5%鹽酸乙醇(70%乙醇配制)分色片刻，鏡檢控制，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰，約30 s；水洗30 min，藍化；75%乙醇，洗1 min；0.5%水溶性伊紅Y乙醇染色液1 min；一次凈70%、85%、95%、100%乙醇脫水，每級分別2～3 min；二甲苯透明2次，每次約5 min；擦去切片周圍多余二甲苯，注意不要干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固。

1.6 Von kossa染色 切片脫蠟；日光下或紫外線燈下用2% 硝酸銀浸染，20～60 min；蒸餾水洗，5 min；5%硫代硫酸鈉水溶液處理，2 min；自來水洗，5 min；0.1%核固紅染液復(fù)染，1～2 min；水洗，5～10 s；常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封閉。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般狀態(tài) 60只小鼠造模，成功10只，死亡6只，成功率約17%。實驗結(jié)束時，各動物稱體質(zhì)量，模型組小鼠體質(zhì)量無明顯變化，對照組小鼠體質(zhì)量由初始平均20 g增長到平均42 g。

2.2 2組血清學(xué)指標(biāo)比較 與對照組小鼠相比較，模型組小鼠血清BUN、SCr、UA、P和Ca均有顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 HE染色 與對照組小鼠相比較，模型組小鼠腎小球萎縮，系膜細(xì)胞增多，間質(zhì)區(qū)增寬，說明小鼠腎臟結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯病變即腎衰竭(圖1)。

2.4 Von kossa染色 與對照組小鼠相比較，模型組小鼠血管壁均明顯增厚，部分小鼠可以見到明顯鈣化的發(fā)生(黑色部分)，未發(fā)生鈣化的小鼠血管，其中層可見清晰的的彈力纖維并發(fā)生變性(圖2)，說明本方法可以有效導(dǎo)致血管向鈣化病變發(fā)展。

表1 2組血清生化指標(biāo)比較

Table 1 Comparison of serum biochemical indexes between two groups

組別只數(shù)BUN(μmol/L)SCr(μmol/L)UA(μmol/L)血磷(mmol/L)血鈣(mmol/L)對照組203.63±0.30282.88±189.90415.80±127.130.85±0.260.65±0.03模型組105.87±1.59618.80±139.67536.20±51.681.24±0.170.84±0.04t6.1884.9672.8594.28813.620P0.0000.0000.0080.0000.000

3 討 論

目前CKD血管鈣化模型，鑒定標(biāo)準(zhǔn)主要是根據(jù)血管的石蠟切片Von kossa 染色或者茜素紅染色結(jié)果，Von kossa 染色有黑色沉積或茜素紅染色有紅色或紫紅色鈣結(jié)節(jié)染出都可視為模型成功[7]。本研究中，模型組小鼠表現(xiàn)明顯的腎臟形態(tài)和功能損傷，血管出現(xiàn)明顯的鈣化，說明本研究制備的小鼠慢性腎病血管鈣化模型是成功的。

CKD血管鈣化的動物模型十分有限。血管鈣化動物模型主要分為：藥物誘導(dǎo)血管鈣化(維生素D3誘導(dǎo)，華法令誘導(dǎo)，華法令和維生素D3聯(lián)合誘導(dǎo)，維生素D3和尼古丁聯(lián)合誘導(dǎo)，氯化鈣誘導(dǎo))、CKD引起的血管鈣化(維生素 D3聯(lián)合腎次全切除術(shù)，腺嘌呤喂養(yǎng)產(chǎn)生高甲狀旁腺激素血癥血管鈣化)、基因敲除引起的血管鈣化(基質(zhì) Gla 蛋白缺陷小鼠，骨保護素缺陷小鼠，載脂蛋白 E 缺陷小鼠，低密度脂蛋白受體缺陷小鼠，骨橋蛋白缺陷小鼠，胎球蛋白 A 缺陷小鼠，Klotho 基因缺陷小鼠，Smad6 基因缺陷小鼠，碳酸苷酶同功酶Ⅱ缺陷小鼠，原纖維蛋白 1 缺陷小鼠，核苷酸焦磷酸酶Ⅱ磷酸二酯酶 1 缺陷小鼠，錨蛋白缺陷小鼠)以及高脂、高膽固醇飲食喂養(yǎng)的近交系小鼠血管鈣化。

大鼠模型中，維生素D3誘導(dǎo)的血管鈣化會伴隨氣管、肺、胃、腸等臟器的廣泛鈣化，且這種鈣化模型難以模擬臨床血管鈣化的病理過程，因為機體可以調(diào)節(jié)維生素D3的攝取和代謝的穩(wěn)態(tài)，自然病程也很難誘導(dǎo)維生素D3的蓄積量達到這種誘導(dǎo)劑量。華法令誘導(dǎo)的血管鈣化呈現(xiàn)不穩(wěn)定性，與大鼠的年齡和生長狀況有關(guān)。藥物聯(lián)合誘發(fā)的血管鈣化致死率太高，并會發(fā)生多臟器的鈣化，難以模擬臨床血管鈣化的病因。

慢性腎臟病引起的血管鈣化模型較好模擬了臨床血管鈣化的進程，5/6Nx聯(lián)合維生素D3誘導(dǎo)血管鈣化的大鼠或小鼠模型成模率普遍不高，5/6Nx手術(shù)耗時且術(shù)后及后期鈣化形成過程死亡發(fā)生率高，5/6Nx手術(shù)成活率約40%，動物成模率約30%，總體成模率約15%，使用這樣的動物模型進行篩選、評價抗血管鈣化的藥物并不理想。腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型主動脈鈣化主要發(fā)生在中膜，與臨床上慢性透析患者動脈鈣化表現(xiàn)相似，且在其胃黏膜固有層和肌層有轉(zhuǎn)移性鈣化?？赡苁且驗楦邼舛认汆堰蕮p傷腎臟正常生理功能，PTH升高，血中肌酐和無機磷酸鹽水平升高，血清鈣的水平下降，但鈣磷乘積升高，最終誘發(fā)腎衰竭，伴隨鈣鹽在血管等軟組織沉積。目前尚未有報道腺嘌呤誘導(dǎo)的小鼠鈣化模型，相較大鼠而言，小鼠節(jié)約實驗成本和實驗空間，更利于應(yīng)用在模擬臨床血管鈣化機制的研究中，且本研究小鼠腺嘌呤誘導(dǎo)CKD血管鈣化方法成模率約為20%,高于上述其他模型。

基因敲除小鼠血管鈣化模型是指在小鼠中利用基因敲除技術(shù)，使血管鈣化的抑制分子的基因缺失或沉默來制備血管鈣化。這種方法排除了飲食和藥物的干擾，但其制備耗時久、成本高。盡管藥物誘導(dǎo)、基因敲除、高脂和高膽固醇喂養(yǎng)、近交系培育等方法都可引起血管鈣化，但它們在病理機制上都不適用于模擬人類CKD引起的血管鈣化。因此，從病理機制來說，大鼠CKD血管鈣化模型更適合于此方面研究。

目前常用的CKD引起血管鈣化的動物模型有2種，即腺嘌呤大鼠腎毒性模型[8]和5/6Nx大鼠腎模型[9-10]。在這2個模型中，動物受到急性腎損傷后出現(xiàn)嚴(yán)重的高磷酸鹽血癥和甲狀旁腺機能亢進，隨后發(fā)展成CKD。在這2個疾病狀態(tài)，飲食都是重要的因素。5/6Nx大鼠模型較經(jīng)典，因腎臟被切除5/6，有效腎單位減少，導(dǎo)致腎小球灌流高、濾過高、內(nèi)壓高及通透性改變，且大鼠體質(zhì)量下降嚴(yán)重，造模時間較久。腎小球壞死進程與慢性腎衰竭患者的病程相似，所發(fā)生的腎小球損傷與患者局灶節(jié)段性腎小球硬化相似，一般術(shù)后8～12周SCr、BUN升高，血鈣低血磷高，呈現(xiàn)典型的慢性腎衰竭癥狀，并伴有血管鈣化、骨密度下降等慢性腎衰竭并發(fā)癥的表現(xiàn)。但該模型有如下缺點：①血管鈣化出現(xiàn)率較低,在只存在慢性腎衰竭的情況下鈣化發(fā)生率極低，需聯(lián)合喂食高磷飲食來誘導(dǎo)高磷酸鹽血癥和血管鈣化[11]；②需通過一步法或兩步法外科手術(shù)建立模型，5/6Nx手術(shù)耗時2周，增加了麻醉意外和手術(shù)感染的概率，且病死率較高；③建模周期較長，成功誘導(dǎo)血管鈣化需耗時3個月。相比之下，腺嘌呤大鼠腎毒性模型因其簡便易行，成活率高近年來引起較多關(guān)注，它比5/6Nx大鼠模型腎病進展更快更嚴(yán)重，甲狀旁腺機能亢進，動脈鈣化，一般給予含0.75%腺嘌呤的飲食4周后出現(xiàn)CKD癥狀，表現(xiàn)為繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥，血液中PTH水平急劇升高，鈣磷代謝失調(diào)，骨重吸收增強，動脈及軟組織的鈣化形成。主動脈鈣化主要發(fā)生在中膜，與臨床上典型的慢性透析患者動脈鈣化相似，在其胃黏膜固有層和肌層有鈣化[12]?？赡芤驗楦邼舛认汆堰蕮p傷腎臟的正常生理功能，PTH水平升高，SCr和P水平升高，血鈣水平下降，但鈣磷乘積升高，最終腎衰竭，鈣鹽沉積在血管等軟組織。該模型喂食正常飲食即可，不需高磷飲食誘導(dǎo)。有趣的是，腺嘌呤腎毒性模型在低水平蛋白飲食條件下能產(chǎn)生更持續(xù)的動脈鈣化[9]。但該模型存在兩大缺點：一是由于大鼠自由進食，攝取腺嘌呤的量有較大差異，模型個體差異較大；二是該模型會引起大鼠嚴(yán)重的體質(zhì)量下降，有些大鼠在建模后體質(zhì)量幾乎下降了50%。這給藥物研究和篩選帶來很大不利。因此，Terai改良了腺嘌呤大鼠腎毒性模型[13]，給予大鼠灌胃600 mg·kg-1·d-1腺嘌呤，10 d后即造模成功，而且未見明顯體質(zhì)量下降。雖然該模型腎毒性和骨改變較明顯，但改良模型的最大缺點是血管鈣化發(fā)生率較低，只有15%左右。因此，本研究擬建立血管鈣化發(fā)生率較高的改良模型。

以上模型都是大鼠模型，國內(nèi)外尚未見腺嘌呤和5/6Nx誘導(dǎo)小鼠血管鈣化模型的報道。本研究擬探索合適劑量和方法建立小鼠模型，這將縮短實驗周期，便于實驗操作，降低經(jīng)濟成本，在藥物篩選中減少藥物用量，對新藥研究開發(fā)更有意義。

其他還有一些不常用的CKD血管鈣化模型。在小鼠身上，外科手術(shù)誘導(dǎo)的急性腎損傷引起自發(fā)鈣化，并發(fā)展為CKD，這是很難察覺的，除非伴隨有導(dǎo)致動脈粥樣硬化的基因異常，如低密度脂蛋白受體或ApoE基因的敲除[14-15]。另外，近年還報道了一個新的漸進性CKD-MBD的模型，即Cy/+大鼠[16]。正常磷飲食即自發(fā)產(chǎn)生CKD-MBD的3種病癥，其益處是疾病自發(fā)進展，CKD早期可進行處理，以便更好地了解CKD-MBD的病理生理學(xué)。酪蛋白喂養(yǎng)的動物尿磷排泄升高，血清成纖維生長因子23升高[17]，這樣可觀察CKD導(dǎo)致CKD-MBD過程的早期變化。但這些模型耗時長，需5～10個月才能完成CKD動物模型的整個過程，且動物需特殊來源，難以普及。

綜上所述，本研究所制備的小鼠CKD血管鈣化模型具有以下優(yōu)點：①建模時間短，縮短了實驗周期;②灌胃定量腺嘌呤代替自由飲食，克服模型個體差異；③建模后動物體質(zhì)量不會出現(xiàn)明顯下降；④給予維生素D顯著提高血管鈣化發(fā)生率及持續(xù)時間；⑤不需手術(shù)過程，簡便易行。因此，此模型將為臨床CKD引起的鈣磷代謝紊亂繼而誘發(fā)的心血管并發(fā)癥及腎性骨病的相關(guān)研究提供一個快速可靠的動物模型，為臨床有效新藥篩選提供可靠的實驗對象。(本文圖見封三)

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(本文編輯：許卓文)

Establishment of a mouse model of chronic renal vascular calcification

WANG Wen-wei1， TIAN Lu-lu2， XIONG Yan-wen3， CHEN Qi-jing2， PENG Wen4， YIN Pei-hao5*

(1.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicineScience，F(xiàn)udanUniversity,Shanghai200032，China； 2.DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201210，China； 3.DepartmentofTraditionChineseMedicine,PutuoDistrictLiqunHospital,Shanghai200333，China； 4.DepartmentofNephrology，PutuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062，China； 5.InterventionalCancerInstituteofChineseIntegrativeMedicine,PutuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062，China)

Objective To establish vascular calcification mouse model derived from chronic kidney disease(CKD). Methods Murine CKD was induced by oral dosing with adenine. 1,25(OH)2D3and high-phosphate diet were used to accelerate vascular calcification. Serum urea nitrogen, serum creatinine, uric acid, calcium and phosphate were measured. HE staining and Von kossa staining were used to examine the morphological changes in kidney and aorta, respectively. Results After adenine dosing combined with 1,25(OH)2D3and high-phosphate diet, significant aortic calcification was detected in about 17% animals at 6 weeks, significantly increased serum urea nitrogen, creatinine, uric acid， serum calcium and phosphate were observed and all model animals showed significant arterial wall thickening and increased medial elastic fibers. Conclusion These data suggest that mice dosed orally with adenine in combination with 1,25(OH)2D3and high-phosphate diet were able to develop severe CKD and vascular disorder. The research provide a simple and stable mice modet to study vascular calcification in chronic kindney disease.

kidney diseases; vascular calcification; disease models, animal

2016-09-12；

2016-10-28

上海市衛(wèi)生局科研課題(20124007，20134120)

王文偉(1966-)，女，上海人，復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

R692.9

A

1007-3205(2017)03-0253-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.002

實驗師，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管電生理研究。

*通訊作者。E-mail:yinpeihao1975@hotmail.com