李會(huì)玲，趙鋒，豆艷霞

分析測(cè)試

水體中葉綠素α測(cè)定方法的探究

李會(huì)玲，趙鋒，豆艷霞

（安康市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)站，陜西安康725000）

在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，葉綠素α的測(cè)定方法主要參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）中的分光光度法，該方法存在測(cè)定結(jié)果誤差大的問(wèn)題，同時(shí)暴露在高濃度丙酮環(huán)境中，對(duì)分析者的健康有損害影響。在原始方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了免研磨法提取葉綠素α，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法對(duì)葉綠素α提取率的提高率可達(dá)53.4%～62.8%，有效避免了研磨過(guò)程造成的葉綠素α損失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著提取時(shí)間的增加，葉綠素α的測(cè)定值增加，且提取8 h后增長(zhǎng)的趨勢(shì)開(kāi)始趨于穩(wěn)定。

葉綠素α；免研磨法提??；提取率

葉綠素α是植物光合作用中的重要光合色素。通過(guò)測(cè)定浮游植物葉綠素α，可掌握水體的初級(jí)生產(chǎn)力情況[1]。在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，可將葉綠素含量作為湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo)之一[2-3]。美、日等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)葉綠素α的測(cè)定已列入了標(biāo)準(zhǔn)分析方法，其中的測(cè)定方法包含了分光光度法，熒光法和高效液相色譜法[4]。目前，我國(guó)對(duì)葉綠素α的測(cè)定尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，分析方法主要參考《環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》、《湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》和《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》中的分光光度法[5]。

目前，水質(zhì)監(jiān)測(cè)工作中常用的方法是參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版），但我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，研磨等多次轉(zhuǎn)移操作會(huì)大大降低葉綠素α的提取率，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果誤差，同時(shí)丙酮是一種極易揮發(fā)的有毒的有機(jī)溶劑，研磨過(guò)程中接觸90%的高濃度丙酮，對(duì)人體健康造成很大的損害。鑒于以上問(wèn)題，本文對(duì)第四版書中葉綠素α測(cè)定方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化改進(jìn)，以期提高葉綠素α的提取率和穩(wěn)定性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集

在發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化的某庫(kù)區(qū)（1#），庫(kù)區(qū)上游未受污染段（2#），庫(kù)區(qū)下游段（3#）3個(gè)采樣點(diǎn)分別采集水樣500 mL，低溫（0℃～4℃）避光保存，次日測(cè)定。

1.2 水樣的處理

水樣的濃縮：裝好抽濾裝置，在抽濾器上裝好醋酸纖維濾膜，過(guò)濾前在濾膜上加入少量的碳酸鎂懸浮液（碳酸鎂懸浮液成弱堿性，可以保護(hù)葉綠素防止酸化引起色素溶解），水樣抽完后，繼續(xù)抽1～2 min；提取：抽濾完成后，將帶有樣品的濾膜迅速對(duì)折成條狀放入10 mL的玻璃比色管中，加入10 mL的90%丙酮后立即蓋好蓋子，用力上下振蕩1 min，然后在黑暗中靜置，提取時(shí)間分別設(shè)定為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h（期間0．5 h震蕩一次，以保證提取完全）；離心：靜置提取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后將試樣倒入10 mL的離心管中，用離心機(jī)（3000～4000 r/min）離心10 min。將上清液倒入10 mL容量瓶中，用丙酮定容，搖勻。

1.3 測(cè)定

將上清液倒入1 cm光程的比色皿中，放入紫外分光光度計(jì)中比色，在分別放置0 min、5 min、10 min、20 min、30 min后，讀取750 nm663 nm645 nm630 nm波長(zhǎng)的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測(cè)定，對(duì)樣品吸光度進(jìn)行校正。

1.4 對(duì)照試驗(yàn)

在進(jìn)行上述改進(jìn)操作的同時(shí)，按照原始研磨測(cè)定方法（按《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》中的操作），設(shè)置了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

從三個(gè)點(diǎn)位（1#富營(yíng)養(yǎng)化某庫(kù)區(qū)，2#未受污染的上游段，3#污染的下游段）采集的水樣，按照上述材料與方法部分的操作，在提取步驟，靜置提取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后分別取定容后的上清液測(cè)定吸光度，得到的提取時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，同一提取時(shí)間條件下，富營(yíng)養(yǎng)化庫(kù)區(qū)中葉綠素α值最高，達(dá)2.7～12.9 mg/L，高于上游未受污染段水體的1.85～2.00倍，污染區(qū)的下游段葉綠素α為1.53～7.23 mg/L。從圖1還可以看出：隨著靜置提取時(shí)間的增大，葉綠素α的測(cè)定值增加，表明葉綠素α的提取率增加，在靜置提取約8 h后增長(zhǎng)的趨勢(shì)開(kāi)始趨于穩(wěn)定。因此，為了保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確，要控制好提取靜置時(shí)間，以充分提取出水體中的葉綠素α。 2.2本實(shí)驗(yàn)方法與原始方法測(cè)定值的對(duì)比

圖2為本實(shí)驗(yàn)中的改進(jìn)方法中靜置提取8 h后的測(cè)定值，與原始的操作方法（低溫干燥8 h后再研磨提?。┑臏y(cè)定值的比較。由圖2可知，在該方法的操作條件下，同一水樣葉綠素α的測(cè)定值增加了53.4%～62.8%，可見(jiàn)，該方法大大提高了葉綠素α的提取率，避免了研磨過(guò)程造成的損失。

圖1 提取時(shí)間對(duì)測(cè)定值的影響

圖2 兩種測(cè)定方法的比較

2.3 測(cè)定時(shí)間對(duì)測(cè)定值的影響

按照材料與方法中的操作方法，樣品離心提取后，分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min時(shí)測(cè)定其吸光度，測(cè)定值如圖3所示。由圖3可知，離心后的提取液放置的時(shí)間會(huì)對(duì)測(cè)定值造成影響：5 min以內(nèi)影響不會(huì)太大；15 min以內(nèi)有一定的影響；25 min以后影響比較大?？赡苁欠胖脮r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，引起色素分解造成的。因此，在測(cè)定離心提取液時(shí)要及時(shí)，防止因放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成測(cè)量值偏低。

圖3 測(cè)定時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

3 結(jié)論

（1）如果不是馬上測(cè)量，水樣需進(jìn)行預(yù)處理，采集的水樣加入碳酸鎂懸濁液，（每升水樣加1%碳酸鎂懸濁液1 mL），以防止酸化引起色素溶解。

（2）為了使色素得到充分的提取，要對(duì)提取液進(jìn)行充分多次振蕩，要把提取時(shí)間控制在8～10 h之內(nèi)，這樣才能保證較高的提取效率，但不能無(wú)限制地延長(zhǎng)提取時(shí)間，以防止色素分解。

（3）本實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)葉綠素α的測(cè)定值提高了53.4%～62.8%，有效避免了研磨過(guò)程造成的葉綠素α損失。

（4）在測(cè)量吸光度時(shí)，應(yīng)在5 min內(nèi)迅速測(cè)量完畢，以防止色素分解，引起結(jié)果偏低。

[1]吳姝英.葉綠素α測(cè)定方法之比較[J].福建水產(chǎn)，2011，33（4）:61-63.

[2]國(guó)家環(huán)保局.水生生物監(jiān)測(cè)手冊(cè)[M].南京：東南大學(xué)出版社，1993:177-178.

[3]李勝生，董元華，劉云，等.微囊藻中提取方法的優(yōu)化[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2008，20（4）:43-45.

[4]劉樞.水體中葉綠素a測(cè)定方法探討[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2012，32（10）:9，36.

[5]金相燦，屠清瑛.湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范[M].北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，1990:286-302.

[6]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].第4版.北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002:670-672.

An Exploration for the Determination of Chlorophyll α in Water

LI Hui-ling，ZHAO Feng，DOU Yan-xia
（Environmental Monitoring Station of Ankang，Ankang，Shaanxi 725000，China）

The determination of chlorophyll α according to The Water and Wastewater Monitoring Analysis Method（the fourth edition）was used widely in environmental monitoring，there existed a biggest disadvantage of determinate error，another disadvantage is that it’s harmful to analysts who exposed to an analysis environment with high concentration of acetone.The method used in this paper was preferable due to avoiding grinding where a greater loss come about.The results showed that compared with the extraction efficiency under traditional method above，the extraction efficiency under this method increased by 53.4%～62.8%.The results also revealed that measured value increased with the growth of extraction time，and was tending towards stability after 8 hours.

chlorophyll α；extraction avoided grinding；extraction efficiency

1006-4184（2017）3-00052-03

2016-05-25

李會(huì)玲（1973-），女，陜西安康人，本科，工程師，研究方向：環(huán)境監(jiān)測(cè)與分析。E-mail:846888501@qq.com。