鄭青青 沈江 沈婷 李秋實(shí) 洪朝陽(yáng) 李文偉

脂肪干細(xì)胞對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究

鄭青青 沈江 沈婷 李秋實(shí) 洪朝陽(yáng) 李文偉

目的 探討在體外共培養(yǎng)中，兔脂肪干細(xì)胞（ADSCs）對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞（CSCs）的影響及其作用機(jī)制，為角膜基質(zhì)損傷治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 取新西蘭大白兔腹股溝皮下脂肪組織，用I型膠原酶消化分離出ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞至3代，評(píng)價(jià)其多向分化能力。另取新西蘭大白兔角膜基質(zhì)層組織，用II型膠原酶消化分離出CSCs，傳代至2代后備用。將CSCs及ADSCs（實(shí)驗(yàn)組）共培養(yǎng)3d后，與單純CSCs（對(duì)照組）采用CCK-8法檢測(cè)CSCs增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞金屬蛋白酶（MMPs）、膠原相關(guān)蛋白水平，評(píng)估在體外共培養(yǎng)中ADSCs對(duì)CSCs的影響。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組CSCs數(shù)量顯著增高（P＜0．05），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組CSCs細(xì)胞凋亡減少，Western blot法檢測(cè)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組MMPs表達(dá)水平降低，膠原相關(guān)蛋白表達(dá)水平增加。結(jié)論ADSCs不僅可以促進(jìn)CSCs增殖并抑制其凋亡，還可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在角膜基質(zhì)損傷治療中具有較好的應(yīng)用前景。

脂肪干細(xì)胞 角膜基質(zhì)細(xì)胞 損傷 增殖 基質(zhì)金屬蛋白酶

脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一類存在于脂肪組織基質(zhì)中、具有極強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，具有來源豐富、取材方便及對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)和細(xì)胞替代治療[1-4]。ADSCs能夠刺激干細(xì)胞微環(huán)境來分化產(chǎn)生所需的干細(xì)胞，且具有高度增殖的特性，可以分化成脂肪、骨骼、軟骨、神經(jīng)元和其他細(xì)胞譜[5-7]。據(jù)報(bào)道，目前我國(guó)角膜盲患者接近400萬人，全國(guó)每年新增病例達(dá)45萬。角膜移植術(shù)是目前角膜盲唯一可靠、有效的治療手段。為了克服角膜來源匱乏和術(shù)后免疫排斥的困難[8]，以細(xì)胞為基礎(chǔ)治療角膜損傷是目前一種有前景的治療方法。Nishida等[9]最早嘗試了應(yīng)用口腔黏膜上皮細(xì)胞取代角膜緣干細(xì)胞治療眼表疾病取得了很好的臨床效果。然而臨床上很多嚴(yán)重的眼表疾病都是引起角膜基質(zhì)層損傷而最終致盲，給患者造成了巨大的痛苦[10-11]。因此，臨床上急需具有正常生理功能的組織工程角膜。本實(shí)驗(yàn)通過體外共培養(yǎng)，觀察兔ADSCs對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞（corneal stromal cells，CSCs）的影響及其作用機(jī)制，為角膜基質(zhì)損傷治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔（無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（南京維森特生物技術(shù)有限公司）；膠原酶（美國(guó)Invitrogen公司）；茜素紅檢測(cè)試劑盒（西安赫特生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；Annexin V-FITC/PI試劑盒（中國(guó)貝博公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)thermo公司）；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液（美國(guó)Solarbio公司）；Goat Anti-Rabbit（二抗，WB）和Alexa Fluor 488 conjugated Affinipure Goat（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；β-actin（一抗，WB）（美國(guó)Abcam公司）；本實(shí)驗(yàn)其余所有抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；倒置拍照顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克頓-迪金森公司）；離心機(jī)（湖南湘儀公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔ADSCs的分離培養(yǎng)[12]無菌狀態(tài)下切取兔腹股溝皮下脂肪組織，用無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（含雙抗）反復(fù)沖洗2～3次，再用眼科剪和眼科鑷除去脂肪組織膜和血管。PBS緩沖液沖洗3次，脂肪球置于平皿內(nèi)，眼科剪刀剪碎至糊狀，移入25cm2培養(yǎng)瓶，加入2倍體積的 0.1%Ⅰ型膠原酶。在37.5℃預(yù)熱的振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，190r/min消化30～35min。消化內(nèi)容物移入離心管，用等量的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1 500r/min離心10min后棄去上清液。沉淀物用14ml含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重新懸浮，接種于2個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換一次培養(yǎng)基，以后1次/3d換液，7～9d后細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 兔ADSCs的多向分化潛能 選取第3代兔ADSCs，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種到置有蓋玻片的6孔板中，37℃，孵育24h。待細(xì)胞貼壁后，分別加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有10%FBS、10-6M地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和0.02mM吲哚美辛）、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有10%FBS、10-6M地塞米松、10-2M β-甘油磷酸、50μg/ml抗壞血酸的高糖-DMEM培養(yǎng)基），并設(shè)立加入普通培養(yǎng)基的孔為空白組，2次/周換液，分別于培養(yǎng)2周和3周后進(jìn)行油紅O及茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 兔CSCs的分離培養(yǎng) 無菌條件下摘取兔眼球，自角膜緣內(nèi)側(cè)1mm剪下全層組織片，D-Hank液沖洗2遍，顯微鏡下撕去角膜上皮層、前彈力層、后彈力層及內(nèi)皮層，將獲得的基質(zhì)片剪成碎塊，碎塊應(yīng)盡量小，加入1.5%Ⅱ型膠原酶消化液，37℃振蕩消化45min，見僅有少許組織塊剩余時(shí)，加入基質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化，1 000r/min離心5min×2次，制成細(xì)胞懸液，采用20%FBS+DMEM/F12將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后換液，以后1次/2d換液。培養(yǎng)1周后待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后，胰蛋白酶消化，1 000r/min離心7min，棄上清液，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時(shí)將胎牛血清濃度改為10%。

1.3.4 觀察兔CSCs及細(xì)胞鑒定 選取第2代細(xì)胞，制備密度為1×104/ml的細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種，分別于培養(yǎng)3、5、7、9d觀察細(xì)胞形態(tài)，顯微鏡下拍照。采用免疫熒光方法檢測(cè)CSCs中波形蛋白及CK12蛋白表達(dá)情況。

1.3.5 兔ADSCs與兔CSCs體外間接共培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)組（CSCs及ADSCs共培養(yǎng)）采用Transwell雙層非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)，將兔ADSCs接種在下室內(nèi)，兔CSCs接種于上室內(nèi)，上下層培養(yǎng)液以0.4μm聚碳酸酯膜相隔，進(jìn)行體外共培養(yǎng)3d。將兔CSCs單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照組（單純CSCs）。

1.3.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將兩組細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔100μl，培養(yǎng)時(shí)間0、24、48、72、96、120h后，用CCK-8孵育2h左右，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450nm下吸光度，并計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 兩組細(xì)胞分別用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞終止消化，1 500r/min離心5min，棄去上清液，收集細(xì)胞。用PBS重懸并洗滌細(xì)胞后，加入300μl含Ca2+的緩沖液懸浮細(xì)胞，并加入5μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15min，再加入10μl的PI染色，輕輕混勻細(xì)胞，于避光條件下室溫孵育10min，最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Cell Quest軟件分析。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞金屬蛋白酶（MMPs）、膠原相關(guān)蛋白水平 將兩組細(xì)胞分別加入100μl的RIPA裂解液，放入4℃冰箱，10min，充分裂解后收集裂解液，并置于離心機(jī)，12 000r/min離心5min，取上清液待用。配制SDS-PAGE分離膠，分別取30μg蛋白量的細(xì)胞總蛋白樣品及maker加樣，將預(yù)先設(shè)計(jì)處理好的兩組樣本按順序加入上樣孔，電泳，轉(zhuǎn)膜后，將膜放入含5%脫脂奶粉封閉液，搖床振蕩1.5h。封閉結(jié)束后將膜放入含一抗稀釋液（β-actin、ALDH、MMP1、MMP2、MMP9稀釋比為1∶500，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原稀釋比為1∶400）的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。第2天取出，室溫振蕩30min，吸棄一抗，TBST洗10min×3次，再用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗（二抗稀釋比為1∶500），室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2h，然后用 TBST洗膜。最后將膜置于配置好的化學(xué)發(fā)光試劑液中顯色，并使用FluorChen E型凝膠成像儀掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 兔ADSCs的形態(tài)觀察及分化潛能 兔ADSCs培養(yǎng)24h后可見少量散在的貼壁細(xì)胞，以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，部分呈三角形或不規(guī)則形。3d后可見較多的梭形貼壁細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，后增生為形態(tài)相對(duì)均一穩(wěn)定的成纖維樣梭形細(xì)胞，7d后細(xì)胞融合至80%～90%。第3代ADSCs為長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一，增殖速度較快。ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，可見細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)闄E圓形，經(jīng)油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)大量紅色脂滴形成（圖1，見插頁(yè)）。ADSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，可見細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，經(jīng)茜素紅染色可見細(xì)胞周圍基質(zhì)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積（圖2，見插頁(yè)）。

圖1 兔CSCs油紅O染色所見（a：空白組；b：成脂誘導(dǎo)組）

圖2 兔CSCs茜素紅染色（a：空白組；b：成骨誘導(dǎo)組）

2.2 兔CSCs的形態(tài)觀察及鑒定 體外培養(yǎng)中兔CSCs經(jīng)培養(yǎng)3d后，可見少量散在的貼壁細(xì)胞，多呈紡錘形，且生長(zhǎng)較快，一般7～9d融合（圖3，見插頁(yè)），這表明角膜基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞活性高。細(xì)胞鑒定結(jié)果：兔CSCs胞質(zhì)中特異性表達(dá)的波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率＞95%，CK12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率＜5%（圖4，見插頁(yè)），這表明CSCs分離后純度較高。

圖3 兔CSCs形態(tài)特點(diǎn)

圖4 兔CSCs免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 從圖5可見，兩組細(xì)胞均隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞增殖明顯。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)顯著增高（P＜0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)48h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)極其顯著增高（P＜0.01）；細(xì)胞培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)極其顯著增高（P＜0.01）；細(xì)胞培養(yǎng)96h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)顯著增高（P＜0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)120h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)顯著增高（P＜0.05）。這表明ADSCs可促進(jìn)CSCs的增殖。

圖5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組兔ADSCs對(duì)兔CSCs的凋亡有抑制作用。實(shí)驗(yàn)組通過共培養(yǎng)3d后，采用Annexin V-FITC試劑盒定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示對(duì)照組總凋亡率為7.81%，實(shí)驗(yàn)組總凋亡率為4.86%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較?。▓D6，見插頁(yè)）。這表明ADSCs抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。

圖6 兩組細(xì)胞凋亡情況

2.5 Western blot法檢測(cè)MMPs、膠原相關(guān)蛋白水平 實(shí)驗(yàn)組ALDH、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原表達(dá)均較對(duì)照組上調(diào)，MMP1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)均較對(duì)照組下調(diào)（圖7）。這表明ADSCs有效抑制MMPs表達(dá)，促進(jìn)膠原相關(guān)蛋白表達(dá)。

3 討論

臨床上因角膜疾病致盲的患者比例較高，同種異體角膜移植手術(shù)是目前治療該類疾病的主要方式。但由于供體匱乏，加上術(shù)后免疫排斥發(fā)生率高，限制了其應(yīng)用。因此，尋求有效的治療角膜損傷的方法成為目前迫切需要解決的問題。利用種子細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化或共培養(yǎng)為治療此類疾病提供了一個(gè)新的思路。自2001年Zuk等[1]發(fā)現(xiàn)ADSCs以來，ADSCs因其具有取材方便、獲取率高、對(duì)供區(qū)組織損傷小、體外擴(kuò)增迅速以及多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中[4]。在分離培養(yǎng)兔ADSCs中，筆者取兔腹股溝區(qū)皮下脂肪組織，在取材時(shí)剔除血管及筋膜并用PBS反復(fù)沖洗，利用貼壁篩選法去除血細(xì)胞成分并分離出ADSCs。分離培養(yǎng)的ADSCs具有很好的增殖能力，與成脂及成骨誘導(dǎo)液作用后可向脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞分化，油紅O及茜素紅染色進(jìn)一步證實(shí)了其多向分化的能力。

有研究表明，ADSCs在治療多種再生疾病方面有著重要作用[13-14]。最新一項(xiàng)研究表明ADSCs在一定誘導(dǎo)條件下，可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞，在血管再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。本研究主要觀察兔ADSCs對(duì)CSCs的可塑性。在兔ADSCs與兔CSCs共培養(yǎng)中，CSCs的形態(tài)上未發(fā)生明顯改變，在間接共培養(yǎng)72h后，通過CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兔ADSCs顯著促進(jìn)兔CSCs增殖，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兔ADSCs能抑制CSCs凋亡。這與Arnalich-Montiel等[16]研究發(fā)現(xiàn)的在兔角膜基質(zhì)缺損處注射人ADSCs懸液，ADSCs能存活在兔角膜基質(zhì)中12周以上并進(jìn)行了基質(zhì)結(jié)構(gòu)的重建相類似。

圖7 兩組細(xì)胞MMPs、膠原相關(guān)蛋白表達(dá)情況

1962年Gross首次發(fā)現(xiàn)MMPs，它是一類重要的蛋白酶，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中起關(guān)鍵作用。在已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的MMPs家族中共有五大類，其中第一類為膠原酶（包括MMP1），他們的主要水解底物是纖維類膠原，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原；第二類為明膠酶（包括MMP2、MMP9），他們的主要水解底物是變性膠原及基膜的主要成分Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原等；第三類為基質(zhì)水解酶類（MMP3和MMP10），水解底物比較廣泛，如Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原、明膠、蛋白聚糖以及糖蛋白等；第四類及第五類分別為膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)溶解酶[17]。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組MMP1、MMP2、MMP3蛋白表達(dá)較對(duì)照組下降，而Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原表達(dá)均上調(diào)，這表明ADSCs有效抑制MMPs表達(dá)，促進(jìn)膠原相關(guān)蛋白表達(dá)。角膜主要由角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層及內(nèi)皮細(xì)胞層組成，其中基質(zhì)層占了90%。CSCs靜息狀態(tài)下呈紡錘形，且CD14及ALDH表達(dá)陽(yáng)性[18]。膠原纖維特定排序及ALDH的均勻分布維持了角膜的透明性[19]，有研究發(fā)現(xiàn)外傷后角膜透明度的減少與基質(zhì)層ALDH表達(dá)減少相關(guān)[20]。本研究實(shí)驗(yàn)組ALDH蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，提示兔ADSCs在維持兔角膜基質(zhì)層透明度可能有一定作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)兔ADSCs可以促進(jìn)CSCs增殖、抑制其凋亡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在角膜基質(zhì)損傷治療中具有較好的應(yīng)用前景，這為后期角膜基質(zhì)損傷治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供一定依據(jù)。

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Effect of rabbit adipose-derived stem cell on proliferation and apoptosis of corneal stromal cells

Objective To investigate the effects of rabbit adipose-derived stem cells(ADSCs)on proliferation and apoptosis of rabbit corneal stromal cells(CSCs)．MethodsADSCs were isolated from subcutaneous adipose tissue in groin area of New Zealand white rabbit with the method of collagenase type I digestion．The isolated ADSCs were cultured and passed to 3 generation and its differentiation ability was evaluated．CSCs were obtained from the corneas of New Zealand rabbits with the method of collagenase II digestion．After initial expansion,the CSCs were cultured up to passage 2 and then prepared for experiment．The CSCs were cultured alone(control group)or co-cultured with ADSCs(indirect co-culture group)．After incubation for 72 h the proliferative capacity of CSCs was evaluated by CCK-8 assay,apoptosis of CSCs was determined by flow cytometry, the expression of matrix metalloproteinases(MMPs)and collagens was detected by Western blot,and the invasion activity of corneal stromal cells was also examined in vitro． Results Compared with the control group,ADSCs significantly promoted proliferation and invasion of CSCs in indirect co-culture group(P＜0．05)．The group with ADSCs showed low percentage of apoptotic cells．CSCs secreted lower levels of MMPs and higher levels of collagens in indirect co-culture group． Conclusion ADSCs can promote plasticity and EMC synthesis of corneal stromal cells,and suppress the apoptosis at the same time．It suggests that application of ADSCs may be a promising approach for corneal injury therapy．

Adipose-derived stem cells Corneal stromal cells Injury Proliferation Matrix metalloproteinases

2016-09-08）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2016-1361

浙江省科技廳重大專項(xiàng)（2013C03048-1）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院、杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院眼科（鄭青青、沈婷）；溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院（沈江、李秋實(shí)、洪朝陽(yáng)）；浙江省立同德醫(yī)院眼科（李文偉）

李文偉，E-mail：wenwei60306@163.com