許 鵬，李忝珍，張淑靜，劉 啟，王永宏，張 興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊凌 712100)

嗜線蟲致病桿菌YL001抑菌活性成分及其產(chǎn)量影響因素的研究

許 鵬，李忝珍，張淑靜，劉 啟，王永宏，張 興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊凌 712100)

采用硅膠柱層析等分離方法，結(jié)合MS與NMR技術(shù)，對(duì)嗜線蟲致病桿菌YL001發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性成分進(jìn)行分離鑒定；采用微量稀釋法對(duì)Nematophin的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定；利用HLPC分析不同因素對(duì)Nematophin產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，分離得到主要抑菌活性物質(zhì) Nematophin，并鑒定其結(jié)構(gòu)為3-吲哚乙基(3′-甲基-2′-酮)戊酰胺，其對(duì)革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌活性；不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物中Nematophin的產(chǎn)量不同，其中YL001菌株的產(chǎn)量最高，為115.23 μg/mL；Nematophin產(chǎn)量在初始pH 4.5～8.5逐漸升高，初始pH 8.5時(shí)最高，為155.08 μg/mL。發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下Nematophin的產(chǎn)量高于搖瓶，且在初始pH 8.5時(shí)達(dá)到最高，為206.97 μg/mL。主要抑菌活性物質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道的 Nematophin相同，昆蟲病原線蟲共生菌次生代謝物的產(chǎn)生與菌種、菌株及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。

嗜線蟲致病桿菌；分離；抑菌活性；Nematophin

昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌是寄生于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，包括致病桿菌(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌(Photorhabdus)屬，分別與斯氏線蟲(Steinernema)和異小桿線蟲(Heterorhabditis)共生，屬腸桿菌科(Enteobacteriaceae)[1]，存在于侵染期線蟲腸道內(nèi)，在昆蟲血腔內(nèi)繁殖，產(chǎn)生毒素并分解昆蟲的營養(yǎng)物質(zhì)，使其患敗血癥死亡[2-3]。共生菌能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物不僅具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的生物活性[4]。目前已從致病桿菌(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌(Photorhabdus)中分離鑒定出40多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上有廣泛的生物活性，如抗細(xì)菌和真菌、殺蟲、殺線蟲、抗?jié)?、抗腫瘤和抗病毒[4-6]作用。線蟲共生菌次生代謝物的產(chǎn)生與菌種、菌株及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同種致病桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較大差異；同一菌株在不同培養(yǎng)條件下的代謝也有一定差異[5-10]。培養(yǎng)基供給共生菌生長、繁殖、代謝和合成抑菌物質(zhì)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，它的成分和組分含量對(duì)共生菌的生長及抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生等均有較大影響；不同共生菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求各不相同，同一菌種在不同生長階段對(duì)營養(yǎng)的需求也有一定差異。另外，發(fā)酵條件也是影響發(fā)酵過程中各種化學(xué)及生物學(xué)反應(yīng)的環(huán)境因素，主要包括pH、發(fā)酵時(shí)間、種齡、接種量、通氣和溫度等[11]。發(fā)酵條件不同產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物同樣存在差異。

嗜線蟲致病桿菌YL001(XenorhabdusnematophilaYL001)是西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究中心分離得到的一株對(duì)植物病原菌有較強(qiáng)抑制作用的昆蟲病原線蟲共生菌[12]，前期研究[13]發(fā)現(xiàn)YL001菌株發(fā)酵上清液乙酸乙酯粗提物對(duì)多種病原菌具有較好的抑制效果，隨著初始pH的升高，其發(fā)酵液和乙酸乙酯提取物的抑菌活性也逐步提高，初始pH可以顯著影響X.nematophilaYL001的抑菌活性及代謝，堿性條件更有利于活性物質(zhì)的產(chǎn)生[14]。因此，為明確不同酸堿條件下YL001菌株抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的差異，本文對(duì)該菌株的發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物中主要抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離，通過波譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行不同菌株和不同培養(yǎng)條件下Nematophin的HPLC定量分析，研究結(jié)果為該菌的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株 嗜線蟲致病桿菌XenorhabdusnematophilaYL001(簡稱YL001)由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供；嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) AN6、ALL、A24(簡稱AN6、ALL、A24)和伯氏致病桿菌(Xenorhabdusbovienii) X-7(簡稱X-7)由廣東省昆蟲研究所提供。

1.1.2 供試病原菌 大腸桿菌(Escherichiacoli)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白菜軟腐病菌(Erwiniacarotorora)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基[15]NBTA：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，營養(yǎng)瓊脂 15 g/L，溴麝香百里酚蘭 0.025 g/L，氯化三苯基四氮唑 0.04 g/L，pH7.0。

種子培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基TSB：胰蛋白胨17 g/L，大豆胨3 g/L，NaCl 5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，pH 7.0。

病原細(xì)菌培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，營養(yǎng)瓊脂15 g/L，pH 7.0。

各處理發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)，其余培養(yǎng)基pH 7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 種子制備：挑取種管保存的共生菌單菌落于LB培養(yǎng)基，在28 ℃、180 r/min活化24 h后劃線于NBTA平板，25 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的顏色變化，區(qū)分初生型和次生型共生菌。菌落為藍(lán)色，周圍培養(yǎng)基中的染料被吸收變?yōu)辄S色的為初生型；菌落為紅色，周圍培養(yǎng)基中染料不被吸收而保持藍(lán)色的為次生型。用接種環(huán)挑取初生型菌，接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為2.00，作為種子。

搖瓶發(fā)酵：按9%的接種量將種子接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，在搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)。

發(fā)酵罐發(fā)酵：使用鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司生產(chǎn)的GUJS-7B型5 L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵罐容積5 L，2層6平直葉攪拌器，3擋板。裝料系數(shù)0.75，接種量9%，發(fā)酵溫度28 ℃，通氣量2.5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵過程中流加泡敵消泡。

1.2.2 乙酸乙酯粗提物的制備 取低溫保存共生菌發(fā)酵液，調(diào)pH除去蛋白后9 000 r/min、4 ℃離心30 min，發(fā)酵上清液用乙酸乙酯萃取4次，萃取液通過無水硫酸鈉柱后濃縮蒸干，備用，干物質(zhì)量濃度為625 mg/L。

1.2.3 柱層析分離 采用柱層析分離方法對(duì)乙酸乙酯粗提物進(jìn)行分離，以枯草芽孢桿菌(B.subtilis)作為指示菌，利用瓊脂擴(kuò)散法[12-13]進(jìn)行抑菌活性追蹤。

1.2.4 波譜測(cè)定 質(zhì)譜(MS)用電子轟擊質(zhì)譜(EI-MS)測(cè)定，核磁結(jié)構(gòu)測(cè)定用Bruker-ADVANCE III500核磁共振儀，紅外光譜(IR)用Shimadzu IR-外光譜儀測(cè)定，高效液相色譜儀(996，Waters公司)Thermo 反向C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為[V(乙腈)∶V(水)]= 65∶35(水中含φ=0.1%甲酸)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm。

1.2.5 抑菌活性物質(zhì)的生物活性測(cè)定 采用瓊脂稀釋法[16]測(cè)定分離所得化合物Nematophin對(duì)細(xì)菌的最小抑制質(zhì)量濃度(MIC)。

1.2.6 Nematophin HPLC定量分析 各處理干樣分別溶于1 mL甲醇至4 ℃冰箱，備用。每個(gè)處理3次重復(fù)。HPLC定量分析采用外標(biāo)法，液相色譜儀(600，Waters公司)Thermo 反向C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0～2 min為10%乙腈，2～20 min為10%～40%乙腈，20～40 min為40%～100%乙腈，40～45 min為100%～10%乙腈，45～55 min為10%乙腈；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

以不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品Nematophin建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定各樣品中Nematophin的產(chǎn)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 作圖采用Excel 2007及Empower軟件，方差分析采用SPSS 22.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性物質(zhì)的提取、分離和純化

將乙酸乙酯粗提物硅膠柱層析，分別用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷進(jìn)行洗脫，得到3個(gè)組分，采用活性追蹤法，對(duì)有活性的三氯甲烷洗脫組分進(jìn)行進(jìn)一步柱層析分離，得到抑菌活性物質(zhì)純品；液相檢測(cè)其純度為99.6%，如圖1所示。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定及理化性質(zhì)

Electron impact MS質(zhì)譜顯示，相對(duì)分子質(zhì)量為272.04，結(jié)合NMR信息(表1)及紅外光譜結(jié)果確定分子式為C16H20N2O2，與已報(bào)道主要抑菌化合物Nematophin[16]結(jié)構(gòu)一致。結(jié)構(gòu)如圖2所示，Nematophin為白色晶體，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮和甲醇，微溶解于石油醚，不溶于水。在中性和堿性條件下穩(wěn)定。

圖1 Nematophin液相圖Fig.1 HPLC result of Nematophin

位置編號(hào)Positionno氫譜1H-NMR碳譜13C-NMRNH8.03(lH,bs)1-NH7.11(1H,bd,J=3.0Hz)27.07(1H,bd,J=3.0Hz)112.33112.647.66(1H,dd,J=9.8Hz,0.75Hz)118.757.27(1H,td,J=10.1Hz,1.5Hz)122.067.18(1H,td,J=9.9Hz,1.3Hz)119.677.44(1H,d,J=10.0Hz)111.38127.29136.5103.07(2H,t,J=5.1Hz)25.5113.70(2H,q,J=5.0Hz)39.61’202.42’160.13’3.55(1H,sext,J=4.9Hz)40.44’1.79(1H,m)25.21.46(1H,m)5’11.53’-CH315.2

2.3 Nematophin的抑菌活性測(cè)定

由表2可知，Nematophin對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌具有較高的抑菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌活性較差；其中對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用，其MIC為2.5 μg/mL；對(duì)獼猴桃潰瘍病菌及大腸桿菌表現(xiàn)出較低的抑制活性。

圖2 Nematophin結(jié)構(gòu)式Fig.2 Sructure of Nematophin

供試病原細(xì)菌Pathogenicbacterium最小抑制質(zhì)量濃度/(μg/mL)MIC枯草芽孢桿菌 Bacillussubtilis12.5蠟狀芽孢桿菌 Bacilluscereus12.5金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus2.5白菜軟腐病菌 Erwiniacarotorora25水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae25獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.actinidae>100大腸桿菌 Escherichiacoli>100

2.4 致病桿菌不同菌種及菌株中Nematophin 的HPLC定量分析

由表3可知，不同菌種及菌株間Nematophin的產(chǎn)量存在較大差異，其中伯氏致病桿菌X.bovieniiX-7不產(chǎn)生Nematophin；在X.nernatophila的各菌株中，Nematophin 的產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸升高。其中，YL001菌株中Nematophin的產(chǎn)量最高，A24菌株中Nematophin的產(chǎn)量最低。

表3 致病桿菌不同菌種及菌株中Nematophin 的產(chǎn)量Table 3 Nematophin in different species and strains of Xenorhabdus μg/mL

注：數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值，采用Duncan’s，同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母表示差異顯著(P<0.01)，同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note: Data is the average of 3 duplications, and different capital and small letters followed after data in each column mean significant difference atP<0.01 andP<0.05,respectively.The same as below.

2.5 不同初始pH條件下YL001菌株發(fā)酵產(chǎn)物中Nematophin 的HPLC定量分析

2.5.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 由圖3可知，Nematophin產(chǎn)量隨初始pH的升高(4.5～8.5)呈升高趨勢(shì)，pH為8.5時(shí)達(dá)到最高，為155.08 μg/mL ；pH為9.5時(shí)Nematophin的產(chǎn)量突然降低，說明中性及偏堿性條件下更有利于Nematophin的產(chǎn)生。

2.5.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 由表4可知，Nematophin產(chǎn)量隨初始pH的升高(5.5～8.5)呈升高趨勢(shì)，在同一pH條件下，Nematophin產(chǎn)量隨時(shí)間呈升高趨勢(shì)，在初始pH為8.5時(shí)達(dá)到最高(206.97 μg/mL)，與搖瓶發(fā)酵時(shí)不同初始pH條件下YL001菌株中Nematophin產(chǎn)量變化的結(jié)果相似，但明顯高于搖瓶發(fā)酵初始pH為8.5時(shí)的產(chǎn)量(155.08 μg/mL)。

圖3 不同初始pH條件下Xenorhabdus nematophila YL001中Nematophin的產(chǎn)量Fig.3 Nematophin of Xenorhabdus nematophila YL001 in different initial pH

表4 不同初始pH條件下XenorhabdusnematophilaYL001中Nematophin 的產(chǎn)量
Table 4 Nematophin ofXenorhabdusnematophilaYL001 in different initial pH μg/mL

3 結(jié)論與討論

本研究鑒定的X.nematophilaYL001菌株代謝產(chǎn)物主要抑菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與Nematophin[16]一致，對(duì)其進(jìn)行生物活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Nematophin對(duì)革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌都有一定的抑制作用，尤其對(duì)革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出較好的活性，對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC(12.5 μg/mL)與文獻(xiàn)[16]中Nematophin對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC(12 μg/mL)結(jié)果接近；對(duì)金黃色葡萄球菌MIC為2.5 μg/mL比文獻(xiàn)[16]中Nematophin對(duì)金黃色葡萄球菌MIC為1.5 μg/mL高。Seunguk等[17]測(cè)定Nematophin對(duì)金黃色葡萄球菌MIC為0.391 μg/mL，可能由于不同菌株的金黃色葡萄球菌對(duì)Nematophin敏感性不同；該化合物對(duì)植物病原真菌灰霉病菌及疫霉病菌也表現(xiàn)出較好的抑制MIC(12 μg/mL)[16]，Nematophin具有較好的開發(fā)前景，它對(duì)植物病原真菌的抑制作用還需進(jìn)一步研究。此外，國內(nèi)曾報(bào)道[18]該化合物還有較好的抗腫瘤活性。

共生菌次生代謝物的產(chǎn)生與菌種、菌株及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同種的致病桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較大的差異，本研究中發(fā)現(xiàn)，Nematophin的產(chǎn)量隨菌株的不同而表現(xiàn)明顯差異，嗜線蟲致病桿菌YL001菌株在相同培養(yǎng)條件下Nematophin產(chǎn)量最高，而伯氏致病桿菌X-7的代謝產(chǎn)物中沒有檢測(cè)到Nematophin，但是前期研究中發(fā)現(xiàn)致病桿菌X-7代謝產(chǎn)物乙酸乙酯提取物也表現(xiàn)出較好的抑菌活性，可能是有其他的抑菌化合物存在；說明同屬不同種或同種不同菌株，在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有很大差別。

同一菌株在不同培養(yǎng)條件下的代謝也有一定差異。初始pH作為細(xì)菌生長的重要影響因子，對(duì)共生菌細(xì)胞生長、產(chǎn)物積累以及生物活性同樣具有重要的影響[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同初始pH培養(yǎng)條件下，在一定范圍內(nèi)Nematophin的產(chǎn)量隨pH的升高而升高，初始pH 8.5時(shí)，Nematophin產(chǎn)量達(dá)到最高，這與郭樹奇[14]通過LC-MS分析YL001菌株在不同pH條件下Nematophin產(chǎn)量的結(jié)果(pH 8.5時(shí)Nematophin的產(chǎn)量為pH 4.5時(shí)的17.52倍)一致；發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下Nematophin產(chǎn)量明顯高于搖瓶發(fā)酵。

嗜線蟲致病桿菌次生代謝物Nematophin的產(chǎn)生與菌種、菌株及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同種致病桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較大差異，同一菌株在不同培養(yǎng)條件下的代謝也有一定差異，為今后工業(yè)化開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Antimicrobial Active Constituents and Its Yield Influencing Factors ofXenorhabdusnematophilusYL001

XU Peng, LI Tianzhen, ZHANG Shujing, LIU Qi, WANG Yonghong and ZHANG Xing

(Research and Development Center of Biorational Pesticides, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

The active ingredients from fermentation broth ofXenorhabdusnematophilusYL001 were isolated and purified by column chromatography and other extraction process, and their structures were identified by MS and NMR spectra.The minimal inhibitory concentrations (MIC) against bacteria of the purified Nematophin were detected by broth dilution technique.Analyzing the yield influencing factors of Nematophin by using HPLC.The factors related to Nematophin production, including different strains of the same species and culture conditions, were also explored.The results showed that one antibacterial ingredient was isolated from fermentation broth ofXenorhabdusnematophilusYL001 and identified as Nematophin with a chemical name of 3-indoleethyl (3′-methyl-2′-oxo)pentanamide which possesses significant activity against Gram-positive bacteria.The output of Nematophin was different fromXenorhabdusneamatophilastrains, and the highest yield of Nematophin was obtained from YL001 strain, which was 115.23 μg/mL.The yield of Nematophin increased in the range of initial pH 4.5 to pH 8.5, and the highest yield, 155.08 μg/mL, was obtained at pH 8.5.The yield of Nematophin was higher in fermentation tank than in the Erlenmeyer flask, and the highest yield,206.97 μg/mL, of Nematophin was obtained in fermentation tank at pH 8.5.In conclusion, the main ingredient inXenorhabdusneamatophilawas designated as Nematophin identified by former documents, the secondary metabolites of the insect pathogenic nematode symbiotic bacteria is closely related to the bacteria, strain, and the cultured conditions.

Xenorhabdusneamatophila；Isolation；Antibacterial activity；Nematophin

XU Peng, male, master student .Research area: pesticide toxicology and microbial metabolism.E-mail:xupeng19900721@126.com

WANG Yonghong, male,research fellow, doctoral supervisor.Research area: microbial pharmaceutical and fermentation technology.E-mail:yhwang@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1009.044.html

2015-12-17

2016-01-15

國家自然科學(xué)基金(31171910)；陜西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JZ004)；中央高?；究蒲袆?chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD2013003)。

許 鵬，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥毒理學(xué)和微生物代謝。E-mail: xupeng19900721@126.com

王永宏，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镏扑幖鞍l(fā)酵技術(shù)。E-mail: yhwang@nwsuaf.edu.cn

S482.2+92

A

1004-1389(2017)02-0317-06

Received 2015-12-17 Returned 2016-01-15

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31171910); Key Project of Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2014JZ004); Central University Basic Research and Innovation Projects (No.ZD2013003).