張弘弛，劉 瑞，李 慧，安志鵬，周 鳳

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西大同 037009； 2.山西大同大學 應用生物技術研究所,山西大同 037009)

黃芪內生真菌中甲醛降解菌的篩選及降解特性

張弘弛1,2，劉 瑞1,2，李 慧1，安志鵬1，周 鳳1,2

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西大同 037009； 2.山西大同大學 應用生物技術研究所,山西大同 037009)

旨在從黃芪中篩選出降解甲醛的內生真菌。采用形態(tài)學分析和序列比對分析鑒定內生真菌，并利用單因素法研究不同因素處理對菌株AL06降解甲醛特性的影響。結果表明，菌株AL06屬于溜曲霉Aspergillustamarii，通過單因素試驗分析培養(yǎng)條件對菌株降解甲醛的影響，得出菌株AL06降解甲醛的最適條件為：甲醛質量濃度200 mg/L，pH 7.0～7.5，培養(yǎng)溫度28～30℃，搖床轉速160 r/min。

甲醛降解；黃芪；內生真菌；鑒定；降解特性

甲醛作為消毒劑在工業(yè)中被廣泛使用，世界各國都嚴格限制排放工業(yè)廢水中甲醛的質量濃度，中國規(guī)定二級排放廢水中甲醛質量濃度要低于2 mg/L。甲醛有強水溶性和與生物大分子的高度反應性，所以接觸人體會導致染色體異常、慢性呼吸道疾病、神經和免疫受損、肝臟損傷?，F(xiàn)行工業(yè)對于含甲醛的廢水，主要使用吸附法、化學法、催化法等進行處理。但這些處理方法都要使用巨量的藥劑，不僅處理費用高，還存在二次污染。目前已有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，微生物對甲醛有很好的降解能力，并且處理費用低，無二次污染。因此，分離篩選可以高效降解甲醛的微生物，對降低工業(yè)甲醛污染有重要的現(xiàn)實意義。

傳統(tǒng)的生物降解甲醛的菌種都分離自各種工業(yè)污泥，本文另辟途徑，利用植物內生真菌作為甲醛降解菌的來源。植物內生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離的一類特殊的寄生真菌[3-4]。

選擇黃芪(Astragalusmembranaceus)的內生真菌作為研究對象，是因為推測黃芪在其共生的內生真菌的協(xié)助下，可以吸收和消除甲醛等有害物質。但是，直接利用植物吸收法處理工業(yè)廢水中的甲醛，存在很多的技術難點，如果可以利用其體內蘊含的大量內生真菌作為甲醛降解菌，可在簡單條件下就能生物降解甲醛。本研究以黃芪的內生真菌為來源，經馴化，分離篩選出1株可降解甲醛的內生真菌AL06，結合形態(tài)學和分子生物學鑒定該菌株，并分析該菌株的降解甲醛的相關特性，旨在為研究生物降解工業(yè)生產中產生的含甲醛廢水提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

藥用植物黃芪于2015年8月采自山西省北岳恒山陽坡，采樣黃芪健康無病蟲害。標本由山西大同大學生命科學學院周鳳教授鑒定。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基選用PDA液體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200 g(文火煮沸30 min，過濾得營養(yǎng)汁)，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然；馴化、分離和純化培養(yǎng)基[2]選用改良察氏選擇培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO41.00，K2HPO42.16，Mg SO40.10，KH2PO40.85，MnSO4· H2O 0.05，CaCl2·H2O 0.03，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，蒸餾水定容至1 L，調pH至7.0；滅菌條件121 ℃、30 min。

1.3 儀 器

LS-7SHD型立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設備有限公司)，Boxun超凈工作臺，DPH-600電熱恒溫培養(yǎng)箱(金壇市國旺實驗儀器廠)，旋渦混合器(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)，HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海天呈實驗儀器制造有限公司)，XSP7C電腦型生物顯微鏡(上海萬衡精密儀器有限公司)，Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)(上海江萊生物科技有限公司)。

1.4 內生真菌的富集培養(yǎng)

取健康黃芪葉，無菌水沖洗干凈，真空干燥水分。表面消毒程序如下：φ=75%乙醇消毒30 s，φ=3%次氯酸鈉消毒10 s，φ=75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗2～3次。采用漂洗液檢驗法[5]和組織印跡法[6]進行表面消毒效果的檢查，保證葉片表面附生菌全部被殺滅，僅保留其內部的內生真菌。無菌操作將表面消毒后的葉片研磨成漿，取10 g制備的黃芪葉漿，接種至含100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)3 d。

1.5 甲醛降解菌的馴化培養(yǎng)

吸取10 mL富集培養(yǎng)液轉接至含100 mL 改良察氏選擇培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，用錫紙包住三角瓶口(防止甲醛揮發(fā))，以甲醛(50 mg/L)為唯一碳源，置于150 r/min 搖床上28 ℃振蕩培養(yǎng)，每培養(yǎng)3 d轉接1次，按10%接種量轉接到新的察氏選擇培養(yǎng)基，繼續(xù)重復振蕩培養(yǎng)5次，同時每次將甲醛質量濃度提高10 mg/L，直到增加至100 mg/L。

1.6 甲醛降解菌的分離篩選

利用稀釋法將培養(yǎng)稀釋液0.1 mL涂布于以甲醛(100 mg/L)為唯一碳源的改良察氏固體培養(yǎng)基上，在 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。繼續(xù)多次劃線純化，直至得到純的種單菌落。同時將純化好的菌種接種于含100 mg/L甲醛溶液的改良察氏液體培養(yǎng)基中，以不接種的含100 mg/L甲醛溶液的改良察氏培養(yǎng)基為對照，在28 ℃、150 r/min搖床上培養(yǎng)7 d，分別取樣，測定其溶液中甲醛的質量濃度，驗證其對甲醛的降解性能。

1.7 降解甲醛的內生真菌AL06的鑒定

形態(tài)學鑒定：將篩選出的對甲醛有降解作用的內生真菌AL06接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，從第2天開始記錄生長形態(tài)和外觀培養(yǎng)性狀及色素產生情況；采用玻片培養(yǎng)法，顯微觀察孢子梗的分枝狀況和孢子形態(tài)等情況[7]。

分子生物學鑒定：篩選出的對甲醛有降解作用的內生真菌，轉接到PDA平板上，培養(yǎng)10～15 d后，刮取內生真菌菌落，抽干水分得干燥的菌絲塊，液氮中將菌絲塊研磨成粉末狀，選用CTAB法[8](十六烷基三甲基溴化銨法)來提取內生真菌DNA，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和質量濃度。經PCR擴增后，產物送交三聯(lián)兄弟生物醫(yī)藥研究(北京)有限公司測序。將測序獲得的ITS序列通過Blast比對，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 內生真菌AL06生長曲線和降解甲醛曲線的測定

無菌條件下，挑取活化的AL06的孢子接種于100 mL PDA培養(yǎng)液中，3 d后，作為種子液，按10%的接種量接種于250 mL的PDA培養(yǎng)液中，共接種50瓶，在振蕩培養(yǎng)20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180和200 h時，分別取樣3瓶，每瓶過濾得到菌絲體，于80 ℃烘箱8 h烘干后，采用干質量法測量其菌絲體的質量，記錄，備用。采用下述方法測定過濾液中甲醛質量濃度，計算得出甲醛的降解率[1]，吸取2 mL過濾液至具塞試管(25 mL，帶刻度線)，加 2.5 mL乙酰丙酮使用漩渦振蕩器混合搖勻，蒸餾水稀釋到需要的標定線，水浴15 min(水溫60 ℃)，冷卻后，測定吸光度(414 nm)，蒸餾水為參比，測出降解前后甲醛OD值，根據公式計算：降解率(%)=(1-OD1/OD0)×100，OD0與OD1分別為降解前后的OD值。測量數(shù)據為 2 次平行試驗的平均值，后續(xù)甲醛的降解率試驗數(shù)據采取相同測量方法。

1.9 影響內生真菌AL06降解甲醛的因素

10%接種量接種于改良察氏選擇培養(yǎng)基，采用單因素方法，分析甲醛質量濃度、初始 pH、培養(yǎng)溫度和搖床轉速對內生真菌AL06降解甲醛性能的影響。

2 結果與分析

2.1 甲醛降解菌的篩選和鑒定

通過馴化篩選分離得到1株對甲醛具有較強耐受性的黃芪內生真菌AL06。AL06菌絲生長較稀疏，菌落呈現(xiàn)淡棕色，培養(yǎng)5 d，直徑達50～65 mm，10 d菌落鋪滿培養(yǎng)皿，菌絲短且絲絨狀，菌落背部呈現(xiàn)淡黃色。菌絲發(fā)達，分枝多，有隔多核，分生孢子梗頂囊呈球形。經試驗測序，菌株AL06的ITS 序列長度為570 bp，BLAST比對結果表明，AL06的rDNA-ITS序列和Aspergillustamarii的序列相似。系統(tǒng)發(fā)育樹中，該菌株與Aspergillustamaric聚在一支，支持率為100。結合該菌株的形態(tài)學和微觀特征，將內生真菌AL06鑒定為溜曲霉Aspergillustamarii(圖1)。

圖1 菌株AL06菌落形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 The colonial morphology and phylogenetic tree of strain AL06

2.2 黃芪內生真菌AL06的生長曲線和甲醛降解曲線

由圖2可知，AL06的生長曲線和對甲醛的降解率(甲醛質量濃度100 mg/L)曲線基本吻合。真菌培養(yǎng)時間在0 ～ 90 h，其細胞生長很慢(基本處于延滯期)，由于細胞在慢慢適應新的培養(yǎng)條件，對底物甲醛的利用率(降解率)變化緩慢；當真菌生長進入對數(shù)生長期(100～140 h)，菌體干質量由 0.188 g上升至0.278 g，對底物甲醛的利用率(降解率)也隨著上升，從24.3%到79.2%；當真菌生長進入穩(wěn)定期后，直至衰亡期(150 h后)，菌體干質量開始降低，細胞開始自溶，對底物甲醛的利用率(降解率)也隨著下降，200 h下降至53.2%。因此，內生真菌AL06細胞生長對數(shù)期的培養(yǎng)時間在100～140 h。

2.3 甲醛質量濃度對黃芪內生真菌AL06降解性能的影響

在含甲醛質量濃度分別為50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 mg/L的改良察氏選擇性培養(yǎng)基中，分別按10%的接種量轉接內生真菌AL06的種子液，恒溫振蕩培養(yǎng) 140 h后，測定甲醛降解率，結果見圖3。甲醛質量濃度為200 mg/L 時，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)最大，85.3%；為50 ～ 200 mg/L時，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)隨甲醛質量濃度的增加而增加，說明在此質量濃度區(qū)間，增加甲醛質量濃度可促進內生真菌AL06對甲醛的降解，可能的原因是真菌細胞的大量繁殖，開始大量利用甲醛，降解率不斷提高；當甲醛質量濃度在150～300 mg/L時，對底物甲醛的利用率(降解率)幾乎穩(wěn)定(波動范圍82.4%～85.3%)，可能的原因是高質量濃度的甲醛對真菌細胞滲透壓產生影響，菌體生長受到一定限制，對甲醛的降解率趨于平穩(wěn)。當甲醛質量濃度從300 mg/L增加到500 mg/L，對甲醛的降解率隨甲醛質量濃度的增加呈快速下降，甲醛質量濃度達到 500 mg/L時降解率降到 35.7%，可能的原因是超高質量濃度的甲醛致使真菌細胞大量死亡，所以對其降解率下降很快。因而，甲醛質量濃度控制在200 mg/L最佳。

圖2 AL06 的生長曲線與甲醛降解率曲線Fig.2 Curves of the growth of strain AL06 and formaldehyde degradation efficiency

圖3 不同甲醛質量濃度下AL06的降解效果Fig.3 Effect of formaldehyde mass concentration on degradation of strain AL06

2.4 pH對黃芪內生真菌AL06降解性能的影響

pH可以影響細胞的膜電荷，對營養(yǎng)物質的跨膜運輸起到調節(jié)作用。在含200 mg /L甲醛的改良察氏選擇性培養(yǎng)基中，調節(jié)初始 pH分別達到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和 8.5，分別按10%的接種量轉接內生真菌AL06的種子液，28 ℃振蕩培養(yǎng) 140 h后，測定甲醛降解率，結果見圖4。內生真菌AL06降解甲醛最適pH為7.0～7.5，其對甲醛的降解率最高可達81.2% ；當pH 6.5 ～ 7.0或者7.5 ～ 8.0時，其對甲醛也能維持較高降解率(63.4% ～ 68.9%波動)，綜合考慮，后續(xù)試驗中的最適pH為7.0～7.5。

2.5 培養(yǎng)溫度對黃芪內生真菌AL06降解性能的影響

溫度是直接影響微生物的生長代謝過程的因素之一，因而對甲醛的降解有直接影響。在含200 mg /L 甲醛的改良察氏選擇性培養(yǎng)基中，按10%的接種量轉接內生真菌AL06的種子液，分別于20、22、24、26、28、30、32、34和36 ℃培養(yǎng)溫度下振蕩培養(yǎng)140 h，測定甲醛降解率，結果見圖5。當溫度低于30 ℃時，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)隨培養(yǎng)溫度的升高而升高，降解率最高達82.6%；溫度超過30 ℃后，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)呈現(xiàn)隨溫度的升高而快速降低，可能是由于內生真菌細胞降解甲醛的酶反應體系，在溫度較低(低于30 ℃)，酶的活性與溫度正相關，當溫度超過30 ℃，酶的活性與溫度負相關。所以，內生真菌AL06最適培養(yǎng)溫度是28～30 ℃。

圖4 不同pH下AL06 的降解效果Fig.4 Effect of pH on degradation of strain AL06

圖5 不同溫度下AL06的降解效果Fig.5 Effect of temperature on biodegradation of strain AL06

2.6 搖床轉速對黃芪內生真菌AL06降解性能的影響

溶解氧分子是微生物的關鍵過程中的電子受體，在生物代謝過程中至關重要，而搖床轉速是影響溶解氧的主要條件之一，因此，考察不同搖床轉速下黃芪內生真菌AL06對甲醛降解效果。在含甲醛質量濃度200 mg /L的改良察氏選擇性培養(yǎng)基中，按10%的接種量轉接內生真菌AL06的種子液，分別于100、120、140、160、180、200、220和 240 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)140 h，測定甲醛降解率，結果見圖6。結果表明，不同搖床轉速對甲醛降解率有很大影響。當搖床轉速為160 r/min時，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)達到最大值82.4%，當轉速從100 r/min增加到160 r/min時，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)隨搖床轉速的增加而增加，可能原因是溶解氧是甲醛降解中優(yōu)先利用的電子受體，隨著轉速的升高細胞對甲醛的降解速率也提升。當搖床轉速高于160 r/min后，內生真菌對底物甲醛的利用率(降解率)開始緩慢下降，可能原因是溶解氧超過其臨界氧濃度后，再增加搖床轉速，已經對溶解氧提升不明顯，而且細胞對電子受體的利用也趨于飽和，提升的氧分壓對細胞反而產生一定的毒害作用，因而甲醛降解率不升反而下降。

圖6 不同搖床轉速下AL06的降解效果Fig.6 Effect of shaking speed on biodegradation of strain AL06

3 結 論

從黃芪葉中篩選到1株可降解甲醛的內生真菌AL06，通過形態(tài)鑒定和分子生物學鑒定，其為溜曲霉Aspergillustamarii。菌株AL06能在以甲醛為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，其生長曲線與甲醛降解率曲線基本吻合，在對數(shù)生長期內甲醛降解率最高可達79.2%。對菌株AL06降解甲醛特性做初步研究，最適的降解條件：甲醛質量濃度200mg/L，pH7.0～7.5，培養(yǎng)溫度28～30 ℃，搖床轉速160 r/min。但該菌株在降解甲醛濃度方面與甲醛高效降解菌還存在一定的差距，期望進一步通過基因工程育種等方法改良菌種，提高其耐受甲醛質量濃度與降解活性，為工業(yè)廢水中甲醛的生物降解的工業(yè)應用提供潛在的應用菌種。

Reference：

[1] 孔 芳,郭鳳獻,吳木章,等.一株甲醛降解菌的篩選及降解特性的研究[J].微生物學通報,2014,41(6):1244-1251.

KONG F,GUO F X,WU M ZH,etal.Isolation and identification of bacterium strain efficient degrading formaldehyde and its degraing characteristics [J].MicrobiologyChina,2014,41(6):1244-1251(in Chinese with English abstract).

[2] 李章良,林小園,陳 勇,等.甲醛降解菌的篩選及降解特性研究[J].環(huán)境工程學報,2011,5(11):2547-2551.

LI ZH L,LIN X Y,CHEN Y,etal.Screening and degradation characteristics of a formaldehyde degrading bacterium [J].ChineseJournalofEnvironmentalEngineering,2011,5(11):2547-2551(in Chinese with English abstract).

[3] STROBEL G,DAISY B,CASTILLO U,etal.Natural products from endophytic microorganisms [J].JournalofNaturalProducts,2004,67(2):257-268.

[4] 馬養(yǎng)民,馮成亮.植物內生真菌抗腫瘤活性成分研究進展[J].有機化學,2009,29(8):1182-1191.

MA Y M,FENG CH L.Progress in the studies on antitumoral natural products from endophytic Fungi [J].ChineseJournalofOrganicChemistry,2009,29(8):1182-1191(in Chinese with English abstract).

[5] MCINROY J A,KLOEPPER J W.Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn [J].PlantandSoil,1995,173(2):337-342.

[6] STURZ A V,CHRISTIE B R,MATHESON B G,etal.Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover nodules,roots,stems and foliage and their influence on host growth [J].BiologyandFertilityofSoils,1997,25(1):13-19.

[7] 魏景超.真菌鑒定手冊(第二版)[M].上海:上海科學技術出版社,1982.

WEI J CH.Fungi Identification Manual(2nd ed)[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1982(in Chinese).

[8] 王 維,馬養(yǎng)民,張弘弛,等.黑果枸杞內生真菌E21菌株次生代謝產物的研究[J].中國新藥雜志,2013,22(4):460-464.

WANG W,MA Y M,ZHANG H CH,etal.Metabolites from the strain E21,an endophytic fungus inLyciumruthenicum[J].ChineseJournalofNewDrugs,2013,22(4):460-464(in Chinese with English abstract).

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Isolation and Identification of Endophytic Fungi fromAstragalusmembranaceuswith Degrading Formaldehyde and Its Degrading Characteristics

ZHANG Hongchi1,2,LIU Rui1,2,LI Hui1,AN Zhipeng1and ZHOU Feng1,2

(1.College of Life Science,Shanxi Datong University,Datong Shanxi 037009,China; 2.Applied Biotechnology Institute,Shanxi Datong University,Datong Shanxi 037009,China)

The endophytic fungi was isolated fromAstragalusmembranaceusby pure culture method and classified based on standard morphological identification and gene sequence analysis.And the single-factor tests were used to study the capability of degradation characteristics of strain AL06.The strain was identified asAspergillustamarii.The optimum conditions of formaldehyde degradation were as follows: mass concentration of formaldehyde 200 mg/L,pH 7.0-7.5,incubation temperature of 28-30 ℃,rotating rate of 160 r/min.

Formaldehyde degradation;Astragalusmembranaceus; Endophytic fungus; Identification; Othogonal test

ZHANG Hongchi,male,lecturer.Research area: the development of microbial resources.E-mail: zhanghclw@163.com

LIU Rui,female,associate professor.Research area: chemical biology.E-mail: liurlw@163.com.

日期：2016-12-29

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1009.042.html

2016-03-13

2016-04-15

山西省科技攻關(20130311011-6)；大同市科技攻關(201468-1)。

張弘弛，男，講師，研究方向為微生物資源的開發(fā)。E-mail: zhanghclw@163.com

劉 瑞，女，副教授，研究方向為化學生物學。E-mail: liurlw@163.com

Q939.9

A

1004-1389(2017)02-0311-06

Received 2016-03-13 Returned 2016-04-15

Foundation item The Agricultural Scientific and Technological Project of Shanxi Province in China(No.20130311011-6); the Agricultural Scientific and Technological Project of Datong (No.201468-1)