任丹莉，陳菲帆，王 暉，秦亞光，張 顏，李玉紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

黃瓜 CsHIR1基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

任丹莉，陳菲帆，王 暉，秦亞光，張 顏，李玉紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了優(yōu)化黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系以及研究 CsHIR1基因在黃瓜中的功能特性，本試驗(yàn)利用In-fusion技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA35S- CsHIR1，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切檢測(cè)、質(zhì)粒PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明，表達(dá)載體pCAMBIA35S- CsHIR1已構(gòu)建成功并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。以黃瓜抗病種質(zhì)‘PI197088’和感病種質(zhì)‘CCMC’的子葉節(jié)為外植體，通過(guò)優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法初步將 CsHIR1基因轉(zhuǎn)入黃瓜中，經(jīng)PCR檢測(cè)獲得25株陽(yáng)性植株，其中8株陽(yáng)性植株自交得到種子T1代，T1代PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為44.7%，實(shí)時(shí)熒光定量分析表明 CsHIR1在T1代陽(yáng)性株中的相對(duì)表達(dá)量稍高于對(duì)照植株，有1株與對(duì)照組的差異較顯著，這為進(jìn)一步研究 CsHIR1在黃瓜中的功能奠定了基礎(chǔ)。

黃瓜； CsHIR1；表達(dá)載體；遺傳轉(zhuǎn)化

霜霉病是黃瓜(CucumissativusL.)生產(chǎn)上最重要的卵菌病害之一，嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-4]。噴施殺菌劑是目前生產(chǎn)上最主要的防治方法，但會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及使病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問(wèn)題[1-3]，而抗病品種的培育是防治黃瓜霜霉病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。挖掘新的抗性相關(guān)基因，解析其抗性機(jī)制，是培育黃瓜抗霜霉病新品種的基礎(chǔ)和前提。由于黃瓜的遺傳基礎(chǔ)極為狹窄，而霜霉病的抗性又是由多基因控制的數(shù)量性狀，因此，創(chuàng)制新的抗性種質(zhì)資源，可以加速黃瓜抗性分子育種的速度。

遺傳轉(zhuǎn)化是驗(yàn)證克隆基因功能最為直接和重要的方法之一[5]，也是創(chuàng)建新種質(zhì)改善植物性能最有效的方法之一。目前，已用于轉(zhuǎn)基因研究的植物有200多種，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最常用的轉(zhuǎn)化方法[6]。受基因型、外植體類型、激素、培養(yǎng)基等多種因素的影響，瓜類植物如西甜瓜、黃瓜、苦瓜等遺傳轉(zhuǎn)化都比較困難[7]。黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化雖起步較早，但目前仍然沒(méi)有建立起高效穩(wěn)定的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系,因此，這已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者亟需解決的問(wèn)題。

過(guò)敏性誘導(dǎo)反應(yīng)(Hypersensitive induced reaction，HR)，是寄主抵抗活體寄生病原菌侵染的最有效防御機(jī)制之一，植物細(xì)胞HR可以有效防止病原菌向植株其他健康部位侵染和擴(kuò)展[8-11],與HR反應(yīng)有關(guān)的過(guò)敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白(Hypersensitive-induced response protein, HIRP)，在植物對(duì)抗病原物的過(guò)程中起到重要作用[12-15]。目前,已經(jīng)在煙草[7]、玉米[16]、大麥[17]、辣椒[18]、水稻[15]、小麥[19]、花生[20]等栽培作物上克隆到HIR基因，并證明HIR基因的表達(dá)涉及HR反應(yīng)[13-20]。但對(duì)HIR蛋白的功能研究較少，僅在辣椒、小麥和水稻上有所涉及[21]。西北農(nóng)林科技大學(xué)黃瓜課題組對(duì)黃瓜抗/感種質(zhì)接種霜霉病菌后的 CsHIR1基因表達(dá)做了研究，發(fā)現(xiàn)在抗病種質(zhì)‘PI197088’的 CsHIR1表達(dá)量是感病種質(zhì)‘CCMC’的3～7倍。為探討 CsHIR1基因在黃瓜霜霉病抗性中的作用，本研究構(gòu)建 CsHIR1的植物表達(dá)載體pCAMBIA35S- CsHIR1，并運(yùn)用改進(jìn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)黃瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步研究 CsHIR1基因在黃瓜霜霉病抗性中的作用以及創(chuàng)制抗霜霉病的新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

黃瓜高抗霜霉病種質(zhì)‘PI197088’由美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校瓜類研究室提供，黃瓜易感病種質(zhì)‘CCMC’購(gòu)于黑龍江省鑫星農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 菌種和質(zhì)粒

載體pCAMBIA35S(含卡那霉素和潮霉素B抗性)由陜西省油菜中心張彥峰先生贈(zèng)與，大腸桿菌感受態(tài)受體菌株 Top10以及根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)受體菌株GV3101均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜生理生態(tài)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑

熒光定量試劑盒購(gòu)于Takara，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和HiProof DNA聚合酶均購(gòu)自楊凌杰一生物技術(shù)有限公司，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量(2 kb)購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司，柱式植物 RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒均購(gòu)自北京天根公司，限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ購(gòu)自Fermentas公司，一步克隆試劑盒NovoRec和2×Taqmix購(gòu)自上海近岸科技有限公司。引物的合成和序列測(cè)定工作，均委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 黃瓜葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 以黃瓜種質(zhì)‘CCMC’和‘PI197088’的幼苗期新鮮葉片為材料，參照天根生化科技(北京)有限公司的植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取黃瓜葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄用楊凌杰一生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量，并用美國(guó)NanoDrop ND-2000C紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)提取的黃瓜RNA和cDNA濃度。

1.4.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 基于In-fusion技術(shù)的PCR引物設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，CsHIR1-P-L:5′-CGGTAC- CCGGGGATCCATGGGTAATCTTTTTTGTTGTGTGA-3′，劃線處為載體的同源序列，斜體部分為BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，CsHIR1-P-R: 5′-TCACCATGGTGTCGACCTAGTGAGAAGT- A GCGGCACCCTGA-3′，劃線處為載體的同源序列，斜體部分為SalⅠ的酶切位點(diǎn)。利用此引物對(duì)黃瓜cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得到 CsHIR1基因。

CsHIR1的PCR擴(kuò)增體系和載體的連接參照陳菲帆等[22]的方法，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ對(duì)載體pCAMBIA35S進(jìn)行雙酶切，酶切體系：模板(100 ng/μL)3 μL，10×tangobuffer 2 μL，SalⅠ(10 U/μL)0.5 μL，BamHⅠ(10 U/μL)0.5 μL，加水至10 μL，37 ℃過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收約1 300 bp 的單一線性載體片段。將線性載體片段和擴(kuò)增的 CsHIR1利用In-fusion技術(shù)[22]進(jìn)行連接組成重組質(zhì)粒pCAMBIA35S- CsHIR1。

1.4.3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 用凍融法將重組質(zhì)粒pCAMBIA35S- CsHIR1轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌Top10，經(jīng)卡那霉素(50 mg/L)平板篩選后，挑取單克隆，搖菌提質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，并利用 CsHIR1-P的擴(kuò)增引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測(cè)，將通過(guò)雙酶切和質(zhì)粒PCR檢測(cè)證實(shí)連接正確的載體，送去測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.4.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 通過(guò)凍融法將測(cè)序正確的表達(dá)載體pCAMBIA35S- CsHIR1，轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，利福平(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)抗性篩選陽(yáng)性單克隆后挑菌進(jìn)行大量擴(kuò)繁。提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，并于-80 ℃保存帶有目的載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101。

1.4.5 黃瓜 CsHIR1遺傳轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入黃瓜感病種質(zhì)‘CCMC’和抗病種質(zhì)‘PI197088’的子葉節(jié)，黃瓜的再生體系參照鐘輝麗等[1]的方法，黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系參照李月等[23]的方法，并做相應(yīng)的改進(jìn)。如為了提高再生芽的成活率，本試驗(yàn)并未對(duì)其進(jìn)行抗生素(卡那霉素和潮霉素B)篩選，而是待再生苗成活后統(tǒng)一用潮霉素B引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。另外，為了提高轉(zhuǎn)化效率，本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化體系中沒(méi)有預(yù)培養(yǎng)階段，得到的外植體不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)直接進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。

1.4.6 轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定 取移栽成活的再生苗葉片用CTAB法提取DNA，以潮霉素B引物進(jìn)行PCR檢測(cè)來(lái)間接判斷載體的轉(zhuǎn)入情況。檢測(cè)后的陽(yáng)性植株移栽到溫室里，開(kāi)花后進(jìn)行自交授粉，得到T1代后取部分種子繼續(xù)用潮霉素B引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4.7 轉(zhuǎn)化植株的實(shí)時(shí)熒光定量分析 對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的T1代植株，采集葉片參照天根生化科技(北京)有限公司的植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取黃瓜葉片總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

用熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTM(Perfect Real Time，TaKaRa)對(duì)轉(zhuǎn)基因T1代黃瓜的 CsHIR1進(jìn)行定量分析，所用儀器為Cfx Connect型定量PCR儀，內(nèi)參基因用UBI。反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaqTM10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O至20 μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s；30個(gè)循環(huán)，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s(參考TaKaRa操作手冊(cè))。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜 CsHIR1表達(dá)載體的檢測(cè)

對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA35S- CsHIR1用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切分別得到890 bp的 CsHIR1和1 300 bp的載體片段，并以重組質(zhì)粒pCAMBIA35S- CsHIR1為模板，以 CsHIR1-P為引物，利用HiProof高保真酶擴(kuò)增目的基因 CsHIR1，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測(cè)。雙酶切和質(zhì)粒PCR的凝膠(10 g/L瓊脂糖)電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)載體pCAMBIA35S- CsHIR1初步構(gòu)建成功(圖1)。然后再將重組質(zhì)粒pCAMBIA35S- CsHIR1送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示載體pCAMBIA35S- CsHIR1構(gòu)建成功。

2.2 黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化

采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，具體的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。在此遺傳轉(zhuǎn)化體系中，沒(méi)有預(yù)培養(yǎng)階段，切好的子葉節(jié)直接進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。侵染液中農(nóng)桿菌的OD600為0.2，即用侵染液將對(duì)數(shù)期的菌液稀釋3～4倍再進(jìn)行侵染，侵染液中農(nóng)桿菌濃度過(guò)高易造成污染，過(guò)低則轉(zhuǎn)化效率低。生根培養(yǎng)時(shí)，未對(duì)再生苗進(jìn)行抗生素(卡那霉素和潮霉素B)篩選，最后移栽成活的再生苗統(tǒng)一用潮霉素B引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

M.DL2000 DNA ladder；1.質(zhì)粒雙酶切 Double digested plasmid；2～4.質(zhì)粒PCR Plasmid PCR；箭頭表示基因 CsHIR1(890 bp)和載體片段 (1 300 bp) Arrows indicate the amplification of the CsHIR1(890 bp) and carrier segment(1 300 bp)

圖1 pCAMBIA35S- CsHIR1重組質(zhì)粒的檢測(cè)
Fig.1 The detection of recombinant plasmids pCAMBIA35S- CsHIR1

表1 黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系Table 1 The system of cucumber genetic transformation

經(jīng)過(guò)種子培養(yǎng)，切取子葉節(jié)，制備農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)，外植體再生培養(yǎng)，再生苗生根培養(yǎng)，再生苗的馴化，得到T0代轉(zhuǎn)化植株，將其移栽到大田里進(jìn)行自交授粉獲得T1代(圖2)。

2.3 黃瓜 CsHIR1轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè) 對(duì)T0代和T1代的轉(zhuǎn)化植株均用潮霉素B基因(1 090 bp)進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，T0代獲得18株‘CCMC’和6株‘PI197088’共25個(gè)陽(yáng)性植株，T0代陽(yáng)性率最高可達(dá)17.3%(圖3)，其中8株(6株‘CCMC’和2株‘PI197088’)陽(yáng)性株得到自交種子T1代，T1代陽(yáng)性率為44.7%(圖3)。

A.半出殼的種子 Semi-hatched seeds； B.共培養(yǎng)的外植體 Co-cultured explants；C.再生培養(yǎng)的外植體 Explants in regeneration training period；D.出芽的外植體 Budding explant；E.再生苗 Regeneration plant；F.轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic plant；G.已結(jié)瓜的轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic plants with fruits

圖2 黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程
Fig.2 The process of cucumber genetic transformation

M.DL2000 DNA ladder；P.含目的基因的重組質(zhì)粒 The plasmid carrying CsHIR1 gene ；N.未轉(zhuǎn)化的植株 The normal plant；1～19.部分T0代轉(zhuǎn)化株 Some transformants from T0 generation；20～32.部分T1代植株 Some transformants from T1 generation；箭頭表示擴(kuò)增的潮霉素B基因 The arrow indicates the amplification of the Hyg gene

圖3 T0和T1代轉(zhuǎn)化株的PCR檢測(cè)
Fig.3 The PCR detection of T0 and T1 generation transformant

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的T1代，用實(shí)時(shí)熒光定量法分析基因 CsHIR1的表達(dá)情況，結(jié)果表明各T1代之間的 CsHIR1表達(dá)差異不是很明顯(圖4)，T1代轉(zhuǎn)基因植株C1～C5和P1～P2的 CsHIR1表達(dá)量與各自的對(duì)照CK1、CK2無(wú)顯著差異，只有轉(zhuǎn)基因植株C6與其對(duì)照CK1有著顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

本研究以 CsHIR1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA35S- CsHIR1，并初步實(shí)現(xiàn) CsHIR1在黃瓜中的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因T0代和T1代的陽(yáng)性植株，經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算不同批次T0代的轉(zhuǎn)化率為0～17.3%，其中6株‘CCMC’和2株‘PI197088’的轉(zhuǎn)化株得到了轉(zhuǎn)基因T1代。

CK1.CCMC；CK2.PI197088；C1～C6.轉(zhuǎn)基因CCMC的T1代 T1 generation transformant of CCMC；P1、P2.轉(zhuǎn)基因PI197088的T1代 P1、P2 T1 generation transformant of PI197088； 柱上不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters in column indicate significant difference(P<0.05).

圖4 CsHIR1在不同轉(zhuǎn)基因植株的T1代葉片中的相對(duì)表達(dá)量
Fig.4 The relative expression pattern of CsHIR1 in the leaves of different T1 generation transformant

鑒于目前黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從外植體的基因型、外植體的種類、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、農(nóng)桿菌種類、侵染條件等方面做了研究[24]。本試驗(yàn)選用2種基因型的外植體‘PI197088’和‘CCMC’，結(jié)果表明，這2種外植體的轉(zhuǎn)化率基本相同。在種子培養(yǎng)時(shí)間上，研究發(fā)現(xiàn)4～5 d苗齡的子葉節(jié)的再生率和轉(zhuǎn)化效率較高，這與劉培培等[25]的研究結(jié)果相同；在外植體培養(yǎng)條件上，試驗(yàn)結(jié)果顯示再生培養(yǎng)前(種子培養(yǎng)、外植體侵染農(nóng)桿菌和共培養(yǎng))使外植體一直保持在黑暗條件下，可以提高黃瓜的轉(zhuǎn)化效率，這與王燁等[26]認(rèn)為一定時(shí)間的暗培養(yǎng)可以提高外植體的再生率這一結(jié)果相似，有研究認(rèn)為暗處理可以減少外植體溢出酚類物質(zhì)，從而有利于不定芽的形成進(jìn)而提高再生率[27]。在再生苗的檢測(cè)上，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)是否加抗生素進(jìn)行篩選做了比較，發(fā)現(xiàn)抗生素篩選會(huì)降低黃瓜的轉(zhuǎn)化效率和阻礙再生苗的生長(zhǎng),抗生素篩選的植株生長(zhǎng)勢(shì)弱，須根浮于培養(yǎng)基表面，這與王學(xué)斌等[28]報(bào)道的一定濃度的抗生素篩選可以提高轉(zhuǎn)化效率不同，造成這種不同的原因可能是不同基因型外植體對(duì)抗生素的耐受力不同；在預(yù)培養(yǎng)時(shí)間上，切好的子葉節(jié)不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)直接侵染農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率與經(jīng)過(guò)1～2 d預(yù)培養(yǎng)后侵染農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率相近，這與王艷蓉等[29]報(bào)道的預(yù)培養(yǎng)可以提高抗性芽率不同，可能是由于本試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)化條件以及外植體基因型與前人有所不同，其中1株‘CCMC’的轉(zhuǎn)基因T1代與對(duì)照組有顯著性差異，證明目標(biāo)基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化并實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)[30]。

本研究通過(guò)優(yōu)化部分條件建立適合外植體‘PI197088’和‘CCMC’的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并且得到轉(zhuǎn)基因T1代，初步證明目的基因轉(zhuǎn)入黃瓜中。后續(xù)工作本課題組將會(huì)圍繞 CsHIR1的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)和功能驗(yàn)證，以期獲得抗霜霉病的黃瓜新種質(zhì)。

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(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Construction of Expression Vector of Defense Genes CsHIR1 from Cucumber and Its Genetic Transformation Research

REN Danli, CHEN Feifan, WANG Hui,QIN Yaguang,ZHANG Yan and LI Yuhong

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

In order to study the genetic CsHIR1 features and optimize the cucumber genetic transformation system, CsHIR1 was studied to transform into cucumber plants.The plant expression vector pCAMBIA35S- CsHIR1 was constructed by In-fusion technology.After double enzymesSalⅠ andBamHⅠ digestion detection, plasmid PCR detection and sequence identification, the results showed that expression vector pCAMBIA35S- CsHIR1 has been successfully built and transferred into agrobacterium GV3101.Using the cotyledon node of cucumber germplasm ‘CCMC’of susceptible to downy mildew and high-resistant germplasm‘PI197088’as explant, CsHIR1 gene has been initially proved to transfer into cucumber through the optimization of agrobacterium-mediated genetic transformation system.The 25 positive plants have been obtained by PCR detection, and 8 of which got T1 seeds.The PCR detection positive rate from the T1 generation was 44.7%.We examined the expression of CsHIR1 by real time quantitative PCR in seedlings of T1 generation,one of the six lines was higher than CK indicating the CsHIR1 has been transformed into cucumber.

Cucumber； CsHIR1 gene； Expression vector； Genetic transformation

REN Danli, female, master student.Research area:vegetable breeding and biotechnology.E-mail:1617814061@qq.com

ZHANG Yan,male,Ph.D,lecturer.Research area:germplasm resources and biotechnology in fruit vegetable.E-mail:zhangyan2014@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1008.028.html

2016-03-20

2016-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171955，31471891)；西北農(nóng)林科技大學(xué)優(yōu)秀人才科研專項(xiàng)資金(QN2009011)。

任丹莉，女，在讀碩士，研究方向?yàn)槭卟擞N與生物技術(shù)。E-mail：1617814061@qq.com

張 顏，男，博士，講師，主要從事果菜類種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究。E-mail：zhangyan2014@nwsuaf.edu.cn 李玉紅，女，博士，教授，主要從事黃瓜種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究。E-mail：liyuhong73@126.com

S642.2；Q78

A

1004-1389(2017)02-0255-07

Received 2016-03-20 Returned 2016-05-20

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31171955,No.31471891); Northwest Agriculture and Forestry University of Science and Technology Research and Special Talents Funded Projects(No.QN2009011).

LI Yuhong, female, Ph.D,professor.Research area:germplasm resources and biotechnology in cucumber.E-mail: liyuhong73@126.com