馬 偉，王家敏，馬桂蘭，馬 祺，馬 花，喬自林，馬忠仁，馮玉萍

(1.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，蘭州 730010；3.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030)

Hi5-SF懸浮細(xì)胞系的建立及鑒定

馬 偉1，王家敏1，馬桂蘭2，馬 祺2，馬 花1，喬自林1，馬忠仁3，馮玉萍3

(1.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，蘭州 730010；3.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030)

從中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)引進(jìn)High Five細(xì)胞并對其進(jìn)行馴化，獲得無血清懸浮馴化株(Hi5-SF)。依據(jù)《中華人民共和國藥典(2010年版三部)》對其進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性研究、微生物污染、病毒外源因子及細(xì)胞致瘤性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hi5-SF細(xì)胞復(fù)蘇活力76.3%，生長曲線呈“S”型，最大增殖密度可達(dá)3.50×106mL-1，群體倍增時(shí)間為26.2 h；細(xì)菌、真菌及支原體檢查均為陰性；血細(xì)胞吸附試驗(yàn)、致細(xì)胞病變試驗(yàn)和特異性病毒熒光抗體結(jié)合物檢查結(jié)果均為陰性；致瘤性檢查結(jié)果也為陰性。說明該細(xì)胞株符合獸用疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞質(zhì)量要求，可以在疫苗研究與生產(chǎn)中應(yīng)用。

High five細(xì)胞；懸浮培養(yǎng)；質(zhì)量評價(jià)

粉紋夜蛾(Trichoplusiani)卵巢細(xì)胞株BTI-TN-5B1-4是20世紀(jì)90年代Robert R和李國勛等從粉紋夜蛾卵巢細(xì)胞系BTI-TN-5B1克隆得到的新型宿主細(xì)胞，Invitrogen公司注冊商標(biāo)為High Five細(xì)胞[1-2]。西北民族大學(xué)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心的High Five細(xì)胞引自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，為淋巴母細(xì)胞樣形態(tài)，半貼壁生長，培養(yǎng)液為Grace’s Insect Medium(含φ=10%的FBS)。High Five細(xì)胞對多種病毒敏感并能支持外源基因高效表達(dá)，尤其具有較高的多角體病毒增殖能力和重組蛋白表達(dá)水平，是當(dāng)前應(yīng)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system,BEVS)生產(chǎn)病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗的主要細(xì)胞系[3-5]。該細(xì)胞可在HyQ SFX-Insect、EX-CELLTM405和Express FiveTMSFM等培養(yǎng)基中無血清懸浮培養(yǎng)，然而上述進(jìn)口培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，實(shí)際生產(chǎn)中并不適用。貼壁生長的High Five細(xì)胞需要進(jìn)行較長時(shí)間的懸浮適應(yīng)培養(yǎng)才能夠在上述商品化無血清培養(yǎng)基正常生長，即使已經(jīng)適應(yīng)在某種培養(yǎng)基中懸浮生長，當(dāng)更換培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞仍需要3～5代的適應(yīng)培養(yǎng)方可正常生長[3]。High Five細(xì)胞的高密度無血清懸浮培養(yǎng)在疫苗研究和生產(chǎn)上具有重要意義。本研究利用蘭州百靈生物技術(shù)有限公司開發(fā)的BFLM502 SFM培養(yǎng)基對引進(jìn)的High Five細(xì)胞(CCTCC株)進(jìn)行無血清懸浮馴化，獲得可無血清懸浮生長的Hi5-SF細(xì)胞株，并對其進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性研究和質(zhì)量檢測，以評價(jià)該懸浮細(xì)胞株用于動(dòng)物疫苗研究和生產(chǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材 料

High Five細(xì)胞(CCTCC)；新生牛血清(NBS，蘭州民海)、胰蛋白酶液(Gibco)及無血清培養(yǎng)基(SFLM502 SFM，蘭州百靈)；無菌檢查與支原體檢查培養(yǎng)基(北京三藥科技)、Heochst33258(Sigma)；腦心肌炎病毒VR-739株、牛腺病毒3型WBR-1株、牛腺病毒5型、牛細(xì)小病毒Haden株、牛副流感病毒3型SB株和呼腸孤病毒Abney株(ATCC)以及牛病毒性腹瀉病毒Oregon C24V株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；腦心肌炎病毒、牛腺病毒3型、牛腺病毒5型、牛細(xì)小病毒、牛副流感病毒3型、呼腸孤病毒和牛病毒性腹瀉病毒熒光抗體結(jié)合物(VMRD)；Vero細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、ST細(xì)胞、牛腎原代細(xì)胞和Hela細(xì)胞均為甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心保存；SPF級BALB/c Nude 裸鼠(北京維通利華)等。

3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、CKX41型倒置相差顯微鏡、IX71型熒光倒置差相顯微鏡(Olympus)、ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城)，等。

1.2 方 法

1.2.1 High Five細(xì)胞懸浮馴化 選取狀態(tài)良好的High Five貼壁細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)液為BFLM502(含φ=10%的NBS)。待細(xì)胞鋪滿單層后用吸管輕輕吹打，收集細(xì)胞懸液離心，用新鮮培養(yǎng)液懸浮以50×104mL-1接種到三角搖瓶中，27 ℃、60 r/min懸浮培養(yǎng)，至細(xì)胞密度達(dá)100×104mL-1以上時(shí)離心并收集細(xì)胞，按1∶2傳代并提高轉(zhuǎn)速至80 r/min，同法至轉(zhuǎn)速提高為120 r/min，穩(wěn)定傳3代后凍存，并命名為Hi5-S。

1.2.2 High Five懸浮細(xì)胞無血清馴化 將懸浮馴化后的Hi5-S細(xì)胞，采用逐步降血清法進(jìn)行無血清培養(yǎng)馴化。血清由φ=10%逐步降至φ=5%、φ=3%、φ=1.5%和φ=0%。無血清穩(wěn)定培養(yǎng)5代后建庫凍存，并命名為Hi5-SF[6]，凍存液為BFLM502(φ=70%)+NBS(φ=20%)+DMSO(φ=10%)。

1.2.3 Hi5-SF細(xì)胞鑒定 復(fù)蘇及活力檢查：采用常規(guī)方法于27 ℃水浴復(fù)蘇細(xì)胞，在10 mL BFLM502培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞后1 000 r/min離心10 min，換新鮮BFLM502培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，同時(shí)抽樣，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測復(fù)蘇活力[7]。細(xì)胞培養(yǎng)過程中不定時(shí)進(jìn)行顯微觀察并采集圖像。

生長特性：取狀態(tài)良好的Hi5-SF細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以活細(xì)胞密度50×104mL-1接種細(xì)胞于三角瓶中，培養(yǎng)體積40 mL，平行3組。27 ℃、120 r/min懸浮培養(yǎng)，每24 h取樣1 mL 計(jì)數(shù)，直至活細(xì)胞密度降低，繪制細(xì)胞生長曲線并求出細(xì)胞最大增殖密度和倍增時(shí)間[8]。

微生物污染檢查和病毒檢查：按照《中華人民共和國藥典(2010年版三部)》進(jìn)行[9]。

致瘤性檢查：按照《中華人民共和國藥典(2010年版三部)》進(jìn)行檢查。陽性對照組為5×106mL-1的Hela細(xì)胞懸液，陰性對照組為5×107mL-1的MRC-5細(xì)胞懸液，待檢組為5×107mL-1的Hi5-SF細(xì)胞懸液，注射劑量為每只0.2 mL，每組10 只裸鼠。每3～4 d觀察測量腫瘤大小并稱體質(zhì)量[9]。試驗(yàn)在甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)蘇及活力檢查

含血清培養(yǎng)的Hi5-S細(xì)胞凍存前活力為88.5%，平均復(fù)蘇活力為80.5%；無血清馴化的Hi5-SF細(xì)胞凍存前活力為87.8%，平均復(fù)蘇活力76.3%。與凍存前活力相比復(fù)蘇活力均有所下降，表明凍存過程對細(xì)胞有一定損傷，細(xì)胞復(fù)蘇后72～96 h可1∶4傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及生長特性

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 High Five細(xì)胞(CCTCC株)未懸浮馴化前，細(xì)胞半貼壁生長，貼附的細(xì)胞多呈不規(guī)則多角形，為淋巴母細(xì)胞樣；經(jīng)無血清懸浮馴化后的懸浮細(xì)胞株Hi5-SF細(xì)胞為圓球狀，大小均一，邊緣光滑、明亮(圖1)。

2.2.2 生長特性 Hi5-SF懸浮細(xì)胞以50×104mL-1活細(xì)胞密度接種時(shí)生長潛伏期較短，接種第2～3 d為明顯的指數(shù)生長期，第4 天進(jìn)入穩(wěn)定期，之后細(xì)胞活力下降，活細(xì)胞密度開始降低。生長曲線為較典型的“S”型(圖2)，最大增殖密度為3.50×106mL-1，群體倍增時(shí)間為26.2 h。

2.3 微生物污染檢查

Hi5-SF細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)和顯微觀察未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌污染。支原體DNA染色法結(jié)果顯示，陽性對照細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，核外出現(xiàn)藍(lán)色熒光顆粒和絲狀點(diǎn)(圖3-a)；陰性對照只有細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，核外無藍(lán)色熒光顆粒(圖3-b)；待檢細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，核周圍無藍(lán)色熒光顆粒(圖3-c)，結(jié)果與陰性對照相同，說明待檢細(xì)胞沒有發(fā)生支原體污染。

2.4 病毒外源因子檢查

細(xì)胞培養(yǎng)觀察和血細(xì)胞吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞形態(tài)正常且無吸附血細(xì)胞現(xiàn)象。細(xì)胞裂解液接種到Vero、MRC-5和牛腎原代細(xì)胞上培養(yǎng)觀察和血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種細(xì)胞均形態(tài)正常，血凝試驗(yàn)和致細(xì)胞病變試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

a.High Five細(xì)胞的φ=10% NBS培養(yǎng)，72 h High Five cell culture with NBS(φ=10%)，72 h；b.Hi5-SF細(xì)胞無血清培養(yǎng)，24 h Hi5-SF cell serum-free culture，24 h

圖1 High Five細(xì)胞和Hi5-SF細(xì)胞形態(tài)
Fig.1 Morphology of High Five cell and Hi5-SF cell

圖2 Hi5-SF細(xì)胞生長曲線Fig.2 Growth curve of Hi5-SF cell

特異性病毒熒光抗體結(jié)合物檢查試驗(yàn)中，陽性對照結(jié)果(圖4-A)顯示，牛腎原代細(xì)胞上接種牛腺病毒3型(BAV-3)和牛腺病毒5型(BAV-5)，其細(xì)胞核呈現(xiàn)出較強(qiáng)的黃綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)也著色較淡且呈彌散裝(圖4-a，4-b)；接種牛腹瀉病毒(BVDV)后細(xì)胞質(zhì)呈黃綠色熒光(圖4-c)；接種牛細(xì)小病毒(BPV)后細(xì)胞核呈強(qiáng)黃綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色(圖4-f)；接種牛副流感病毒3型(PI-3)的細(xì)胞體呈黃綠色熒光，胞體中有著色較輕的球形斑(圖4-g)；接種呼腸孤病毒(REO)后細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)黃綠色熒光，胞質(zhì)胞漿呈彌漫性淡黃綠色熒光(圖4-h)。在ST細(xì)胞上接種豬細(xì)小病毒(PPV)后細(xì)胞核呈明亮的黃綠色熒光(圖4-k)。陰性對照中(圖4-B)，牛腎原代細(xì)胞和ST細(xì)胞均未呈現(xiàn)熒光。試驗(yàn)組(圖4-C)結(jié)果顯示，Hi5-SF細(xì)胞凍融裂解后的上清液接種到牛腎原代細(xì)胞和ST細(xì)胞中均未呈現(xiàn)熒光，與陰性對照一致，表明細(xì)胞未受外源病毒污染。

a.陽性對照 Positive control； b.陰性對照 Negative control；c.Hi5-SF細(xì)胞待檢樣 The sample of Hi5-SF cell

2.5 致瘤性檢查

致瘤性試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)，注射后第1周陽性對照組和陰性對照組均出現(xiàn)大小不一的腫瘤，第2周開始均減小并消失，待檢組裸鼠第2周腫瘤減小，但未消失。陽性對照組2周后開始成瘤且腫瘤逐漸增大，成瘤率100%(10/10)(圖5-A)；陰性對照組2周后腫瘤全部消失，成瘤率0%(0/10)(圖5-B)；待檢組2周后腫瘤增大，第40 天時(shí)全部消失，解剖未見轉(zhuǎn)移瘤形成，表明Hi5-SF懸浮細(xì)胞不致瘤。

A.陽性對照 Positive control； B.陰性對照 Negative control； C.試驗(yàn)組 Sample group

a.BAV-3; b.BAV-5; c.BVDV; d.BAV-3; e.BAV-3; f.BPV g.PI-3; h.REO; i.BPV; j.BPV; k.:PPV; l.PPV; m.PPV

圖4 特異性病毒熒光抗體結(jié)合物檢查
Fig.4 Virus-specific fluorescent antibody conjugate test

A.陽性對照 Positive control； B.陰性對照 Negative control；C.試驗(yàn)組 Sample group

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)，其質(zhì)量直接影響疫苗的質(zhì)量和安全性，1株細(xì)胞用于生產(chǎn)前必須進(jìn)行全面的生物學(xué)鑒定和質(zhì)量評價(jià)[10]。鑒別的方法包括觀察法(如顯微觀察)、生物化學(xué)法(如同工酶試驗(yàn))、免疫學(xué)檢測法(如組織相容性抗原)、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(如染色體核型)、分子生物學(xué)檢測法(如DNA指紋圖譜)等，評價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞種屬鑒別、生長特征、微生物污染、內(nèi)源和外源病毒因子檢查等，用于人用疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株還要進(jìn)行活細(xì)胞的成瘤性、細(xì)胞碎片和細(xì)胞DNA的致癌性檢查，有時(shí)還需進(jìn)行均一性及傳代穩(wěn)定性檢查。

High Five細(xì)胞為半貼壁生長細(xì)胞，較容易馴化成懸浮細(xì)胞。馴化好的Hi5-SF細(xì)胞在26～28 ℃、120 r/min懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞可穩(wěn)定生長。剛適應(yīng)無血清培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)大小不均，細(xì)胞個(gè)體增大，并且容易結(jié)團(tuán)，傳代穩(wěn)定后細(xì)胞縮小且大小均一，表面圓滑，結(jié)團(tuán)現(xiàn)象也消失。無血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺少血清保護(hù)，以及搖晃過程中剪切力對細(xì)胞的損傷，細(xì)胞活力不是很穩(wěn)定，一般情況細(xì)胞活力在85% 以上都是可接受的。增加凍存液中血清的含量能夠降低凍存過程對細(xì)胞的損傷。無血清培養(yǎng)的Hi5-SF細(xì)胞增殖速度快，50×104mL-1接種72 h平均可達(dá)到3.0×106mL-1左右。

本研究獲得的Hi5-SF懸浮細(xì)胞來源歷史清楚，生長狀態(tài)良好，生長曲線呈典型的“S”型，最大增殖密度為3.50×106mL-1，指數(shù)生長期倍增時(shí)間為26.2 h。細(xì)胞沒有被細(xì)菌、真菌和支原體等微生物污染。通過內(nèi)源和外源病毒因子檢查排除致細(xì)胞病變和致紅細(xì)胞吸附病毒的污染可能。通過特異性熒光抗體結(jié)合物排除馴化前傳代培養(yǎng)過程中使用牛血清和胰蛋白酶可能造成的病毒污染，致瘤性檢查試驗(yàn)排除細(xì)胞的致瘤性，表明用該細(xì)胞株進(jìn)行獸用疫苗研究是安全的。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Establishment and Identification of Hi5-SF Suspension Cell Line

MA Wei1,WANG Jiamin1,MA Guilan2，MA Qi2,MA Hua1,QIAO Zilin1,MA Zhongren3and FENG Yuping3

(1.Gansu Engineering Research Center for Animal Cell,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China; 2.Lanzhou Bailing Bio-Tech CO.,LTD.,Lanzhou 730010,China;3.Key Laboratory of Bioengineering and Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

High Five cells were introduced from CCTCC and domestecated,,and we obtained semi-adherent cells to suspension growth cell line (Hi5-SF).Subsequently,the biological characteristics,microbial contamination,viral exogenous factors and tumorigenicity of Hi5-SF cell line were detected according to the Pharmacopoeia of People’s Republic of China (3rd Edition,2010).The results showed that the recovery vitality of Hi5-SF cells was 76.3%,the growth curve was S-shape,and maximum concentration was 3.50×106cells·mL-1with the population doubling time(PDT) of 26.2 h.The cells were free of bacteria,fungi and mycoplasmas;hemadsorption test,cytopathic test,specific virus fluorescent antibody binding test and tumorigenicity test were all negative.The resultus indicated that the Hi5-SF cell line meets the quality requirements of veterinary vaccine production.

High five cell; Suspension culture; Quality evaluation

MA Wei，male,master student.Research area:cell culture,the research and development of veterinary biological products.E-mail:670267497@qq.com

FENG Yuping,female,Ph.D,professor.Research area:development and utilization of biotechnology materials.E-mail:119236672@qq.com

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1005.006.html

2016-01-11

2016-03-27

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃” (IRT13091)；甘肅省科技計(jì)劃(144FKCA082)；西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(31920150029，zyp2015006)。

馬 偉，男，碩士研究生，從事細(xì)胞培養(yǎng)、獸用生物制品的開發(fā)研究。E-mail：670267497@qq.com

馮玉萍，女，博士，教授，主要從事生物技術(shù)材料的開發(fā)利用研究。E-mail：119236672 @qq.com

S85

A

1004-1389(2017)02-0173-06

Received 2016-01-11 Returned 2016-03-27

Foundation item The Pogram for Changjiang Scholars and Innovative Team of Ministry of Education(No.IRT13091); Science and Technology Project of Gansu Province (No.144FKCA082); the Project Fundamental Research Funds for the Central Universities of Northwest University For Nationalities (No.31920150029,No.zyp2015006).