妥 鑫，王勝義，王 慧，崔東安，黃美州，劉永明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050)

甘肅部分地區(qū)致羔羊腹瀉大腸埃希菌的分離鑒定及耐藥性分析

妥 鑫，王勝義，王 慧，崔東安，黃美州，劉永明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050)

為調(diào)查甘肅地區(qū)大腸埃希菌對新生羔羊腹瀉的致病性及其耐藥性，從甘肅省8個養(yǎng)殖場采集新生腹瀉羔羊糞便92份。采用16S rDNA擴增結(jié)合微生物鑒別培養(yǎng)技術(shù)對病料中的致病性大腸埃希菌進行鑒定，隨機選取分離的6株菌株進行致病性試驗，并采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法對分離得到的菌株進行耐藥性分析。結(jié)果表明，從92份病料中分離得到21株致病性大腸埃希菌，選取的6株菌均有一定的致病性，耐藥性分析結(jié)果顯示該地的大腸埃希菌對羊場常用的多種抗生素耐藥。表明大腸埃希菌仍是引起甘肅地區(qū)新生羔羊腹瀉的主要病原菌，而且耐藥性嚴重。

新生羔羊；腹瀉；大腸埃希菌；致病性；耐藥性

引起羔羊腹瀉的病因多樣[1-4]；其發(fā)生可以由B型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、沙門氏菌(Salmonella)、輪狀病毒(Rotavirus RV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)等病原所致，但環(huán)境條件如氣溫等改變、飼養(yǎng)管理不善、羔羊本身消化不良等因素也可導(dǎo)致該病的發(fā)生。羔羊腹瀉癥的病原有地域差異性，且時常發(fā)生變異并無規(guī)律可循[5- 6]。因此，如何有效防治羔羊腹瀉癥，對養(yǎng)殖業(yè)意義重大。大腸埃希菌作為一種動物腸道常在菌，大多數(shù)情況下無致病性，僅少數(shù)致病性大腸埃希菌能導(dǎo)致各種幼齡動物的腹瀉和敗血癥；由該菌引起的羔羊腹瀉癥俗稱羔羊白痢，主要危害1～4日齡的新生羔羊[7-9]。為了解甘肅地區(qū)大腸埃希菌對羔羊的致病情況及其對常用抗生素的耐藥情況，筆者對2014年1月-2016年2月引起甘肅部分地區(qū)新生羔羊腹瀉的病原進行分離鑒定，并對分離的病原菌進行耐藥性分析。通過對病原的分離鑒定和耐藥性分析，了解當?shù)馗嵫虼竽c埃希菌的感染情況及其耐藥現(xiàn)狀，對臨床診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2014年1月-2016年2月無菌采集甘肅省玉門、永昌、蘭州、天水8個集約或半集約養(yǎng)殖場發(fā)生腹瀉癥的新生羔羊(10日齡以內(nèi))糞便92份，放入糞便采集器中，-80 ℃保存。腹瀉羔羊的選擇依據(jù)：糞便性狀改變，呈水樣、粥樣，顏色異常，異臭；羔羊臀部超過1/3被糞便污染且精神狀態(tài)異常；排便次數(shù)明顯增多且伴有腹痛現(xiàn)象；滿足其中之一者判為腹瀉。

1.2 細菌分離培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，將糞便棉拭子放入5 mL的滅菌EP管中，加入2 mL無菌生理鹽水，漩渦2 min，4 500 r/min離心5 min，制備菌懸液。取制備好的菌懸液200 L接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃過夜培養(yǎng)。營養(yǎng)肉湯渾濁者接種血平板(購自廣州環(huán)凱勝物技術(shù)有限公司)，37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取單菌落在營養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)后鏡檢，已純化的菌液置4 ℃保存，備用。

1.3 分離菌的鑒定

1.3.1 分離菌DNA的提取 用細菌DNA提取試劑盒[TakaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，寶生物工程(大連)有限公司，大連]提取已純化的分離菌DNA，具體操作按照該試劑盒說明書進行，將提取的DNA置-20 ℃保存。

1.3.2 分離菌的16S rDNA鑒定 用細菌16S rDNA鑒定試劑盒[TakaRa16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit，寶生物工程(大連)有限公司，大連]對提取的DNA擴增，具體操作按照試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后送北京華大基因研究中心測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對測序結(jié)果進行比對，確定分離菌種類。

1.3.3 分離菌的培養(yǎng)鑒別 對經(jīng)16S rDNA鑒定仍不能確定的分離菌株，用伊紅美藍培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基(購自廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司)進一步鑒別，依據(jù)培養(yǎng)基使用說明判定結(jié)果。

1.4 分離菌致病性試驗

將36只體質(zhì)量約125 g的昆明系小鼠(購自蘭州大學(xué)實驗動物中心)分成6組，記為Ⅰ～Ⅵ組，每組雌雄各半；另取同批次的8只小鼠作為對照組(雌雄各半)，記為C組。隨機選取在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好且菌落為粉紅色或紅色的6株分離菌，接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)14 h后，用無菌生理鹽水將菌液中的菌落數(shù)調(diào)至1.5×108cfu/mL，分別經(jīng)腹腔注射Ⅰ～Ⅵ組小鼠；C組中的4只小鼠(雌雄各半)腹腔注射無菌生理鹽水，另外4只(雌雄各半)腹腔注射同條件培養(yǎng)的營養(yǎng)肉湯；依據(jù)小鼠體質(zhì)量腹腔注射劑量均為0.025 mL/g。

1.5 分離菌耐藥性分析

將確定的分離菌純培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，用無菌生理鹽水將菌液的菌落數(shù)調(diào)整至1.5×108cfu/mL。用滅菌棉簽將菌液均勻涂布于MH藥敏培養(yǎng)基(購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)，分別貼上青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢西丁、桿菌肽、復(fù)方新諾明、磺胺甲基異惡唑、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素的藥敏紙片(均購自杭州微生物試劑有限公司)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑。根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》(第24版信息增刊)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)

從92份糞便樣品中分離到23株可疑大腸埃希菌。疑似菌在血平板上生長為中等大小(直徑約2 mm)、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、中央有隆起、灰白色、或有β溶血，見圖1-A；革蘭染色鏡檢可見紅色、兩端鈍圓、散在或成對存在，見圖1-B。

A.血平板上的疑似菌落形態(tài)：箭頭所示 The colonial morphology of suspectedE.colicultured on the blood agar medium as indicated by the arrow;B.顯微鏡下的疑似菌形態(tài)(革蘭染色 ×1 000) The bacterial morphology of suspectedE.coliexamined under a microscope (Gram staining ×1 000)

圖1 分離菌的培養(yǎng)特點與染色形態(tài)
Fig.1 The bacterial culture characteristics and morphology

2.2 分離菌鑒定

對分離的疑似大腸埃希菌16S rDNA擴增、測序比對及鑒定培養(yǎng)，確定分離得到23株大腸埃希菌。23株分離菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上生長為紫黑色、帶有金屬光澤的菌落。其中的21株(占92份病料的22.8%)菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，菌落為粉紅色或紅色；另外2株未生長。見圖2、圖3。

2.3 分離菌致病性試驗

Ⅰ～Ⅵ組的36只小白鼠經(jīng)腹腔注射分離菌菌液21 h后，3只未見任何癥狀；10只死亡，其中雌性7只，雄性3只；23只出現(xiàn)腹瀉癥狀，其中雌性12只，雄性11只。C組小白鼠未出現(xiàn)任何癥狀(表1)。

2.4 分離菌耐藥性分析

用20種抗生素(青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢西丁、桿菌肽、復(fù)方新諾明、磺胺甲基異惡唑、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素)對分離得到的21株(23株分離菌中的2株未在麥康凱培養(yǎng)基上生長)致病性大腸埃希菌進行藥敏分析，結(jié)果顯示，21株大腸埃希菌均表現(xiàn)多重耐藥，3～18重都有分布，其中11～14重分布相對較多(圖4)。分離菌對桿菌肽、青霉素、鏈霉素、克林霉素等有較高的耐藥性(超過80%)(表2)。

M.DL1000；PC.陽性對照 Positive control；NC.陰性對照 Negative control；1～12.分離菌16S rDNA產(chǎn)物 Amplification products of bacterial 16S rDNA

圖2 部分分離菌16S rDNA鑒定
Fig.2 Amplification products of bacterial 16S rDNA

A.伊紅美藍培養(yǎng)基的鑒別結(jié)果：箭頭所示為分離菌的菌落形態(tài) The identification of Eosin-Methy Blue Agar Medium: the colony morphology of clinical isolates indicated by the arrow; B.麥康凱培養(yǎng)基的鑒別結(jié)果：箭頭所示為致病性分離菌的菌落形態(tài) The identification of MacConkey Agar Medium: the colony morphology of pathogenic and clinical isolates indicated by the arrow

圖3 分離菌在伊紅美藍培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上形成的菌落
Fig.3 The colony morphology of bacteria on Eosin-Methy Blue and MacConkey Agar Medium

表1 分離菌對小白鼠的致病情況Table 1 The bacterial pathogenicity to mouse

3 討 論

各地區(qū)引起羔羊腹瀉的優(yōu)勢病原不盡相同，細菌、病毒等病原均可導(dǎo)致該病的發(fā)生、傳播，甚至暴發(fā)流行，給臨床防治帶來巨大挑戰(zhàn)[10-11]，弄清病原是防治該病的關(guān)鍵。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)已成為病原檢測的主要手段，細菌16S rDNA鑒定更是細菌鑒定的金標準；但是有些病原，如腸桿菌科的大腸埃希菌屬和志賀菌屬的細菌同源性較高，僅用16S rDNA擴增后進行比對可能無法區(qū)分[12-13]。因此，本研究采用16S rDNA擴增結(jié)合細菌鑒別培養(yǎng)，對甘肅地區(qū)導(dǎo)致羔羊腹瀉的大腸埃希菌進行分離鑒定。結(jié)果從92份腹瀉病料中分離得到21株(檢出率為22.8%)致病性大腸埃希菌(麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，菌落為粉紅色；部分菌株致小鼠腹瀉或死亡)，由此可推斷大腸埃希菌是甘肅地區(qū)致羔羊腹瀉的主要病原之一。

圖4 分離菌多重耐藥性分析Fig.4 Multidrug resistance analysis of clinical isolates

抗生素Antimicrobialdrug耐藥菌株數(shù)Drugresistantstrains耐藥率/%Drugresistantrate抗生素Antimicrobialdrug耐藥菌株數(shù)Drugresistantstrains耐藥率/%Drugresistantrate青霉素 Penicillin2095.2氧氟沙星 Ofloxacin314.3氨芐西林 Ampicillins838.1環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin628.6阿莫西林 Amoxicillin1257.1丁胺卡那 Amikacin628.6頭孢氨芐 Cephalexin1047.6鏈霉素 Streptomycin1885.7頭孢噻肟 Cefotaxime1152.4慶大霉素 Gentamicin733.3頭孢西丁 Cefoxitin523.8新霉素 Neomycin838.1桿菌肽 Bacitracin21100卡那霉素 Kanamycin942.9復(fù)方新諾明 Co-trimoxazole733.3克林霉素 Clindamycin1781.0磺胺甲基異惡唑 SMZ942.9紅霉素 Erythromycin1676.2諾氟沙星 Noroxin419.0四環(huán)素 Tetracycline628.6

致病性大腸埃希菌可導(dǎo)致幾乎所有動物發(fā)病，在養(yǎng)羊企業(yè)中更是屢見不鮮，其主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉和敗血癥[1-2, 14-16]。中國在20世紀80年代有報道[8]，17%的新生羔羊腹瀉癥由大腸埃希菌所致。然而，有些致病性大腸埃希菌在機體腸道環(huán)境好轉(zhuǎn)時可能會失去致病性而變?yōu)槌Ｔ诰闧17-18]。本研究從甘肅地區(qū)分離的23株細菌中有2株在麥康凱培養(yǎng)基上不生長，可能這2只羔羊的腹瀉癥是由其他原因所致，分離到的是腸道常在大腸埃希菌；也可能是由于該2只羊機體好轉(zhuǎn)(免疫力增強)而使菌株失去致病性(不再產(chǎn)生毒素)。致病性試驗結(jié)果表明，隨機選取在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好的菌株對條件相似小鼠的致病性有一定差異(Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ組的小鼠全部死亡或發(fā)生腹瀉，Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ組均有1只小鼠無癥狀，而且死亡和腹瀉的小鼠數(shù)量不同)，說明該地區(qū)大腸埃希菌的致病性存在差異。

病原菌對抗生素的耐藥情況日趨嚴重，特別是多重耐藥大腸埃希菌的大量出現(xiàn)使臨床防治變得愈加困難[19-21]。本研究對分離的21株致病性大腸埃希菌進行耐藥性試驗發(fā)現(xiàn)，甘肅地區(qū)羊源致病性大腸埃希菌的耐藥情況嚴重，普遍出現(xiàn)多重耐藥，對紅霉素、鏈霉素、克林霉素等有較高的耐藥性(超過76%)，而且對桿菌肽、青霉素表現(xiàn)出接近100%的耐藥性；說明這些羊場可能對抗生素的選用存在問題。細菌耐藥性形成的主要原因是長期使用同類抗生素和濫用抗生素[19, 22]；因此，合理、規(guī)范并且交替更換使用抗生素才能對羔羊腹瀉發(fā)揮有效的防治作用。

4 結(jié) 論

通過對甘肅部分地區(qū)引起羔羊腹瀉的病原進行分離鑒定，分離出21株致病性大腸埃希菌，說明大腸埃希菌仍然是該地區(qū)引起羔羊腹瀉的主要病原之一；對分離的菌株進行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)的羊源致病性大腸埃希菌對多種抗生素具有耐藥性，而且多重耐藥情況嚴重。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Identification and Drug Resistance Analysis ofEscherichiacoliIsolated from Diarrheic Neonatal Lambs in Gansu Area

TUO Xin, WANG Shengyi, WANG Hui, CUI Dong’an, HUANG Meizhou and LIU Yongming

(Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province / Engineering & Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutics Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730050,China)

The objective of the study was to research the pathogenesis and drug resistance ofEscherichiacoliin diarrheic neonatal lambs in Gansu area.The 92 feces samples were collected from 8 lamb farms in Gansu province, where the lambs appeared diarrhea symptoms.The pathogenicE.coliwas isolated and identified using amplification technology of 16S rDNA and microbial cultivation methods and 6 strains were selected randomly to conduct pathogenicity and drug resistance test.The results showed that 21 pathogenicE.colistrains were isolated from 92 samples; the 6 strains selected randomly possessed of certain pathogenicity; and these pathogenicE.coliin Gansu area had appeared high resistance to commonly used antimicrobial drugs.The results suggested that theE.coliwas still the etiology of the diarrheic neonatal lambs in Gansu area and with very serious drug resistance.

Neonatal; Diarrhea;E.coli; Pathogenicity; Drug resistance.

TUO Xin, male, master student.Research area: prevention and treatment diarrhea of lambs.E-mail:tuoxin232@163.com

LIU Yongming, male, research fellow.Research area: animal nutrition and metabolic diseases.E-mail:myslym@sina.com

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1005.004.html

2016-03-15

2016-04-28

公益性行業(yè)專項課題(20130304-17)；國家科技支撐計劃(2012BAD12B03)。

妥 鑫，男，碩士研究生，研究方向為羔羊腹瀉病與防治。E-mail:tuoxin232@163.com

劉永明，男，研究員，研究方向為動物營養(yǎng)與代謝病。E-mail: myslym@sina.com

S857.3+1

A

1004-1389(2017)02-0167-06

Received 2016-03-15 Returned 2016-04-28

Foundation item The Special Found for Agro-scientific Research in the Public Interest(No.20130304-17); the National Key Technology Research and Development of the Ministry of Science and Technology of China(No.2012BAD12B03).