劉 迪，楊明英，朱良均

（浙江大學(xué) 應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

絲素蛋白抗凝血材料的改性研究進展

劉 迪，楊明英，朱良均＊

（浙江大學(xué) 應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

絲素蛋白是一種具有良好生物相容性的天然高分子材料，被廣泛應(yīng)用于藥物控釋、組織工程、細(xì)胞培養(yǎng)支架等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。隨著絲素蛋白醫(yī)用材料的內(nèi)植性研究逐漸深入，絲素蛋白材料抗凝血性研究成為較為活躍的新興領(lǐng)域。本文重點概述了材料的抗凝血原理，并對絲素蛋白抗凝血的改性方法做了整理。

絲素蛋白材料；抗凝血；改性；醫(yī)用

傷口處血液在人體抗凝血機制的作用下會由流動態(tài)變?yōu)槟z態(tài)或固態(tài)，促進傷口快速愈合，從而不至于對人體造成太大傷害。但這一凝血機制有時會產(chǎn)生不良的現(xiàn)象，例如，它會在心腦血管等狹窄部位形成血栓，從而造成心肌梗塞、腦血栓等方面的疾病。隨著生物醫(yī)用材料尤其是內(nèi)植性醫(yī)用材料的迅速發(fā)展，如人工心臟、人造血管、與心血管直接接觸的輔助裝置、功能性組織支架等，都要求與血液接觸后不能引發(fā)血液凝固和血栓形成。因此，如何提高生物材料的抗凝血性能成為內(nèi)植性生物醫(yī)用材料非?；钴S的研究領(lǐng)域。

絲素蛋白是一種天然高分子蛋白纖維，與人工合成高分子材料相比，有良好的生物相容性，透氣透水性和形態(tài)可塑性，同時具有一定的生物降解性［1，2］，近年來，絲素材料作為酶固定化基質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)基，藥物釋放，人工角膜，韌帶、骨兼容材料等生物內(nèi)植性材料的研究越來越多，研究人員對絲素蛋白材料的抗凝血性能提出更嚴(yán)格的要求，國內(nèi)外學(xué)者也采用某些方法，如接枝或共混等，對絲素蛋白材料進行改性以附加給絲素蛋白材料良好的抗凝血性能。本文主要從絲素蛋白材料肝素化改性、磺酸化修飾和中草藥活性成分接枝等方面探討絲素蛋白抗凝血材料的研究進展。

1絲素蛋白抗凝血材料的肝素化改性研究

1.1接枝肝素法

肝素分子中葡糖胺單元帶有-NH-SO3-基團，此基團帶有大量的負(fù)電荷，可以與凝血酶中帶正電的基團發(fā)生特異結(jié)合，從而使凝血酶失活，進而抑制凝血過程［3，4］。

葉勇等［5］采用等離子體處理技術(shù)，利用交聯(lián)劑戊二醛將肝素分子接枝到絲素蛋白膜材料的表面，對其進行抗凝血修飾。體外凝血試驗結(jié)果表明，肝素-絲素膜具有較強的抗凝血活性，凝血時間被明顯延長。

楊新林等［6］在肝素-絲素蛋白共混膜表面引入活性基團-NH2，然后將抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）共價結(jié)合到共混膜表面，結(jié)果顯示將肝素和AT-Ⅲ同時混合使用，即使在兩者濃度很低的情況下，抗凝血效果仍有很大提高，說明兩者之間可能產(chǎn)生協(xié)同作用，大大加強了材料的抗凝血效果。

1.2絲素-肝素共混材料

許海葉等［1］以非水溶性絲素粉為載體，將肝素-聚氨酯溶液與絲素粉共混，制備出載有肝素的絲素-聚氨酯共混膜，絲素蛋白材料本身就具備良好的吸附和緩釋功能，保證了肝素可以從共混膜中緩慢釋放出來，達(dá)到相對長效的抗凝血效果。紅外測試結(jié)果顯示，三者共混物沒有任何新的官能團出現(xiàn)，說明三者是以共混形式存在，確保了肝素的活性及其性能的正常發(fā)揮。

佘振定等［7］利用冷凍干燥法，將肝素加入到絲素蛋白-殼聚糖溶液中制備出包埋肝素的絲素蛋白-殼聚糖復(fù)合支架，多孔的支架結(jié)構(gòu)不僅為肝素的儲存提供充分的空間，而且有利于肝素緩慢地從支架中釋放出來，從而使絲素蛋白-殼聚糖-肝素復(fù)合支架材料具有相對長效的抗凝血性。一般認(rèn)為絲素蛋白、殼聚糖、肝素都是具有良好親水性能的物質(zhì)，優(yōu)良的親水性可促進細(xì)胞在生物材料上黏附，同時降低血小板黏附，延遲凝血現(xiàn)象。

1.3絲素-肝素納米纖維材料

近年來，靜電紡絲技術(shù)形成的納米到微米級纖維材料，因具有超高孔隙率和良好的吸附、緩釋功能受到研究者的青睞，王曙東等［8］利用靜電紡絲技術(shù)制備絲素-肝素納米纖維支架，得到的絲素納米纖維支架經(jīng)肝素修飾后，其親水性和電負(fù)性更高，具有更好的抗凝血性能。

2絲素蛋白抗凝血材料的黃酸化改性研究

2.1絲素蛋白材料硫酸化

葡糖胺單元中含有的-NH-SO3-基團可阻礙凝血因子形成，是肝素類藥物抗凝血作用的主要活性基團，因此，研究者設(shè)想在其他生物材料中引入該活性基團，那么材料就可能具備抗凝血功能［9，10］。

Tamada Y［11］用濃硫酸或氯磺酸處理絲素蛋白材料引入硫酸基團，并在后續(xù)研究中，使用氯化硫酸代替濃硫酸，絲素抗凝血液活性提高約100倍。在進一步的研究中，尹桂波等［12］發(fā)現(xiàn)硫酸化絲素對絲素分子結(jié)晶區(qū)的完整性并沒有產(chǎn)生影響，并通過結(jié)晶作用使絲素和硫酸化絲素形成復(fù)合物，避免了有害化學(xué)試劑的使用，且產(chǎn)物的抗凝血效果良好。

2.2絲素蛋白材料磺酸化

用SO2和NH3等離子體對絲素蛋白膜表面進行磺酸化修飾，磺酸基團與凝血因子產(chǎn)生相互作用，從而抑制凝血因子的活性，使材料具有了抗凝血活性［13］。

SO2等離子體改性生物材料是一種有效的磺酸化方法，顧晉偉等［14］利用SO2射頻等離子體技術(shù)處理絲素材料，實驗證明接枝后絲素獲得了顯著的抗凝血效果。李少彬等［15］采用SO2低溫等離子體技術(shù)處理表面涂覆絲素蛋白膜的聚四氟乙烯小口徑人工血管用，獲得表面含有大量磺酸基的人工血管，體外實驗表明小口徑人工血管抗凝血性能良好。

2.3接枝褐藻多糖硫酸酯

褐藻多糖硫酸酯是一種含有硫酸基的特殊多糖，是目前研究較多的抗凝血劑之一。一方面褐藻多糖硫酸酯帶有的硫酸基與HCⅡ結(jié)合，硫酸基-HCⅡ復(fù)合物又與凝血酶結(jié)合，阻礙了凝血酶的活性，另一方面褐藻多糖硫酸酯也能夠結(jié)合在纖維蛋白原的堿性氨基酸殘基如精氨酸或賴氨酸上。最終兩者的協(xié)同作用既增強HCⅡ?qū)δ傅臏缁钭饔糜忠种评w維蛋白原的凝結(jié)，達(dá)到延長凝血時間的目的［16］。

程忠玲［4］利用戊二醛作為交聯(lián)劑，將氨基化的褐藻多糖硫酸酯固定在絲素膜表面。體外凝血實驗評價其抗凝血活性，結(jié)果表明接枝絲素膜的部分凝血活酶時間和凝血酶時間比未處理的純絲素膜凝血時間延長35 s［17］。

3接枝中藥活性成分

川芎嗪（2，3，5，6-四甲基吡嗪），是活血化淤中草藥川芎的主要有效成份之一，連小潔等［18］嘗試用川芎嗪及其衍生物對絲素進行改性。結(jié)果表明，改性后的絲素使部分凝血活酶時間延長，同時在富血小板血漿中培養(yǎng)30min后未發(fā)現(xiàn)有黏附的血小板，說明川芎嗪衍生物改性絲素材料的體外抗凝血活性有所改善。為了提高接枝材料的穩(wěn)定性，在后續(xù)研究中將川芎嗪結(jié)構(gòu)修飾得到的絲素化合物接枝到聚丙烯酸上，然后與絲素共混制備共混膜，同樣獲得了抗凝效果不錯的抗凝血材料。

Song W等［19］將原兒茶醛接枝聚合在絲素蛋白表面，改性后的絲素蛋白材料抗凝血性能有了明顯提高，而且細(xì)胞親和力得到增強。

4其他

vWf是具有活化凝血酶作用的活化因子，高運華等［20］采用vWf因子的抗體對絲素蛋白膜進行表面改性。體外凝血檢測結(jié)果表明部分凝血活酶時間和凝血酶時間分別超過150 s和200 s。這是由于固定在絲素材料表面的vWf抗體可與血漿中的vWf因子發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，從而消除了vWf因子對凝血因子Ⅷ的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致了血液凝固過程的延遲。

水蛭素是一種凝血酶特異性抑制劑，可以與凝血酶直接結(jié)合而發(fā)揮抗凝血作用，同時能抑制血小板對纖維蛋白原的作用，延長凝血時間，從而產(chǎn)生抗凝作用。Sun D［21］等水蛭素改性PEG-DE交聯(lián)絲素蛋白膜，可以抑制血小板黏附，大大改善其抗凝血性能。

5展望

近年來，絲素蛋白材料因具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)由傳統(tǒng)紡織逐步發(fā)展到生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。與人工合成材料相比，絲素蛋白天然材料具有更加優(yōu)越的生物相容性，應(yīng)用于人工血管、人工心臟等內(nèi)植性組織有更大優(yōu)勢。綜上，為了進一步提高材料的血液相容性和體內(nèi)穩(wěn)定性，研究者對絲素蛋白材料進行各種修飾，使本來沒有抗凝血性能的絲素蛋白材料具備了抗凝血性，大大拓寬了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，并將逐步解決絲素蛋白作為內(nèi)植性材料出現(xiàn)的各類問題。血液凝固是非常復(fù)雜的過程，還需深入研究材料與血液接觸后的內(nèi)在結(jié)構(gòu)與表觀現(xiàn)象的變化，以及各個過程復(fù)雜的凝血機理，才能更有針對性地改性抗凝血絲素蛋白材料。相信隨著科研人員對抗凝血機制的不斷探索，改性后的絲素蛋白生物材料將克服作為醫(yī)用材料遇到的凝血類瓶頸問題，發(fā)揮更大的應(yīng)用潛能。

［1］ 許海葉，楊紅軍，王維慈，等.肝素化絲素/聚氨酯共混膜的制備及其緩釋性能［J］.武漢科技學(xué)院學(xué)報，2008，21（7）：1-5.

［2］ 李圣春.硫酸化絲素抗凝血的研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2010.

［3］ 李少彬，閆玉生，李輝，等.等離子體磺酸化絲素蛋白膜聚四氟乙烯復(fù)合小口徑人工血管的制備［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（8）：1357-1360.

［4］ 程忠玲，邵建明.抗凝血絲素蛋白材料的研究進展［J］.材料導(dǎo)報，2005，19（專輯V）：363-365.

［5］ 葉勇，張劍韻，黃龍全.絲素膜表面接枝肝素分子的反應(yīng)條件與體外抗凝血作用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（1）：74-78.

［6］ 楊新林，吳克友，于群，等.肝素共混絲素蛋白膜上AT-Ⅲ的固定化及其體外抗凝血性能［J］.北京理工大學(xué)學(xué)報，2004，24（9）：837-840.

［7］ 佘振定.基于絲素蛋白/聚糖的肝組織工程支架材料研究［D］.北京：清華大學(xué)，2009.

［8］ 王曙東，張幼珠.絲素納米纖維支架的修飾及其血液相容性［J］.紡織學(xué)報，2011，32（3）：10-14.

［9］ 尹桂波，張幼珠.氯磺酸對絲素的硫酸化及其抗凝血性［J］.現(xiàn)代絲綢科學(xué)與技術(shù)，2004（2）：16-19.

［10］TAKAHARA J I，HOSOYA K，SUNAKO M，et al.Antico?agulant activity of enzymatically synthesized amylose de?rivatives containing carboxy or sulfonate groups［J］.Acta Biomaterialia，2010，6（8）：3138-3145.

［11］TAMADA Y.Sulfation of silk fibroin by chbrosulfonic ac?id and the anticoagulant ativity［J］.Biomaterials，2004，25（3）：377-383.

［12］李圣春.硫酸化絲素抗凝血的研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2010.

［13］尹桂波，張幼珠.氯磺酸對絲素的硫酸化及其抗凝血性［J］.國外絲綢，2004（2）：15-18.

［14］GU J，YANG X，WANG L，et al.Surface sulfonation of silk fibroin film by plasma treatment and in vitro anti?thrombogenicity study［J］.Materials Science&Engineer?ing C，2001，20（1）：199-202.

［15］李少彬，閆玉生，李輝，等.等離子體磺酸化絲素蛋白膜聚四氟乙烯復(fù)合小口徑人工血管的制備［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（8）：1357-1360.

［16］馬西蘭，曹傳寶，袁媛，等.磺化絲素-PVA復(fù)合膜材料的合成及其體外抗凝血性能研究［C］.中國材料研討會，2002.

［17］鄭軍，夏明.褐藻糖膠抗血栓研究進展［J］.中國海洋藥物，2002，21（2）：53-59.

［18］連小潔，王松，朱鶴孫.川芎嗪衍生物改性絲素材料體外抗凝血性研究［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報（工學(xué)版）2009，30（1）：134-138.

［19］WANG Song，GAO Zhen，LI Er-lin，et al.The applica?tion with protocatechualdehyde to improve anticoagulant activity and cell affinity of silk fibroin［J］.Applied Sur?face Science，2008，255（2）：486-488.

［20］高運華，楊新林，范翠紅，等.絲素蛋白膜上vWf抗體的固定化及其體外抗凝血性能［J］.高技術(shù)通訊，2003，13（3）：56-59.

［21］SUN D，WEI Y L，WANG Y，et al.Platelet Adhesion on the Silk Fibroin Material Surface［J］.Advanced Materials Research，2013，796：136-139.

The Progress in the Research of Modified Silk Fibroin-Based Anticoagulant Materials

LIU Di,YANG Ming-ying,ZHU Liang-jun＊
（Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Silk fibroin,as a good natural biomacromolecular with desirable mechanical properties and biocompatibility, is widely used in biomedical fields including drug controlled release,tissue engineering and cell culture scaffold.With the deeper research of silk biomaterials in vivo,more and more attention focus on their anticoagulant property.This paper reviewed the anticoagulant principle of modified silk fibroin and discussed the prospect of their development.

silk fibroin;anticoagulation;modification;medicinal

R318.08

A

0258-4069［2017］01-007-04

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-22）

劉迪（1992-），山東濱洲人，女，碩士研究生。主要從事蠶絲生物材料研究。E-mail：canxueliudi@163.com

朱良均，男，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：ljzhu@zju.edu.cn