劉欣偉， 柳云恩， 王 宇

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 骨科 全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心，遼寧 沈陽 110016

·骨科專題·

Bruton酪氨酸蛋白激酶在創(chuàng)傷性休克誘發(fā)的全身炎癥反應中研究與思考

劉欣偉， 柳云恩， 王 宇

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 骨科 全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心，遼寧 沈陽 110016

Bruton酪氨酸蛋白激酶； 創(chuàng)傷性休克； 全身炎癥反應綜合癥； 多器官功能障礙綜合征； 膿毒癥

Bruton′s tyrosine kinase; Traumatic shock; Systemic inflammatory response syndrome; Multiple organ dysfuction syndrome; Pyohemia

Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinase，Btk)是非受體酪氨酸蛋白激酶Tec家族成員之一，是Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路的一個重要信號分子，但其在體內炎癥反應中的作用仍知之甚少。由于TLRs信號通路在創(chuàng)傷后全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。Btk信號可能通過激活下游促炎性信號通路，參與創(chuàng)傷后全身炎癥反應和重要臟器損傷的發(fā)病過程。本研究對目前該領域的文獻進行回顧、分析并進行了思考，通過復制小鼠創(chuàng)傷性休克模型，觀察Btk激酶在各臟器中的表達及活化，并以腹腔巨噬細胞和肺泡巨噬細胞為研究對象，采用慢病毒載體RNA干擾方法研究Btk在內毒素誘導的MAPK和NF-κB活化及細胞因子表達中的作用；采用過繼巨噬細胞實驗研究Btk在創(chuàng)性休克誘發(fā)的全身炎癥反應和肺損傷中的作用和機制，這也許是一種可行的研究思路。本研究旨在加深對Btk的認識，與國內外先進理念接軌，從而為創(chuàng)傷后SIRS的防治提供新的思路。

創(chuàng)傷是重要的全球性公共衛(wèi)生問題，在美國及西方國家，創(chuàng)傷是1～44歲人群死亡的首位原因，在我國，創(chuàng)傷也是當今青壯年人群的第一位死亡原因[1]。低血容量循環(huán)衰竭是導致創(chuàng)傷患者傷后即刻死亡和早期死亡的的主要原因，而其誘發(fā)的SIRS、膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)則是創(chuàng)傷患者晚期死亡最重要的原因。創(chuàng)傷性休克的防治一直是創(chuàng)傷急救領域的研究重點和熱點，其中，圍繞SIRS開展的創(chuàng)傷性休克的研究工作在世界各國廣泛地進行。失控的SIRS被認為是導致膿毒癥和MODS的主要致病機制，而SIRS與過量的炎性介質產生有關。然而，到目前為止，針對細胞因子等炎性介質的抗炎治療在SIRS、膿毒癥及MODS患者中進行的所有臨床研究均失敗了。研究炎性介質過度釋放的信號轉導機制，并對關鍵信號通路進行調控，對于阻斷創(chuàng)傷性休克失控性炎癥反應可能較針對某一單個炎癥介質更為有效。

TLRs是一類病原分子識別受體家族，其不僅能識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，其某些成員，尤其是TLR4也可識別無菌性損傷后釋放的眾多內源性分子即損傷相關分子模式(DAMPs)。外源脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或內源性配體與TLR4結合后，活化MyD88和TRIF兩條信號途徑，前者活化NF-κB和MAPK信號通路，后者活化NF-κB和干擾素調節(jié)因子3信號通路。TLR4通過這些信號途徑誘導產生一系列的炎癥介質，包括細胞因子、趨化因子等，從而產生強有力的炎癥和免疫反應。通過調控TLRs信號轉導通路可調節(jié)炎性免疫反應，干預膿毒癥的發(fā)展。近年來，有研究表明，TLR4及其信號通路介導的天然免疫在創(chuàng)傷后局部和全身炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)過程中具有重要作用[2]。在失血性休克、股骨骨折、創(chuàng)傷性休克等動物模型中，TLR4在局部炎癥反應、遠隔臟器損傷、全身炎癥反應中發(fā)揮了重要作用。TLR4在膿毒癥病理生理過程中的重要作用提示，針對TLR4可能形成抗炎治療靶點。然而，近年來的臨床研究結果表明，應用TLR4特異性拮抗劑TAK-242(Ⅲ期臨床試驗)和E5564(Ⅱ期臨床試驗)并不能從細胞因子水平降低嚴重膿毒癥患者的病死率[3-4]。進一步探索參與創(chuàng)傷性休克后SIRS發(fā)生的新的信號轉導機制，對膿毒癥和MODS的防治及提高創(chuàng)傷患者的存活率均具有重要意義。

Btk是胞漿非受體酪氨酸蛋白激酶Tec家族成員之一，是B淋巴細胞發(fā)育所必需的物質。Btk突變可致人X連鎖無丙種球蛋白血癥，患者體內缺乏抗體和成熟的外周B淋巴細胞[5]。Btk是第一個被發(fā)現(xiàn)的Tec激酶家族成員，該家族成員還包括Tec、Itk、Bmx及Txk，其結構與Src激酶家族類似，由PH結構域、Tec同源區(qū)、SH3、SH2及激酶結構域組成，其N端缺乏疏水性跨膜結構，而C端缺乏負性調節(jié)區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)，Btk是TLR4及TLR2、6、7、8、9等信號傳遞中的關鍵信號分子[6-7]。當LPS等TLRs配體作用于細胞時，Btk由胞漿迅速移位至胞膜并發(fā)生酪氨酸磷酸化而具有激酶活性，活化的Btk可磷酸化多個接頭蛋白，如MyD88、Mal/TIRAP、IRAK-1及TRIF，并與這些接頭分子相互作用形成復合體，復合體進一步募集下游信號分子TRAF6。在泛素連接酶UEVIA和UBCl3的催化作用下，TRAF6發(fā)生一系列的泛素化反應，支架蛋白TAB2和TABl介導TRAF6向下傳導信號[8-10]。通過上述機制，Btk可增強TLR信號轉導并最終激活NF-κB和MAPKs信號通路，繼而啟動炎性基因表達[11]。有研究表明，Btk基因突變或缺失的單核/巨噬細胞、肥大細胞和外周血單個核細胞對LPS刺激不敏感，TNF-κ、IL-1κ和iNOS表達明顯下降，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Btk對細胞因子表達的調控作用主要是通過NF-κB和p38激酶介導的[12-16]。

雖然體外研究證實，Btk在LPS/TLR4信號轉導中具有重要地位，但體內研究卻顯示內毒素血癥時，Btk基因缺陷小鼠病死率不僅沒有預期下降，反而明顯增加，同時伴有IL-10合成減少，IL-6水平升高[17-18]。造成體外與體內研究結果截然相反的原因，筆者推測可能主要是由于Btk(-)小鼠體內缺乏LPS天然IgM抗體，從而導致LPS清除障礙，LPS作用被持續(xù)放大[17]；其次可能是由于Btk(-)小鼠缺乏B淋巴細胞，從而導致IL-10產生不足，間接導致IL-6水平升高，造成炎癥失控。有研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細胞TLR4信號通路活化后可產生大量IL-10，從而抑制促炎性細胞因子的產生，在天然免疫中發(fā)揮重要的調理作用[19]；另外，也可能是由于Btk基因和Tec家族其他成員基因之間具有明顯的冗余和代償功能[20]，導致Btk(-)小鼠無法顯示表現(xiàn)型，從而掩蓋了Btk的真實作用。Btk(-)基因敲除小鼠的這些先天性內在缺陷，可能是導致當前未見文獻報道利用Btk(-)小鼠進行膿毒癥研究的原因。目前，關于Btk信號通路與炎癥關系的研究仍多限于體外觀察，在體內炎癥反應中的調控作用仍知之甚少。

與其他炎性信號分子如TLR4、NF-κB、MAPKs及細胞因子等廣泛分布表達于體內各種不同類型細胞不同，Btk的細胞表達譜較窄，僅限于髓系細胞，包括B淋巴細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞及肥大細胞，但不表達于T淋巴細胞[21]。Btk基因缺失的單核/巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及B淋巴細胞與野生型比較，在體外并未表現(xiàn)出增殖抑制和凋亡易感性增加[22]。這些提示，抑制Btk信號對機體免疫功能的不利影響可能遠低于抑制其他信號分子的影響。鑒于Btk信號在啟動細胞免疫炎性反應的重要性及其在炎性細胞中的特異性表達，Btk很可能是創(chuàng)傷性休克時SIRS、膿毒癥及MODS的理想干預靶點。

膿毒癥所致的MODS中，肺是最早發(fā)生衰竭的器官，表現(xiàn)為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)。ALI以炎性介質過度分泌、炎性細胞大量浸潤、肺血管內皮細胞及肺泡上皮細胞廣泛損傷為病理特征，臨床表現(xiàn)為急性呼吸窘迫、難治性低氧血癥及非心源性肺水腫，是導致膿毒癥患者死亡的主要原因。肺泡巨噬細胞是肺固有的巨噬細胞，約占肺巨噬細胞總數(shù)的80%，與肺間質巨噬細胞及其他臟器固有的巨噬細胞，如肝Kupffer細胞不同，其處于肺泡腔內，肺泡壁將其與循環(huán)系統(tǒng)隔離出來。肺泡巨噬細胞活化可分泌大量炎性介質，并啟動循環(huán)單核/巨噬細胞及多性核中性白細胞向肺內浸潤。肺泡巨噬細胞在肺內炎癥反應的啟動和加劇過程中發(fā)揮了重要作用，是參與ALI發(fā)生的關鍵效應細胞。由于炎癥反應是ALI發(fā)病的病理生理學基礎，Btk作為眾多炎性介質合成與釋放的重要上游信號轉導通路，可能在創(chuàng)傷后肺泡巨噬細胞活化及ALI的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

筆者認為，為了尋找更高效、具有特異性的抗炎靶點以防治失控性SIRS，可以研究Btk信號通路在創(chuàng)傷性休克時全身炎癥反應及急性肺損傷發(fā)病中的作用和機制。通過建立小鼠創(chuàng)傷性休克模型，觀察Btk激酶在各臟器中的表達及活化情況，并采用Btk特異性抑制劑LFM-A13進行體內干預實驗，以探討其在全身炎癥和臟器損傷中的作用，這將是一個較好的研究切入點。

另外，由于單核/巨噬細胞是參與創(chuàng)傷膿毒癥時全身炎癥反應的主要效應細胞，肺固有的肺泡巨噬細胞也在膿毒癥ALI發(fā)生中起著至關重要的作用，為闡明Btk信號分子作用機制，也以分離培養(yǎng)的腹腔巨噬細胞及肺泡巨噬細胞為研究對象，采用慢病毒載體RNA干擾方法研究Btk在內毒素誘導的MAPK和NF-κB活化及細胞因子表達中的作用。為了進一步明確Btk在創(chuàng)傷性休克誘發(fā)的全身炎癥反應及急性肺損傷中的特異性作用和機制，有必要采用分子生物學手段阻斷體內Btk活化，但由于Btk表達局限于炎性細胞，而炎性細胞在活體內尚無法像上皮細胞一樣進行轉染，為此可以將體外轉染了RNA干擾慢病毒載體的腹腔巨噬細胞和肺泡巨噬細胞分別進行全身的過繼細胞免疫治療實驗，以達到高效特異性阻斷體內巨噬細胞及肺泡巨噬細胞Btk活化的目的。

通過結合體內和體外實驗，采用RNA干擾、慢病毒載體轉染、Western blotting，EMSA、real time PCR等手段，深入研究Btk信號通路在創(chuàng)傷性休克時全身炎癥反應及急性肺損傷中的作用及分子機制，這將有助于闡明嚴重創(chuàng)傷后失控性炎癥反應的發(fā)生機制，為創(chuàng)傷后膿毒癥和多臟器功能衰竭的防治提供新的思路和線索。

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國家自然科學基金(81401586)

劉欣偉(1979-)，男，黑龍江哈爾濱人，副主任醫(yī)師，博士

王 宇，E-mail：deformitya@126.com

2095-5561(2017)03-0145-03 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.03.05

2016-12-22