楊 毅，陶 權(quán)，梁 英，李成樂(lè)，李 躍，馬效芳

(1．四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065；2．四川省交通運(yùn)輸廳公路規(guī)劃勘察設(shè)計(jì)研究院，成都 610041)

水環(huán)境污染主要來(lái)自于點(diǎn)源和面源兩種不同類型的污染源排放，點(diǎn)源污染被逐漸控制之后，面源污染已成為水環(huán)境污染的關(guān)鍵因素，由其所導(dǎo)致的水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象，已嚴(yán)重威脅著水環(huán)境生態(tài)安全[1-3]。近年來(lái)，伴隨著我國(guó)城市內(nèi)澇現(xiàn)象的頻發(fā)，城市面源污染問(wèn)題也逐漸成為人們普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外都對(duì)城市的面源污染開(kāi)展了研究工作，發(fā)現(xiàn)我國(guó)城市由于降雨徑流沖刷造成的污染相比于國(guó)外更加嚴(yán)重[4, 5]，其攜帶的污染物對(duì)受納水體的污染貢獻(xiàn)相當(dāng)大[6, 7]。特別是我國(guó)大中型城市降雨徑流中NH+4-N污染惡化趨勢(shì)十分明顯[8-11]，成為普遍和突出的水質(zhì)污染問(wèn)題之一。

人工濕地、生物滯留池和生物濾池等基于生態(tài)工程的水處理系統(tǒng)被越來(lái)越多地被應(yīng)用于城市面源氮素污染的處理[12]，此類系統(tǒng)去除N的主要方式包括微生物代謝和植物吸收[13]。 張榮社等[14]通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)人工濕地的脫N效果發(fā)現(xiàn)植物對(duì)N的吸收量有限。Geronimo等[15]研究結(jié)果表明生物滯留池中植物對(duì)N的吸收并不是去除N的主要途徑。但是也有報(bào)道證明植物的直接吸收對(duì)N的去除起到重要作用[16]。張鴻[17]等則發(fā)現(xiàn)人工濕地中植物不僅可以直接吸收N，其根系分泌物還可以促進(jìn)嗜N菌的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)N的釋放轉(zhuǎn)化。根際微生物數(shù)量也與培養(yǎng)液中N的濃度和植物生物量有關(guān)[18]。植物還能通過(guò)莖葉將光合作用產(chǎn)生的氧氣一部分輸送到根區(qū)部位[19]，使根系微環(huán)境存在好氧和缺氧環(huán)境，從而使微生物提高反硝化作用[20]。Hatt[21]和Henderson[22]等研究發(fā)現(xiàn)在生物滯留池對(duì)N的去除過(guò)程中，植物和微生物起到關(guān)鍵的作用，缺少植物和微生物，滯留池內(nèi)的填料可能成為一個(gè)不斷釋放污染物的污染源。Payne[23]等分析了生物濾池里影響N循環(huán)的主要因素，發(fā)現(xiàn)植物-微生物的相互作用以及植物根系的形態(tài)是影響N去除的關(guān)鍵因素。

微生物過(guò)程被認(rèn)為是生態(tài)工程水處理系統(tǒng)中脫N尤其是去除NH+4-N的原動(dòng)力，永久去除N主要依靠硝化-反硝化途徑[13, 14, 24]，但是傳統(tǒng)的自養(yǎng)硝化、厭氧反硝化理論不足以解釋復(fù)雜環(huán)境下N的遷移轉(zhuǎn)化問(wèn)題，異養(yǎng)硝化、好氧反硝化的發(fā)現(xiàn)提供了新的理論補(bǔ)充。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，環(huán)境中微生物的研究方法已經(jīng)跳出了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)限制[25]。宏基因組作為一種分子生物學(xué)新技術(shù)，能夠更全面、更深入地解析微生物群落結(jié)構(gòu)[26]，盡可能真實(shí)地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性。由于宏基因組技術(shù)數(shù)據(jù)量龐大，需要高通量測(cè)序技術(shù)作為依托[27]。目前普遍應(yīng)用的高通量測(cè)序技術(shù)主要有Roche/454焦磷酸測(cè)序、ABI/SOLiD連接酶測(cè)序和Illumina/ Solexa聚合酶合成測(cè)序[28, 29]。

微生物和植物是生態(tài)工程水處理系統(tǒng)中非常關(guān)鍵的部分，在對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的去除中起到了至關(guān)重要的作用，但以往的研究對(duì)于N在包含植物、微生物的完整生態(tài)體系各部分中遷移轉(zhuǎn)化的定量研究需要拓展，從而進(jìn)一步了解微生物、植物對(duì)于N去除和利用的貢獻(xiàn)。過(guò)去對(duì)于植物-微生物系統(tǒng)中微生物研究的尺度與深度不夠，本文借助高通量宏基因組Solexa聚合酶合成測(cè)序技術(shù)研究了該系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)，旨在分析微生物與植物在系統(tǒng)中的聯(lián)合作用機(jī)理，為強(qiáng)化生態(tài)工程水處理系統(tǒng)的水質(zhì)凈化效果積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物和微生物

選用植物為具有良好抗?jié)?、抗旱性的混播草。微生物?lái)自于植物根系及周圍的土壤。

1.1.2 液體培養(yǎng)基

雨水中COD含量普遍較高[30]，采用葡萄糖模擬雨水COD的方法，添加的葡萄糖濃度為500 mg/L，對(duì)應(yīng)COD濃度為533 mg/L；植物需求營(yíng)養(yǎng)成分按霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[31]配制；根據(jù)成都市土壤中有效磷的含量(7.35 mg/kg)以及土壤容重(1.4 g/cm3)得到土壤總磷的含量為10.29 mg/L。最終液體培養(yǎng)基的主要成分與質(zhì)量濃度：葡萄糖，500 mg/L；CaCl2，184.96 mg/L；KCl，124.25 mg/L；MgSO4，80.24 mg/L；KH2PO4，45.36 mg/L；FeCl3·6H2O，1.62 mg/L。

1.1.3 微生物抑制劑

分別將80、100萬(wàn)單位(1單位=1 μg)的青、鏈霉素溶液溶解到500 mL容量瓶里，再分別取31.25、25 mL上述溶液至500 mL容量瓶中，配制成濃度為10 萬(wàn)單位/L的微生物抑制劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)200、400、600 mg/L 3種不同NH+4-N濃度下的培養(yǎng)液，共設(shè)計(jì)4個(gè)大組，植物+微生物、植物、微生物和空白組。空白組只設(shè)計(jì)NH+4-N濃度為400 mg/L的裝置，其余組各下設(shè)3種不同NH+4-N濃度的裝置。實(shí)驗(yàn)裝置塑料杯上、下底直徑及高分別為9.5、6.7和6.5 cm，用錫箔紙將塑料杯包裹，所有裝置均放置于室內(nèi)，并保證有足夠的自然光照。為了減少溶液的揮發(fā)，塑料杯上裝有不透光的杯蓋，植物根系可以穿過(guò)杯蓋浸泡在培養(yǎng)液中。

各組別塑料杯中加入的物質(zhì)與含量如表1所示。加入的微生物取自由土壤浸泡液制成的微生物懸浮液，液體培養(yǎng)基與微生物懸浮液的體積比為9∶1；微生物抑制劑青霉素和鏈霉素溶液各加入5 mL；植物取樣后用超純水反復(fù)對(duì)根系沖洗并用液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)植物一周，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的65 h再放入到裝置里。每隔一定時(shí)間向裝置里加入適量純水，以保持溶液體積的恒定。

表1 各組加入的物質(zhì)及含量Tab.1 Material and content of each group

1.2.2 取樣方法

實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2016年1月12日-2016年3月16日，總計(jì)1 536 h(64 d)。培養(yǎng)液中NH+4-N、NO-3-N、NO-2-N的測(cè)定采用耗竭法，NH+4-N采樣時(shí)間分別為3、20、45、96、138、187、307、1 128、1 536 h，NO-x-N采樣時(shí)間為307、1 128、1 536 h，每次取5 mL的培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后測(cè)定，最后數(shù)據(jù)處理時(shí)需要從N的減少量中扣除取樣造成的損失，植物體TN、微生物濕重測(cè)定需等實(shí)驗(yàn)結(jié)束后方能開(kāi)始。

1.2.3 高通量測(cè)序樣品預(yù)處理

對(duì)NH+4-N濃度為400 mg/L的微生物、空白組水樣進(jìn)行處理，混勻原始樣品，樣品足夠時(shí)，取4 mL液體樣品，分多次加入滅菌的2 mL離心管中，10 000 rpm室溫離心3 min，棄置上層液體，倒置離心管于吸水紙上，直至沒(méi)有液體流出；樣品不足4 mL就全部離心。

1.3 分析項(xiàng)目與檢測(cè)方法

1.3.1 主要指標(biāo)測(cè)定

NH+4-N：參照《水質(zhì)氨氮的測(cè)定水楊酸分光光度法(HJ 536-2009)》；植物體TN測(cè)定方法：采用濃硫酸-過(guò)氧化氫消煮，過(guò)硫酸鉀氧化吸光光度法測(cè)定[32]；微生物重量采用濕重法測(cè)定[33]；NO-x-N：參照瑞士萬(wàn)通792 Basic IC離子色譜儀使用說(shuō)明書(shū)；pH采用pHB-4便攜式pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定；溶解氧采用LDO便攜式溶氧儀(美國(guó)哈希)測(cè)定；鏡檢實(shí)驗(yàn)采用OLYMPUS CX41光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.2 高通量宏基因測(cè)序分析

1.3.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及DNA純化回收

本實(shí)驗(yàn)委托上海生工生物工程股份有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程為：采用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行提取基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。PCR第一輪擴(kuò)增，利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量，細(xì)菌擴(kuò)增V3-V4區(qū)域通用引物為341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)，真菌擴(kuò)增NS1-FUNG區(qū)域通用引物為NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和Fung(ATTCCCCGTTACCCGTTG)；第二輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。DNA純化回收，對(duì)于細(xì)菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)處理，對(duì)于真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段小于400 bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理。定量混合，利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測(cè)序，等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol。

1.3.2.2 基于Illumina平臺(tái)的16S rDNA、18S rDNA宏基因組測(cè)序

獲得DNA樣品后采用在Illumina Miseq平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序。細(xì)菌和真菌采用質(zhì)量控制軟件Prinseq，拼接軟件分別采用FLASH和PEAR對(duì)樣品去除引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列，完成對(duì)樣品序列的質(zhì)量控制。細(xì)菌質(zhì)量控制后序列長(zhǎng)度大部分分布在400～600 bp之間，平均長(zhǎng)度為440 bp以上，各樣本序列數(shù)均在500以上，滿足基本分析要求。細(xì)菌和真菌分別利用Mothur、Usearch軟件去除序列中的嵌合體。將多條序列按其序列間的距離，細(xì)菌通過(guò)Uclust軟件、真菌通過(guò)Usearch軟件進(jìn)行聚類分成操作分類單元(OTU)，相似度定為97%。對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類，采用軟件為RDP classifier，分類閾值為0.8。通過(guò)Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，衡量樣本物種多樣性以及組間樣本差別。

2 結(jié)果與討論

2.1 N在植物、微生物作用下的遷移轉(zhuǎn)化

2.1.1 不同組別pH值、溶解氧變化

各組別pH值隨時(shí)間的變化如圖1所示，隨著時(shí)間增加，除微生物組pH值在1 080 h(45 d)時(shí)有明顯上升外，所有組別pH值剛開(kāi)始都下降，而后逐漸趨于平緩，NH+4濃度的大小對(duì)pH值變化基本沒(méi)有影響。實(shí)驗(yàn)剛開(kāi)始由于液體培養(yǎng)基的pH值為6.37，微生物懸浮液pH值為8.07，造成微生物、植物+微生物組的pH值要明顯高于植物、空白組，但是隨著時(shí)間的增加，這種差距逐漸減小。

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，各組別溶解氧濃度隨時(shí)間的變化范圍較大。實(shí)驗(yàn)剛開(kāi)始18 h內(nèi)，含有微生物組別的溶解氧水平遠(yuǎn)低于不含微生物組別，65 h時(shí)恢復(fù)到和不含微生物的組別一樣的水平。添加植物后，植物、微生物、植物+微生物組溶解氧水平持續(xù)降低至185 h，且植物+微生物比微生物、植物組溶解氧降低更多，而后又開(kāi)始上升。

2.1.2 培養(yǎng)液中NH+4-N濃度隨時(shí)間的變化

各組別NH+4-N濃度隨時(shí)間的變化如圖3所示。所有組別均表現(xiàn)出剛開(kāi)始250 h內(nèi)快速降低，而后緩慢下降，且植物+微生物、植物組要比微生物、空白組降低更多且速率更快。NH+4-N初始濃度為200 mg/L時(shí)，植物+微生物、植物組約從200降至100 mg/L以下，而微生物組約從200降至150 mg/L左右；初始濃度為400 mg/L時(shí)，植物+微生物、植物組約從400降至150 mg/L左右，而微生物、空白組約從400降至250 mg/L左右；初始濃度為600 mg/L時(shí)，植物+微生物、植物組約從600降至250 mg/L左右，而微生物組約從600降至400 mg/L左右?？芍参?微生物、植物組隨著NH+4-N濃度的增加，其對(duì)NH+4-N的利用也越多。實(shí)驗(yàn)后期植物+微生物組培養(yǎng)液中NH+4-N濃度最低，其次為植物、微生物組，且植物+微生物組的NH+4-N仍有持續(xù)降低的趨勢(shì)，對(duì)NH+4-N的去除效率為：植物+微生物>植物>微生物。

圖1 培養(yǎng)液中pH值隨時(shí)間的變化 Fig.1 Changes of pH in the culture solution

圖2 培養(yǎng)液中溶解氧隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes of DO in the culture solution

圖3 培養(yǎng)液中NH+4-N濃度隨時(shí)間的變化 Fig.3 Concentration variation of NH+4-N in the culture solution

2.1.3 不同組別植物各部位對(duì)N的吸收利用

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)測(cè)定植物葉、莖、根含N量，與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)保存的植物原樣進(jìn)行對(duì)比，可知植物在不同NH+4濃度及微生物環(huán)境下對(duì)N的吸收利用效果。以往研究表明植物不同部位對(duì)N的積累量不同，盧少勇等[34]發(fā)現(xiàn)處于生長(zhǎng)期的植物，地上部N含量高于地下部，但是衰亡期N會(huì)轉(zhuǎn)移到地下部；也有研究[35]發(fā)現(xiàn)地上部對(duì)N的積累和地下部相等，所以有必要對(duì)混播草不同部位的含N量進(jìn)行測(cè)定。如圖4所示，所有組別的植物總N量均高于原樣，且植物+微生物含N量高于植物組，特別是NH+4-N濃度為200 mg/L的組別，植物+微生物含N量比植物組高13.8 mg/g。除此之外，植物各部位含N量的特點(diǎn)為：莖、葉含N量之和大于根含N量，N含量主要集中在莖、葉處。

圖4 植物各部位含N量 Fig.4 Content of N in different part of plant 注：圖中Z-400，Z代表植物，400代表NH+4濃度為400 mg/L，其他相同。

為考慮植物對(duì)N的吸收情況，結(jié)合植物原樣重量和含N量，植物各部位吸收N量如圖5所示，植物+微生物吸收量均大于植物組，特別是NH+4-N濃度為200 mg/L的組別，植物+微生物組對(duì)N的吸收多出4.48 mg，說(shuō)明微生物可以一定程度促進(jìn)植物對(duì)N的吸收利用。植物可以通過(guò)根系為微生物提供氧氣，同時(shí)根系分泌物也可作為微生物的碳源，為微生物生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的環(huán)境，同時(shí)微生物可以為植物提供各種形式的N，有利于植物的吸收，所以植物+微生物比單純的植物更能促進(jìn)N的轉(zhuǎn)化利用。

圖5 植物各部位吸收N量Fig.5 Content of the absorbed N in different part of plant

2.1.4 不同組別微生物對(duì)N的同化利用

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在微生物組培養(yǎng)液中觀察到了白色絮狀體，為衡量微生物同化作用對(duì)N的利用效果，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)通過(guò)濕重法得到微生物的重量，假設(shè)微生物干重∶濕重為1∶10，微生物細(xì)胞干重含N量為12.5%[36]，得到細(xì)胞含N量，視為微生物同化作用利用的N。如圖6所示，所有組別中均有微生物存在，且對(duì)所有不同NH+4濃度的組別，微生物濕重的大小依次為：植物+微生物>微生物>植物，微生物組中NH+4濃度為400 mg/L的組別中微生物生長(zhǎng)狀況最好。植物+微生物組中植物能為微生物提供附著場(chǎng)所和氧氣，植物可生成發(fā)達(dá)的根系形成巨大的表面積[24]且其在根系周圍形成根系生物圈增加微生物生物量[16]，所以微生物濕重值比微生物組高；植物組由于微生物抑制劑的作用，微生物生長(zhǎng)緩慢，所以濕重相對(duì)較低。

圖6 微生物的濕重 Fig.6 The wet weight of microorganism

2.1.5 不同組別微生物硝化/反硝化對(duì)N的利用

通過(guò)分析各組別NO-2、NO-3濃度隨時(shí)間的變化，可以得到微生物硝化甚至反硝化的能力。不同NH+4-N濃度下，培養(yǎng)液中NO+x含量隨時(shí)間的變化如圖7所示。在所有時(shí)間段各組別都檢測(cè)到了NO-2，NO-3在實(shí)驗(yàn)的后期被檢測(cè)到。13 d時(shí)所有組別都檢測(cè)到NO-2，濃度約為1～2 mg/L，NO-3只在NH+4-N濃度為200 mg/L的植物組少量檢測(cè)到，說(shuō)明具有硝化功能的微生物開(kāi)始作用；47 d時(shí)所有微生物組都檢測(cè)出了NO-3和NO-2，濃度分別約3～4和1～2 mg/L，NO-2相比之前略有增加。植物組NO-2濃度略微增加，但NO-3未被檢出，植物+微生物組與之相同，但在NH+4-N濃度為600 mg/L的組別檢測(cè)到少量NO-3，由于根系能夠利用NH+4和NO-3，從而可能導(dǎo)致有植物的組別NO-3幾乎沒(méi)有產(chǎn)生的假象；64 d時(shí)，除空白組外，其余組都檢測(cè)到NO-3和NO-2，微生物組兩者之和低于之前，而植物、植物+微生物組則相反其中NO-2濃度降低，NO-3增加，微生物組NO-3濃度的顯著降低預(yù)示了反硝化作用的存在，而植物、植物+微生物組NO-3增加可能是之前積累的NO-2通過(guò)微生物被氧化成NO-3?？傊囵B(yǎng)液中NO-x濃度復(fù)雜的變化現(xiàn)象預(yù)示了微生物、植物對(duì)N利用的活躍性。

圖7 不同NH+4-N濃度培養(yǎng)液中NOx-的變化 Fig.7 Concentration variation of NOx- in the different culture solution

2.1.6 N遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液各形態(tài)N濃度、植物體TN含量的測(cè)定，根據(jù)微生物含N量占其濕重的百分比估算其同化利用的N，由物料平衡[16]得到植物-微生物系統(tǒng)對(duì)N的轉(zhuǎn)化利用關(guān)系：培養(yǎng)液NH+4-N減少量=植物吸收N量+硝化作用生成NO-x-N+微生物同化作用利用N量+氨氮揮發(fā)量+反硝化利用N量，其中NH+4-N減少量已經(jīng)扣除了取樣造成的損失，由于冬季氨氮揮發(fā)速率相當(dāng)?shù)?，所以此?shí)驗(yàn)取氨氮揮發(fā)量為其減少量的1%[37, 38]。做出各組別N的遷移轉(zhuǎn)化，結(jié)果如表2所示，再做出各途徑所占百分比，如圖8所示。

通過(guò)分析表2可知，植物、微生物對(duì)NH+4-N濃度降低的貢獻(xiàn)大小依次為：植物+微生物>植物>微生物組，降低量分別為25.01～39.97、11.88～40.96、4.62～8.97 mg，對(duì)應(yīng)降低率為38.46%～55.39%、32.90%～37.22%和4.53%～12.83%。植物吸收N量大小順序?yàn)椋褐参?微生物>植物組，吸收量分別為8.18～8.69和4.21～8.59 mg，對(duì)應(yīng)吸收率為7.87%～19.24%、5.66%～11.66%。各組微生物硝化能力無(wú)法比較，因?yàn)楦鹘M存在的反硝化作用和植物對(duì)N的吸收利用會(huì)導(dǎo)致硝化作用產(chǎn)物的濃度降低，所以表中只列出了NO-x-N 的生成量。同化作用利用N能力的大小依次為：植物+微生物>微生物>植物組，利用量分別為2.12～3.78、1.64～2.29和1.13～1.49 mg。通過(guò)反硝化對(duì)N的去除能力大小：植物+微生物>植物>微生物組。

由圖8分析可知，在NH+4-N的轉(zhuǎn)化利用中，植物、植物+微生物組主要通過(guò)反硝化作用及植物的吸收利用來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中反硝化作用貢獻(xiàn)最大，為49%～79%，其次植物吸收為15%～37%；而微生物組主要通過(guò)反硝化和同化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，分別為51%～62%、26%～36%。

圖8 各途徑比例圖 Fig.8 The fate of N in different groups

2.2 植物-微生物系統(tǒng)去N機(jī)理

2.2.1 植物體凈重變化

通過(guò)測(cè)定植物凈重判斷不同組植物的長(zhǎng)勢(shì)。如圖9所示，經(jīng)過(guò)64 d的生長(zhǎng)，所有組別植物凈重均大于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)原樣凈重，增加了4～5倍，長(zhǎng)勢(shì)正常[20]。相同NH+4-N濃度下，植物組中植物凈重大于植物+微生物組。隨著NH+4-N濃度增加，植物+微生物組微生物濕重分別是植物組的2.52、2.53和1.84倍，吸收N量分別為2.06、0.99和1.31倍，植物吸收N量倍數(shù)并沒(méi)有隨著微生物濕重倍數(shù)升高而變大。蔣先軍等[39]在研究植物根系微生物硅酸鹽細(xì)菌的代謝產(chǎn)物對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用中發(fā)現(xiàn)，低濃度代謝物可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，而高濃度代謝物作用則相反，微生物可通過(guò)其分泌物抑制植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的有效吸收。

表2 各組N遷移轉(zhuǎn)化Tab.2 The migration and transformation of N in each group

圖9 不同組植物體烘干凈重 Fig.9 Dry weight of plant in different group

2.2.2 宏基因組測(cè)序

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有溶液均有白色絮狀物產(chǎn)生，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液中微生物進(jìn)行鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)微生物組含有大量的菌膠團(tuán)和有隔菌絲，空白組以絲狀菌和有隔菌絲為主，溫東輝[36]在模擬生物沸石柱處理雨水的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)沸石表面會(huì)出現(xiàn)以絲狀菌為主的白色絮狀物，并通過(guò)需N微生物純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硝化過(guò)程屬于異養(yǎng)硝化，起硝化作用的微生物包含真菌。

2.2.2.1 微生物種群多樣性分析

樣本中Coverage值體現(xiàn)了微生物測(cè)序后組裝得到的基因組序列占整個(gè)基因組的比例，如表3所示，本研究Coverage值均大于95%，能確保測(cè)序結(jié)果代表樣品中的微生物組成。豐富度指數(shù)ACE和Chao1值越大則群落豐富度越高；多樣性指數(shù)Shannon值越大則群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大則群落多樣性越低。從表中可以看出微生物組細(xì)菌豐富度和多樣性均高于空白組，微生物組真菌多樣性高于空白組，豐度則略低于空白組。與其他研究[25, 40]對(duì)土壤細(xì)菌的測(cè)試結(jié)果相對(duì)比可知，本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌種群豐度要高，而多樣性卻要低，可能由于培養(yǎng)液中較高的NH+4-N和葡萄糖濃度造成某些異養(yǎng)菌過(guò)度繁殖而自養(yǎng)菌卻無(wú)法生長(zhǎng)。就群落水平而言，種群多樣性高的群落包含更多具有不同生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性的種群，系統(tǒng)穩(wěn)定性更強(qiáng)[27]。

表3 不同樣本的Alpha多樣性Tab.3 Alpha diversity of the different samples

2.2.2.2 16S rDNA序列在門分類層面上的特征

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)從微生物組獲得17446條高質(zhì)量序列，從空白組獲得15936條高質(zhì)量序列，經(jīng)項(xiàng)目分析，得到微生物組細(xì)菌由16個(gè)門、105個(gè)屬組成，空白組細(xì)菌由13個(gè)門、66個(gè)屬組成。在門分類水平的序列數(shù)和相對(duì)豐度如表4所示。其中，微生物組優(yōu)勢(shì)類群為變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和藍(lán)藻門，相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的70.74%、26.72%、1.07%和0.95%；而空白組以變形菌門最為豐富，其次為酸桿菌門，分別占96.59%和2.97%。微生物測(cè)序結(jié)果和其他土壤類似，群落主要以變形菌門和酸桿菌門為主[25, 41]。另外，培養(yǎng)液較低的pH值也有利于某些酸桿菌的生長(zhǎng)。

2.2.2.3 16S rDNA序列在屬分類層面上的特征

深入解析植物-微生物系統(tǒng)的微生物種群結(jié)構(gòu)，揭示在N遷移轉(zhuǎn)化中起決定作用的細(xì)菌，將在屬分類水平相對(duì)豐度較大和兩組之間豐度存在顯著差異的菌種列出并進(jìn)行特征描述。如表5所示，可見(jiàn)微生物組優(yōu)勢(shì)菌屬為Burkholderia、Terriglobus、Rhodanobacter、Acidisoma和Rhizobium，相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的30.78%、26.02%、23.56%、9.64%和1.37%。其中Burkholderia、Rhodanobacter、Acidisoma和Rhizobium屬于變形菌門，Terriglobus屬于酸桿菌門。兩組中物種豐度較大的菌屬，Rhodanobacter、Burkholderia、Terriglobus和Acidisoma，多數(shù)可在pH值為3～6的酸性、偏鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，培養(yǎng)液低pH和高鹽環(huán)境決定了以上菌屬相比其他菌屬具有更顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。微生物組中優(yōu)勢(shì)菌屬基本上都屬于化能異養(yǎng)型；Rhodanobacter、Rhizobium、Psedomonas、Bacillus屬具有脫氮固氮功能，Nitrospira、Leifsonia、Afipia屬能夠?qū)喯跛嵫趸上跛帷?/p>

表4 細(xì)菌在門水平上的分布Tab.4 Taxonomic compositions of bacterial communitiesat the phylum level

菌種鑒定表明培養(yǎng)液中幾乎不存在硝化細(xì)菌，而培養(yǎng)液中又檢測(cè)到NO-3和NO-2，另外根據(jù)N在植物、微生物環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化關(guān)系可知，培養(yǎng)液中有相當(dāng)一部分N是通過(guò)反硝化作用去除。Rhodanobacter屬可以在缺氧條件下以NO-3、NO-2和N2O為電子受體而以葡萄糖、乙酸為電子供體將它們還原為N2[42]；Rhizobium sp.可以實(shí)現(xiàn)同步硝化/反硝化，魏巍等[43]從水庫(kù)底泥篩選出此根瘤菌，發(fā)現(xiàn)其具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用在硝化過(guò)程中NO-3、NO-2并沒(méi)有大量積累；Psedomonas屬也被證實(shí)具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能[44]；Bacillus屬在降解有機(jī)物和氨氮方面具有極大潛力，另外也可以利用NO-2反硝化生成N2。

表5 細(xì)菌在屬水平上的分布(僅列出了兩組中占有比例較多的屬)Tab.5 Taxonomic compositions of bacterial communities at the genus level

注：上述各菌屬的特征描述來(lái)源于中、外文獻(xiàn)和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》。

2.2.2.4 18S rDNA序列在屬分類層面上的特征

真菌在N循環(huán)過(guò)程中扮演重要角色[52]，酸性土壤中硝化作用的主要承擔(dān)者包括真菌，反硝化真菌能夠?qū)O-3、 NO-2還原為N2O，并可通過(guò)真菌協(xié)同反硝化作用產(chǎn)生N2，另外，菌根真菌在植物對(duì)N的吸收中也起到關(guān)鍵作用[53]。真菌能夠在各種濃度O2供應(yīng)條件下生存，高濃度時(shí)進(jìn)行有氧呼吸，低濃度時(shí)進(jìn)行NO-3呼吸，完全厭氧時(shí)進(jìn)行氨發(fā)酵[54]。

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)從微生物組獲得46073條高質(zhì)量序列，從空白組獲得50580條高質(zhì)量序列，經(jīng)項(xiàng)目分析，微生物組真菌由25個(gè)屬組成，空白組由23個(gè)屬組成。相對(duì)豐度如圖10，僅列出了樣品中相對(duì)豐度大于0.2%和參與N循環(huán)的屬。微生物組中優(yōu)勢(shì)類群為Penidiella、Gibberella、Phaeosphaeria、Coniochaeta、Inonotus、Talaromyces 、Botryotinia，相對(duì)豐度分別占真菌群落的31.37%、18.16%、17.85%、14.99%、9.28%、2.83%、2.67%。Gibberella屬能在低氧壓條件下利用復(fù)雜的ATP產(chǎn)能系統(tǒng)進(jìn)行反硝化作用[55]，Talaromyces屬進(jìn)行反硝化作用的產(chǎn)物除了N2O、更多為NO[56]，兩者累積占真菌總數(shù)的20.83%；此外，Penicillium、Kluyveromyces、Rhizopus、Alternaria、Fusarium等具有產(chǎn)生N2O能力的菌屬也在微生物或空白組樣品中檢測(cè)到，Jirout等[57]也為Gibberella、Penicillium、Fusarium屬在產(chǎn)生N2O方面具有極大的潛力提供了強(qiáng)有力的證明。

圖10 真菌在屬水平上的分布Fig.10 Taxonomic compositions of fungi communities at the genus level

根據(jù)上述分析可知，開(kāi)始階段培養(yǎng)液中DO和COD含量較高，雖然NH+4-N濃度大，但硝化細(xì)菌很難生存，而具有異養(yǎng)硝化/好氧反硝化功能的細(xì)菌屬Rhizobium、Psedomonas、Bacillus可以在低pH環(huán)境下快速生長(zhǎng)并進(jìn)行硝化反硝化作用，NH+4-N濃度隨之快速降低。同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酸細(xì)菌屬Bacillus、Enhydrobacter對(duì)葡萄糖進(jìn)行分解活動(dòng)，產(chǎn)生中間酸類產(chǎn)物，造成溶液pH值和DO濃度快速降低，進(jìn)而抑制Rhizobium、Psedomonas、Bacillus屬的硝化反硝化作用，NH+4-N濃度因此降低緩慢，而此時(shí)細(xì)菌屬Rhodanobacter和真菌屬Gibberella、Talaromyces開(kāi)始作用，進(jìn)一步消耗NH+4-N，并將NO-3、 NO-2還原為N2和N2O，所以可發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的第47～64 d，微生物組中NO-3、NO-2濃度都發(fā)生了降低現(xiàn)象，特別是NO-3。除此之外，由于微生物組含有可將NO-2氧化成NO-3的菌屬Nitrospira、Leifsonia、Afipia，所以才有13～47 d時(shí)NO-3濃度上升的現(xiàn)象，而空白組不含這幾類菌屬且NH+4-N可能經(jīng)過(guò)同步硝化反硝化產(chǎn)生氣體而直接排走，所以沒(méi)有生成NO-3。

3 結(jié) 語(yǔ)

(1)植物、微生物對(duì)NH+4-N濃度降低的貢獻(xiàn)大小依次為：植物+微生物>植物>微生物組，降低量分別為25.01～39.97、11.88～39.96、4.62～8.97 mg，對(duì)應(yīng)降低率為38.46%～55.39%、 32.90%～37.22%和4.53%～12.83%。植物+微生物、植物組主要通過(guò)反硝化作用和植物吸收來(lái)去除N，其中反硝化作用貢獻(xiàn)最大，為49%～79%，植物吸收占15%～37%；而微生物組主要通過(guò)反硝化和同化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，分別為51%～62%、26%～36%。

(2)不同NH+4-N濃度下，植物+微生物組中植物對(duì)N的吸收量均大于植物組，且所有組莖、葉含N量之和大于根含N量；微生物同化作用利用N能力的大?。褐参?微生物>微生物>植物組；反硝化作用能力大?。褐参?微生物>植物>微生物組，植物和微生物達(dá)成了相互促進(jìn)的關(guān)系。

(3)通過(guò)高通量宏基因組測(cè)序得到微生物組細(xì)菌包括16個(gè)門，105個(gè)屬組成，其中Proteobacteria門最豐富，其次為Acidobacteria門，相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的70.74%、26.72%，在屬分類水平上優(yōu)勢(shì)類群有Burkholderia、Terriglobus、Rhodanobacter、Acidisoma和Rhizobium，相對(duì)豐度分別為30.78%、26.02%、23.56%、9.64%和1.37%，同時(shí)檢測(cè)到Psedomonas、Bacillus屬。Burkholderia屬可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，Rhodanobacter屬是植物-微生物系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)脫氮菌，Rhizobium、Psedomonas、Bacillus屬具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化功能，具有自養(yǎng)硝化功能的Nitrospira屬幾乎不存在。微生物組真菌由25個(gè)屬組成，其中相對(duì)豐度分別占群落18.16%、2.83%的優(yōu)勢(shì)菌Gibberella、Talaromyces能夠進(jìn)行反硝化作用產(chǎn)生N2O或NO，Penicillium、Kluyveromyces、Rhizopus、Alternaria、Fusarium等具有產(chǎn)生N2O能力的菌屬也被檢測(cè)到。

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