陳輝星，陳實(shí)，李小燕，陳明源，嚴(yán)茂林，黃龍

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院 1. 肝膽外科 3. 病理科，福建 福州 350001；2. 福建省立醫(yī)院 肝膽外科/福建醫(yī)科大學(xué)附屬省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350001）

胰腺癌具有極強(qiáng)的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，預(yù)后差，長(zhǎng)期生存率僅5%[1-5]。E3泛素連接酶亞單位Ring1B和組蛋白賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）分別作為組蛋白泛素化和甲基化修飾過(guò)程中的重要酶，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用；而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子P16為重要的抗癌基因，一旦失活，則會(huì)引起細(xì)胞惡性增殖。P16基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此研究Ring1B、LSD1及P16與預(yù)后的關(guān)系，及其可能的聯(lián)系，對(duì)深入探討胰腺癌的發(fā)病機(jī)制、尋求有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

選取2004年1月—2016年1月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院與福建省立醫(yī)院施行的85例胰腺癌手術(shù)的臨床組織標(biāo)本，癌組織和癌旁組織制作石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)[1]。并選取其中6對(duì)新鮮胰腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，在手術(shù)切除后立即取樣，迅速冷凍于液氮并于-80℃凍存，分別提取組織細(xì)胞mRNA和蛋白。隨訪方式主要采取定期門(mén)診復(fù)查及電話咨詢(xún)，85例患者的中位隨訪時(shí)間為24（1～62）個(gè)月，無(wú)失訪 。本研究均已通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院和福建省立醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RNA提取試劑TRizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，qRT-PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)公司，引物由上海生工生物公司合成，qRT-PCR引物系列：Ring1B引物：正向5'-GGC AAC AAA GAA TGT CCTA CC-3'，反向5'-GTC ACC ATT ATC TTC TGC TCC A-3'；LSD1：正向5'-CTC TTC TGG AAC CTC TAT AAA GC-3'，反向5'-CAT TTC CAG ATG ATC CTG CAG CAA-3'；P16引物：正向5'-AGC AGC ATG GAG CCT TC-3'，反向5'-GCC TCC GAC CGT AAC TAT TC-3'；內(nèi)參GAPDH引物：正向5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC GC-3'，反向5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'。BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Milipore公司，Ring1B、LSD1及P16一抗為兔抗人多克隆抗體購(gòu)自上海彰真生物科技有限公司，免疫組化稀釋濃度1:50，Western blot稀釋濃度1:100；內(nèi)參β-actin一抗為鼠抗人單克隆抗體（Sigma公司），Western blot稀釋濃度 1:1 000；DAB顯色試劑盒購(gòu)自福建邁新生物有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化 采用EliVisionTMplus法，DAB顯色。由1名具有高級(jí)職稱(chēng)的病理醫(yī)師進(jìn)行嚴(yán)格閱片，選取腫瘤組織超過(guò)90%的視野對(duì)其進(jìn)行評(píng)分；組織免疫組化染色結(jié)果判讀由2名高年資病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行等級(jí)評(píng)定。組化染色為黃棕色者腫瘤細(xì)胞，按染色強(qiáng)弱程度分為4個(gè)等級(jí)：0，+，++，+++，分別對(duì)應(yīng)0～3分；同時(shí)確定陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占比例，按百分率高低亦分為4個(gè)等級(jí)，＜25%為 1分，25%～50%為 2分，51%～75%為 3分，＞75%為4分；將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性率分值相乘，評(píng)分介于0～12分，以4分以上者為蛋白高表達(dá)。

1.3.2 qRT-PCR 通過(guò) TRIzol reagent提取細(xì)胞總RNA，取2 μg RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。隨后加入 5× 反轉(zhuǎn)錄緩沖液 5 μL、dNTP（10 mmol/L）1 μL、引物（0.3 μg/μL）2 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 12 U 和RNA酶抑制劑20 U，總反應(yīng)體系25 μL；反轉(zhuǎn)錄條件為 42℃ 1 h，95℃ 5min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶；在StrataGeneMP3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)StrataGene公司）上行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增：2×SYBR@Green Real-time PCR mix 12.5 μL、cDNA l μL、上下游引物各 0.4 pmol/L、總反應(yīng)體系 25 μL；PCR 反應(yīng)條件：95℃ 10min；95℃ 15 s、60℃15 s×40循環(huán)；所有qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別記錄Ring1B、LSD1、P16 和內(nèi)參 GAPDH 的循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct）， 采 用 2-△△Ct法 計(jì) 算 Ring1B、LSD1及P16的mRNA相對(duì)水平。

1.3.3 Western blot 用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品混合上樣緩沖液后 100℃變性 10min，取 50 μg總蛋白上樣，以10%SDS-PAGE電泳分離后經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；PBST漂洗3次后將PVDF膜置入Ring1B、LSD1、P16及內(nèi)參β-actin一抗液體內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；PBST洗膜10min×3次，置入1:10 000稀釋的HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育30min，再次PBST洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，曝光攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩種蛋白之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析； 整體生存率分析應(yīng)用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行分析并經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，分別比較Ring1B、LSD1及P16高表達(dá)組和低表達(dá)組生存時(shí)間的差別。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)85例胰腺癌組織切片免疫組化檢測(cè)，Ring1B與LSD1蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)，癌組織表達(dá)高，癌旁組織表達(dá)低；P16蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，癌組織表達(dá)低，癌旁組織表達(dá)高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）（圖1）。上述3種蛋白在胰腺癌中的免疫組化評(píng)分結(jié)果，經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)Ring1B、LSD1與P16的表達(dá)分布均呈負(fù)相關(guān)（r=-476，P＜0.0001；r=-0.673，P＜0.0001）（圖2）。

表1 Ring1B、LSD1、P16在胰腺癌組織和癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率（或表達(dá)評(píng)分）比較Table 1 Comparison of the positive expression rates of Ring1B, LSD1 and P16 between pancreatic tissue and adjacent tissue

圖1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果（×200）Figure 1 Immunohistochemical fi ndings (×200)

圖2 Spearman秩相關(guān)分析Figure 2 Spearman rank correlation analysis

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)6對(duì)胰腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本，胰腺癌組織和癌旁組織中Ring1B、LSD1、P16 mRNA的相對(duì)水平分別為8.908±3.204與1.947±0.938，7.126±2.948與1.940±0.654，1.269±0.311與5.237±1.586，3種mRNA的相對(duì)水平在胰腺癌組織和癌旁組織間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Ring1B、LSD1、P16的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與其mRNA一致，胰腺癌組織Ring1B、LSD1蛋白表達(dá)高于癌旁組織，P16蛋白表達(dá)低于癌旁組織（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)結(jié)果Figure 3 Results of Western blot analysis

2.4 生存分析結(jié)果

根據(jù)免疫組化結(jié)果，將患者分為Ring1B高表達(dá)組與低表達(dá)組、LSD1高表達(dá)組與低表達(dá)組、P16高表達(dá)組與低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存曲線提示，Ring1B高表達(dá)胰腺癌患者生存率明顯低于其低表達(dá)者（χ2=8.958，P=0.012）、LSD1高表達(dá)胰腺癌患者生存率明顯低于其低表達(dá)者（χ2=8.856，P=0.010），相反，P16高表達(dá)胰腺癌患者生存率明顯高于其低表達(dá)者（χ2=7.867，P=0.024）（圖4）。

圖4 不同Ring1B、LSD1、P16表達(dá)狀態(tài)胰腺癌患者的生存曲線Figure 4 The survival curves of pancreatic cancer patients with different Ring1B, LSD1 or P16 expression statuses

3 討 論

胰腺癌近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)（男性第4位，女性第5位），在所有消化道腫瘤中預(yù)后最差，中位生存期僅4～6個(gè)月，長(zhǎng)期生存率僅5%[1-5]。胰腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)，是導(dǎo)致預(yù)后極差的主要原因。

表觀遺傳學(xué)改變是基因的DNA序列未發(fā)生改變的情況下，基因表型發(fā)生可遺傳性變化，包括組蛋白甲基化、泛素化、DNA甲基化。研究證實(shí)胰腺癌的發(fā)生涉及凋亡、細(xì)胞周期等多基因多步驟參與，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谝认侔┑陌l(fā)生中可能起到重要作用[6]。

P16是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，定位于細(xì)胞核內(nèi)，抑制CDK4活性，可能通過(guò)抑制pRb蛋白磷酸化，將細(xì)胞周期阻斷在G1期，最終阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。一旦P16發(fā)生基因缺失、啟動(dòng)子甲基化、其編碼產(chǎn)物被癌基因蛋白所結(jié)合及轉(zhuǎn)錄后修飾等變異導(dǎo)致功能失活，細(xì)胞則惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7-11]。研究[12-14]表明胰腺癌標(biāo)本中p16蛋白表達(dá)水平降低，與腫瘤分化程度明顯相關(guān)。本研究經(jīng)RNA和蛋白水平檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織P16表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。P16在胰腺癌的發(fā)生中起到重要作用，P16基因的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控可能與組蛋白修飾有關(guān)。

Ring1B是Polycomb（PcG）家族的重要成員，Ring1B介導(dǎo)組蛋白H2A第119位賴(lài)氨酸發(fā)生單泛素化（H2K119Ub1），調(diào)控細(xì)胞增殖[15-17]。已知PcG另一家族成員原癌基因Bmi-1，可作用于其下游的編碼p16INK4A/Rb的INK4A-ARF位點(diǎn)，以甲基化方式參與Pl6等抑癌基因的異常沉默，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶持續(xù)活化和細(xì)胞周期失控[18-19]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ring1B在癌組織中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平高于癌旁組織，Spearman秩相關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)Ring1B與P16的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Ring1B可能通過(guò)組蛋白泛素化，參與P16的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生。

LSD1是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的組蛋白去甲基化酶，LSD1能夠去除組蛋白H3K4和H3K9的單、雙甲基，從而調(diào)節(jié)組蛋白并影響基因轉(zhuǎn)錄的激活、抑制等過(guò)程。LSD1廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其在維持腫瘤的惡性生物學(xué)特性的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，是一個(gè)潛在的干預(yù)腫瘤惡性潛能的靶點(diǎn)[20-24]。本研究經(jīng)IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LSD1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，進(jìn)一步通過(guò)RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平證實(shí)了上述結(jié)果。Spearman秩相關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)LSD1與P16的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，我們推測(cè)LSD1也參與了Pl6的調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)Ring1B、LSD1與P16的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，并且通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Ring1B、LSD1和低表達(dá)P16的胰腺癌患者預(yù)后差，提示Ring1B、LSD1及P16在胰腺癌組織中的表達(dá)及其之間的相關(guān)性與腫瘤的惡性生物學(xué)行為可能相關(guān)。Ring1B、LSD1可能分別通過(guò)組蛋白泛素化和去甲基化調(diào)控P16的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，影響胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展，胰腺癌的發(fā)生與表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)。具體調(diào)控區(qū)域與相互作用方式有待進(jìn)一步研究。

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