徐林，易超，依馬木買買提江·阿布拉，蘇雅婷，晏冬，李海軍，丁偉

（1. 新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 肝膽外科，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院 醫(yī)務部，新疆烏魯木齊 830000；3. 廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院 普通外科，廣東 深圳 518001）

長久以來，胰腺癌一直是困擾著臨床醫(yī)師的難題，其早期發(fā)病隱匿進展迅速，多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已屬晚期，喪失了最佳的手術機會，而其對放化療又均不敏感，以根治性切除為主的綜合治療模式仍是目前最主要的治療方法，致使胰腺癌已成為嚴重影響全人類生命健康的疾病[1-3]。隨著近年來分子生物化學技術的不斷發(fā)展，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機制已逐漸明了，多數(shù)學者[4-6]認為其惡性生物學特性的產(chǎn)生與維持是一個多細胞信號轉導通路共同作用的過程。本研究通過Jagged 2（JAG2）基因針對Notch信號通路在胰腺癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉移過程中的作用進行研究，旨在為進一步闡明胰腺癌的發(fā)病發(fā)展機制及探尋有效的早期診斷與靶向治療位點提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：人胰腺癌組織源細胞培養(yǎng)試劑盒（Human Cancer PrimaCell?:Pancreatic Cancer Tissues Cells）及人胰腺癌組織源細胞鑒定試劑盒（Human Pancreatic Cancer Tissues Cell Primarker? Kit）購自齊氏生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、Transwell 試劑盒購自Corning公司；胎牛血清購自Ausbian公司；胰蛋白酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；慢病毒載體構建包裝試劑盒、轉染試劑盒、RNA提取純化試劑盒、逆轉錄試劑盒、Western blot試劑盒及抗體購自吉凱基因技術有限公司；TRIzol試劑盒購自上海普飛公司；MTT試劑盒購自Genview公司；Annexin V-APC細胞凋亡檢測試劑盒購自eBioscience公司；碘化丙啶購自igma公司。儀器設備：超凈工作臺產(chǎn)自蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；PCR儀產(chǎn)自Applied Biosystems公司；Real time PCR儀產(chǎn)自Roche公司；凝膠成像儀產(chǎn)自天能公司；CO2培養(yǎng)箱產(chǎn)自SANYO公司；高速離心機產(chǎn)自Thermo Scientific公司；熒光顯微鏡產(chǎn)自Olympus公司；倒置顯微鏡產(chǎn)自上海蔡康光學儀器有限公司；生物安全柜產(chǎn)自上海振樣創(chuàng)空氣凈化設備有限公司；酶標儀產(chǎn)自Tecan infinite公司；流式細胞儀產(chǎn)自Millipore公司；96孔板產(chǎn)自Cornning公司。

1.2 胰腺癌原代細胞的分離培養(yǎng)與傳代

胰腺癌組織來源：收集新疆醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院2014年1月—2016年6月間行胰十二指腸切除術的胰腺惡性腫瘤患者的新鮮腫瘤組織標本共22例，并按如下的納入與排除標準初步篩選出其中的12例擬用于后續(xù)研究的標本。納入標準：⑴ 經(jīng)快速病理證實為胰腺導管細胞癌；⑵ 經(jīng)本院首次確診的新發(fā)病例；⑶ 患者年齡≥18歲；⑷ 患者本人及患者家屬同意留取組織標本并用于研究，允許研究資料交流發(fā)表。排除標準：⑴ 經(jīng)常規(guī)病理及免疫組化證實存在局部脈管侵犯、區(qū)域淋巴結轉移，或為其他胰腺惡性腫瘤；⑵ 存在遠處轉移；⑶ 合并有其他惡性腫瘤或糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等全身系統(tǒng)性疾??；⑷ 術前已接受放療、化療或其他抗腫瘤藥物治療患者；⑸ 近3年內(nèi)有手術史。

胰腺癌原代細胞的分離與純化：參照美國IRB與HIPAA批準方案收集手術切除的胰腺癌組織標本后，采用人胰腺癌組織源細胞培養(yǎng)試劑盒分離并純化獲得胰腺癌原代細胞，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞并置于37℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%及以上面積時用凍存液（DMEM/F12+40%FBS+10%DMSO）重懸細胞并置于凍存管中4℃放置0.5 h，-20℃放置1.5 h，-80℃放置過夜，24 h后轉入液氮罐內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?2例組織樣本成功分離胰腺癌原代細胞6例，3例細胞在分離過程中發(fā)生嚴重污染，2例細胞分離后出現(xiàn)大量細胞碎片成活細胞數(shù)極少至分離失敗，1例細胞中成纖維細胞去除失敗大量生長。

胰腺癌原代細胞的傳代：凍存細胞經(jīng)復蘇后，用上述完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞覆蓋培養(yǎng)瓶的80%以上，棄培養(yǎng)液洗滌細胞后加入0.25%胰蛋白酶1 mL 37℃孵育2min，倒置顯微鏡下觀察細胞回縮變圓時立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，細胞懸液1 500r/min離心5min，沉淀細胞并用完全培養(yǎng)基重懸后按1:2傳代比例傳5代，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)備用。細胞傳代過程中，1例細胞發(fā)生嚴重污染，1例細胞出現(xiàn)大量脫落死亡。余成功傳代培養(yǎng)細胞每例取1株經(jīng)人胰腺癌組織源細胞鑒定試劑盒鑒定證實確為胰腺癌細胞。

1.3 JAG2基因siRNA慢病毒表達載體的構建與篩選

根據(jù)Genebank提供的基因信息設計3條siRNA靶點序列（siRNA1：GCT CTA CCA GTG CAA GAA CTT；siRNA2：CGC TGC TAC GAC CTG GTC AAT；siRNA3：CTG TGT GTA AAC AAG GGT GTA）并由吉凱基因技術有限公司代為合成siRNA片段（表1），將1μL上述合成的siRNA片段與1μL經(jīng)雙酶（AgeI、EcoR I）切的慢病毒載體（圖1）混合后加入1μL T4 DNA ligase 16℃連接過夜（反應體系中加入10倍的T4 DNA ligase緩沖液并用ddH2O補足體檢至20μL），10μL連接產(chǎn)物加入100μL感受態(tài)細胞中冰浴30min，42℃熱激90 s，冰浴2min后加入500μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，菌液均勻涂在含雙抗的平板上恒溫培養(yǎng)15 h，行PCR菌檢（PCR引物為上游：CCA TGA TTC CTT CAT ATT TGC；下游：ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G），陽性克隆接種至含雙抗的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)15 h后行測序，測序正確的菌液同上培養(yǎng)15 h后采用質(zhì)粒提抽試劑盒提抽質(zhì)粒并行質(zhì)檢。將經(jīng)胰酶消化的293T細胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h至細胞密度達70%～80%備用，轉染前2 h更換為無血清培養(yǎng)基；上述構建的載體質(zhì)粒20 μg、pHelper1.0載體15 μg、pHelper 2.0載體10 μg及相應轉染試劑充分混勻調(diào)整體積至1 mL，室溫下孵育15min，緩慢加入293T細胞中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h洗滌細胞去除殘余轉染復合物后，緩慢加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基20 mL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h。收集293T細胞4℃、5 055r/min離心10min去除細胞碎片，以0.45 μm濾器過濾上清40 ml，25 000r/min離心2 h，棄去上清沉淀重懸后10 000r/min離心5min去上清獲得目標病毒，采用熒光法測得病毒滴度分別為6×108、8×108、5×108TU/mL。

上述分離培養(yǎng)成功的胰腺癌原代細胞，參照轉染試劑盒說明利用構建好的3條siRNA慢病毒表達載體轉染后培養(yǎng)72 h收集細胞，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA后，以GAPDH為內(nèi)參，利用實時定量PCR法檢測3組細胞中JAG2基因mRNA的相對表達量并采用Western blot法驗證各組細胞中JAG2蛋白表達情況，選擇抑制效率最高的siRNA慢病毒表達載體用于后續(xù)研究。反應程序為：95℃ 30 s、1個循環(huán)；95℃ 5 s、60℃ 30 s、40個循環(huán)；95℃15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s、1個循環(huán)。

表1 JAG2基因siRNA片段Table 1 The siRNA fragments for JAG2 gene

圖1 慢病毒載體信息Figure 1 Information of the lentiviral vector

1.4 JAG2基因siRNA慢病毒表達載體對人胰腺癌原代細胞生物學特性影響分析

胰腺癌原代細胞培養(yǎng)至覆蓋70%～80%培養(yǎng)瓶后分為2組，參照轉染試劑盒說明，對照組細胞用不攜帶siRNA的空慢病毒載體（包含GV載體質(zhì)粒、pHelper 1.0載體及pHelper 2.0）轉染，JAG2 siRNA轉染組細胞用siRNA慢病毒表達載體轉染，轉染培養(yǎng)72 h后觀察2組細胞生長情況并于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達率（即轉染率），當細胞生長至80%以上融合度且轉染率達70%～80%時收集細胞行如下實驗：參照MTT試劑盒說明，檢測兩組細胞5 d生長情況并繪制生長曲線，并依據(jù)細胞增殖抑制率=（1-JAG2 siRNA轉染組細胞OD490值/對照組細胞OD490值）×100%公式計算JAG2 siRNA轉染組細胞抑制率；兩組細胞培養(yǎng)至第5天時收集細胞完全培養(yǎng)基重懸1300r/min離心5min，4℃預冷的D-Hanks洗滌細胞沉淀2次后1300r/min離心3min，用500μL結合緩沖液重懸細胞沉淀并與10μL Annexin V-APC混勻，避光室溫反應15min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況并對比分析；收集兩組細胞1300 r/min離心5min，4℃預冷的D-Hanks洗滌細胞沉淀1次，1300 r/min離心5min，4℃預冷的75%乙醇固定細胞1h，再重復離心并用預冷D-Hanks洗滌細胞，加入含碘化丙啶（PI）細胞染色液染色細胞后流式細胞儀分析各組細胞的細胞周期；完全培養(yǎng)基重懸兩組細胞后，參照Transwell試劑盒說明，上室中加入100μL細胞懸液調(diào)整每孔細胞數(shù)為1×105個，下室內(nèi)加入600μL 30%FBS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，去除培養(yǎng)基及非轉移細胞后Giemsa染色3～5min，顯微鏡拍照并計數(shù)細胞，對比分析各組細胞侵襲轉移能力。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 JAG2基因siRNA慢病毒表達載體的篩選

成功構建JAG2 siRNA慢病毒表達載體轉染胰腺癌原代細胞（圖2A）；經(jīng)構建的慢病毒表達載體轉染后胰腺癌原代細胞中JAG2基因相對表達量見圖2B，其中對照組為加入ddH2O的空白對照，3條siRNA慢病表達載體相較于對照組的抑制率分別為69.2%、4.8%、60.5%；Western blot結果顯示JAG2蛋白表達情況與mRNA基本一致（圖2C），故選擇抑制效果最強的JAG2 siRNA1慢病毒表達載體進行后續(xù)研究。

2.2 細胞增殖檢測

依據(jù)兩組細胞經(jīng)M T T處理后每天測得的O D490值繪制的生長曲線，結果顯示，J A G 2 siRNA慢病毒表達載體可明顯抑制胰腺癌細胞的生長（P＜0.05），轉染24、48、72、96、1 2 0 h的抑制率分別為（1 1.8 4±2.1 0）%、（2 6.9 1±0.8 9）%、（4 2.0 0±1.8 9）%、（40.26±2.74）%、（44.96±2.89）%（圖3）。

2.3 細胞凋亡檢測

經(jīng)培養(yǎng)5 d后，對照組細胞的凋亡率為（4.98±0.33）%，JAG2 siRNA轉染組細胞的凋亡率為（7.52±0.19）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

2.4 細胞周期分析

經(jīng)流式細胞儀分析，對照組細胞中處于G1期、S期及G2/M期的細胞占總細胞數(shù)的比例分別為（55.05±1.23）%、（23.53±0.94）%、（21.42±0.82）%，JAG2 siRNA轉染組細胞各期細胞比例則分別為（6 1.0 6±0.8 0）%、（11.88±1.03）%、（27.07±0.39）%；與對照組比較，JAG2 siRNA轉染組的胰腺癌細胞位于G1及G2/M期的細胞增多，而位于S期的細胞則明顯減少（均P＜0.05）（圖5）。

圖2 轉染效果觀察 A：轉染后胰腺癌細胞熒光照片（×100）；B：轉染后胰腺癌細胞JAG2 mRNA表達檢測；C：轉染后胰腺癌細胞JAG2蛋白表達檢測Figure 2 Transfection effect observations A: Fluorescence microscopy images of the pancreatic cells after transfection (×100); B: JAG2 mRNA expressions in the pancreatic cells after transfection; C: JAG2 protein expressions in the pancreatic cells after transfection

圖3 各組細胞生長曲線Figure 3 Growth curves of each group of cells

圖4 各組細胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate of each group of cells

圖5 各組細胞細胞周期分析Figure 5 Cell cycle analysis in each group of cells

2.5 細胞侵襲轉移能力檢測

Transwell小室實驗結果顯示，JAG2 siRNA轉染組細胞小室內(nèi)的細胞計數(shù)為（2.0±0.40）個/高倍視野，對照組細胞小室內(nèi)計數(shù)（69±8.15）個/高倍視野，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖6）。

圖6 各組細胞侵襲轉移能力測定 A：Transwell實驗照片（×100）；B：兩組遷移細胞數(shù)比較Figure 6 Determination of invasion and metastasis ability in each group of cells A: Transwell assay fi ndings (×100); B: Comparison of the number of migrating cells between the two groups of cells

3 討 論

Notch信號通路是一條廣泛存在于脊椎動物與非脊椎動物進化上高度保守的信號轉導通路，該通路由Notch受體家族、配體Delta和Serrate/Jagged、轉錄因子CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag的合稱）蛋白、調(diào)節(jié)因子及其它效應物構成，當相鄰近細胞間的Notch受體與配體結合后，經(jīng)過3次裂解產(chǎn)生其胞內(nèi)活性成分NICD進入細胞核與轉錄因子CSL形成復合物激活下游靶基因，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡及黏附等生物學功能[7-9]。Notch通路被認為是胚胎發(fā)育過程中的關鍵性細胞信號轉導途徑，而其異常激活則與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤血管的形成關聯(lián)密切[10-13]。胰腺癌研究方面，Notch信號通路已被證實在動物胚胎胰腺早期發(fā)育中可促進胰腺前體的大量增生并維持胰腺細胞處于祖細胞狀態(tài)，在成熟胰腺中該通路成員的表達量則處于較低的水平，只有當胰腺出現(xiàn)急慢性炎癥時，該通路才再次被激活作用于胰腺的損傷修復，而胰腺癌組織中則可檢測到該通路部分成員的過度表達[14-16]。Tang等[17]的研究顯示，miR-34a可靶向阻斷Notch通路從而影響胰腺癌細胞的增殖及侵襲轉移能力，證實Notch信號通路的激活可能是胰腺癌惡性生物學特性產(chǎn)生的關鍵環(huán)節(jié)。Zhou等[18]通過體外阻遏胰腺癌細胞中Notch3的表達可顯著抑制細胞的侵襲轉移能力，進一步的研究結果也提示，Notch3的表達與胰腺癌脈管受侵、遠處轉移及TNM分期明顯相關，且是縮短患者生存期的高危因素。杜瀟等[19]的研究結果也提示，通過轉染Notch1胞內(nèi)段（NICD）質(zhì)?？缮险{(diào)Notch通路關鍵靶基因Hes1的表達抑制胰腺癌細胞株的凋亡從而促進細胞增殖與侵襲轉移。

筆者課題組[20]在前期研究采用表達譜基因芯片對手術切除的胰腺癌及其癌旁正常組織間的差異表達基因進行了檢測，研究結果顯示，Notch信號通路中的主要成員Notch1、Notch2、Notch3、HES（hairy and enhancer of split）1、HES 5、CSHL（chorionic somatomammotropin hormone like）1及JAG2基因均存在不同程度的差異表達，經(jīng)實時定量PCR驗證，僅有Notch2基因的表達與基因芯片結果不相符，其余基因中以JAG2基因在胰腺癌細胞中的表達豐度最高。JAG2基因作為Notch信號通路的配體，其異常表達已被證實與結腸癌、乳腺癌、胃癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[21-24]。胰腺癌方面，目前國內(nèi)外相關研究較少，Hu等[25]的研究結果顯示，JAG2基因高表達與胰腺癌細胞的侵襲轉移能力密切相關，但這種作用的發(fā)揮主要依賴于JAG2與Notch1間的相互作用，而不是通過激活Notch通路的下游靶基因來實現(xiàn)。為進一步分析JAG2基因及Notch信號通路在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機制，本研究成功構建了3條攜帶JAG2 siRNA的慢病毒表達載體，并通過轉染胰腺癌原代細胞后篩選出對JAG2基因表達抑制率最高的阻遏載體。經(jīng)該阻遏表達載體轉染抑制JAG2基因表達從而阻斷Notch信號通路后，胰腺癌原代細胞的增殖與侵襲轉移能力均出現(xiàn)明顯的下降，而細胞凋亡比率則顯著上升，證實Notch信號通路可能在胰腺癌的惡性生物學特性維持過程中起著重要的作用，同時也說明在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中JAG2基因可能是Notch通路發(fā)揮調(diào)控作用的關鍵環(huán)節(jié)。

本研究在一定程度上證實了Notch信號通路在胰腺癌惡性生物學特性產(chǎn)生與維持過程中的重要作用，但因胰腺癌極低的手術切除率及胰腺癌原代細胞分離培養(yǎng)的困難，樣本量較少，結果存在一定的偏倚，且該通路在胰腺癌細胞中的具體調(diào)控機制及其與其它通路的協(xié)同拮抗作用尚未明確，還需更為深入的研究論證。筆者相信，隨著胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程分子調(diào)控機制的不斷明確，該通路勢必會成為胰腺癌早期診斷甚至是靶向治療的關鍵靶點。

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