陳 彤,吳 剛,祖麗皮也,朱慶豐,王少海,易楊華
巴沙魚膠原蛋白支架材料的成骨效果評估
陳 彤1,吳 剛2,祖麗皮也1,朱慶豐1,王少海1,易楊華3
(1.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院口腔科 上海 200433;2.解放軍第八五醫(yī)院口腔科 上海 200052;3.第二軍醫(yī)大學海洋藥物研究中心 上海 200433)
目的:驗證一種來源于巴沙魚皮的膠原蛋白支架材料作為屏障膜在兔顱骨引導骨再生(Guided Bone Regeneration,GBR)術(shù)中的成骨效果。方法:取新西蘭大白兔12只,分別在其顱頂矢狀縫左側(cè)建立一個缺損,右側(cè)建立兩個缺損,缺損為圓形,直徑8mm,共計36個骨缺損;然后按觀察時間隨機分為8周、12周兩大組,每一大組隨機分為3個亞組(n=4);A組缺損中只植入Bio-Oss骨粉,B組植入Bio-oss骨粉+巴沙魚皮膠原支架材料;C組植入Bio-oss骨粉+Bio-Gide膠原膜。于術(shù)后8、12周處死相應組大白兔,切取骨缺損區(qū)標本并制作HE染色組織切片,定量分析各組骨缺損區(qū)骨組織再生的情況。結(jié)果:巴沙魚膠原蛋白支架材料在GBR技術(shù)中能發(fā)揮屏障膜作用,引導和促進兔顱骨組織再生,其中B組與C組相比,8周時的成骨效果的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),12周時C組成骨效果略高于B組(P<0.05);而A組在8周和12周時的成骨效果均顯著低于B、C兩組(P<0.05)。結(jié)論:巴沙魚皮膠原蛋白支架材料作為屏障膜在兔顱骨缺損修復中起到了引導骨再生的作用。
引導骨組織再生;魚類膠原蛋白;兔顱骨缺損模型;膠原蛋白支架材料;牙種植術(shù)
引導骨再生技術(shù)(Guided Bone Regeneration,GBR)是基于引導性組織再生(guided tissue regeneration,GTR)技術(shù)提出的一種促進骨組織再生的外科治療方法。其原理為在骨缺損區(qū)域與上皮之間放置屏障膜,保護骨缺損空間,防止纖維結(jié)締組織等的過快長入,從而促進骨修復的完成[1-2]。臨床上常利用這種技術(shù)來解決種植區(qū)骨量不足或因牙周炎而造成重度牙槽骨吸收等問題。
在GBR技術(shù)中,屏障膜材料的選擇是決定其引導骨組織再生效果的關鍵??晌招阅z原膜是最常見的屏障膜材料之一,其最大的優(yōu)點為可吸收,無需二次手術(shù)取出降低了感染的風險。同時膠原蛋白又具有低抗原性和創(chuàng)傷修復的優(yōu)點,有利于機體的恢復,膠原蛋白還具有良好的生物相容性和組織親和性,幾乎不會引起機體的炎癥或排斥反應。但膠原膜也存在著一些缺陷,例如機械強度差,空間維持能力低等[3]。前人的研究中已經(jīng)證實膠原膜在GBR過程中能發(fā)揮良好的屏障作用[4]。大多數(shù)膠原膜的膠原成分來源于豬或者牛等陸生哺乳動物,由于傳染病,口蹄疫等的原因,人們逐漸對此種來源的膠原蛋白制品產(chǎn)生了懷疑[5-6],除此之外,部分地區(qū)的宗教信仰也限制使用豬或者牛等來源的制品,這使傳統(tǒng)的膠原蛋白制品的使用受到了一定的限制。
水生生物體內(nèi)含有豐富的膠原蛋白,且具有著哺乳動物膠原不具備的優(yōu)點,如低抗原性、低過敏性等,另外水生生物膠原蛋白來源豐富,價格也相對低廉,水產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的魚皮魚鱗魚骨等廢棄物中均含有豐富的膠原蛋白成分。七十年代起,人們就已經(jīng)開始研究從水生生物體內(nèi)提取膠原蛋白來,并取得了一定的成果,因此水生生物有可能逐步替代陸生動物成為膠原制品的主要原料來源[7-9]。本實驗以巴沙魚皮為原料,制備出了一種富含膠原蛋白的膜狀支架材料。以兔為實驗對象建立顱頂骨缺損動物模型[10-11],將巴沙魚膠原蛋白支架材料應用于動物骨缺損GBR技術(shù)中[12-13],并以屏障效果肯定的膠原膜——Bio-Gide膠原膜作為陽性對照,以驗證該新型原料來源的材料作為屏障膜引導骨組織再生的效果。
1.1 主要實驗材料:新西蘭大白兔12只,第二軍醫(yī)大學實驗動物中心(動物使用許可證SYXK(滬)2012-0003)提供;巴沙魚膠原蛋白膜12張(10mm×10mm),第二軍醫(yī)大學海洋藥物研究中心提供;Bio-Gide膠原膜12張(10mm×10mm)(25mm×25mm,瑞士Geistilich公司);可吸收骨粉Bio-oss5瓶(0.25g,瑞士Geistilich公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 巴沙魚膠原蛋白膜的制備:速凍巴沙魚皮,常溫解凍后洗凈風干至恒重,稱重后依次用0.1%的NaOH溶液和3%的H2O2的溶液浸泡,用于脫色脫脂及去除部分雜蛋白。首次浸泡5h,待H2O2全部被還原,取出洗凈,更換溶液繼續(xù)浸泡24h。再用自來水沖洗至中性,然后在瀝干水分情況下用適量洗潔精揉搓,再用自來水清洗。此過程重復5次。配置脫色液(甲醇︰乙酸︰水=250︰80︰670,體積比)進行脂脫雜蛋白處理。將材料置于脫色液中浸泡24h后取出,沖洗至中性。瀝干水分的同時用適量洗潔精清洗5次,再用蒸餾水清洗3次,清洗完畢后置于蒸餾水中浸泡12h,用于去除魚皮中殘留其他物質(zhì)。整個過程重復3次。最后將魚皮取出,瀝干水分,鋪盤冷凍干燥后即可成形。
巴沙魚皮膠原支架材料的熱交聯(lián)方法如下:將上述制備好的巴沙魚膠原支架材料放置于真空干燥箱中,設置干燥箱溫度為110℃,72h后取出,即可完成交聯(lián)。
該材料呈膜狀,厚薄均勻,厚度為(0.66±0.10)mm。經(jīng)半微量凱氏定氮法可測得該材料的膠原蛋白含量高達95.20%。凝膠電泳實驗分析可知該材料主要為I型膠原。
掃描電鏡照片顯示(圖1),該膠原蛋白支架材料的一面較為粗糙(圖1A),可見多孔結(jié)構(gòu),孔徑大小不一,孔與孔之間相互通連,分布較為均勻。另一面則比較光滑(圖1B),孔隙致密。
圖1 巴沙魚皮膠原膜掃描電鏡圖片(×200)
1.2.2 兔顱頂骨缺損模型的建立:取1~2周齡的健康雄性新西蘭大白兔,12只(體質(zhì)量1.5~2kg),3%戊巴比妥鈉注射液耳緣靜脈注射(1~1.5ml/kg體質(zhì)量)麻醉后,顱頂部術(shù)區(qū)備皮,常規(guī)消毒,并于顱頂部顱中縫上方皮膚作豎型切口,切口長2~3cm,分離軟組織和骨膜并暴露顱頂骨后,用慢速直機(卡瓦K4)分別在矢狀縫兩側(cè)與兩眼眶后緣連線一側(cè)后5mm,對側(cè)后3mm以及13mm處各制備一個直徑8mm的全層顱骨缺損(見圖2),注意保留完整的硬腦膜及骨膜組織。生理鹽水沖盡骨屑并拭干,按以下分組進行相應的處理。
1.2.3 實驗分組和GBR處理:將上述制備有顱頂骨缺損的12只大白兔按觀察時間隨機分為8周、12周兩大組(每組6只,共18個骨缺損區(qū));每一大組的18個骨缺損區(qū)再按不同處理方法各隨機分為A、B、C3個亞組(每組6個骨缺損區(qū))。其中A組骨缺損區(qū)植入Bio-Oss骨粉,不覆蓋任何膜,縫合;B組骨缺損區(qū)植入Bio-Oss骨粉,用巴沙魚皮膠原蛋白膜覆蓋;C組骨缺損區(qū)植入Bio-Oss骨粉,用Bio-Gide膜覆蓋,并縫合(見圖3、4);術(shù)后24~48h肌肉注射10~20萬單位的青霉素鈉,連續(xù)注射3d。術(shù)后10d拆線。所有動物均于相同條件下飼養(yǎng)。
圖2 建立兔顱骨骨缺損模型
圖3 對各缺損區(qū)按分組分別進行不同處理
圖4 縫合
1.2.4 取材和大體觀察:分別于術(shù)后8周和12周處死相應組大白兔,分別截取各缺損區(qū)及其周圍10mm以內(nèi)的全層骨組織,并肉眼觀察各缺損區(qū)愈合情況和屏障膜的降解情況。1.2.5 組織學觀察:各組顱頂骨標本經(jīng)常規(guī)固定后,置于EDTA脫鈣液(500ml,BOSTER)中脫鈣,樹脂包埋,用組織切片機(Leica RM2235)垂直于骨組織面作水平方向切片(片厚5mm)。后取各標本中心層切片,進行HE染色,光學顯微鏡下觀察新生骨組織成骨情況、新生組織血管化及纖維組織等其他組織學變化情況。用計算機圖像分析系統(tǒng)隨機采集同一樣本不同成骨區(qū)域在40倍視野下HE染色切片的圖像,各取14張,并用圖像分析軟件IMAGEPRO PLUS 6.0進行定量分析,計算同一圖像下新生骨小梁面積(new bone area,NBA)占圖像骨缺損初始面積(total defect area,TDA)的百分比。取同一樣本所有圖像百分比的均數(shù)作為該樣本新生骨量的百分比(The percentage of new bone,PNB)
1.3 統(tǒng)計學分析:用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)(xˉ±s)進行方差分析,兩組間比較使用ANOVA檢驗,同組內(nèi)兩兩比較使用t檢驗,檢驗水準α=0.05。
2.1 大體觀察:觀察期間,各組動物進食、活動均正常,并健康成活至處死;術(shù)后10d拆線,各動物的創(chuàng)口愈合情況均良好。GBR術(shù)后8周,骨缺損區(qū)域無明顯感染,B、C組屏障膜材料基本降解,與骨缺損區(qū)域無粘連,各組均可見未降解的骨粉顆粒,可探及實質(zhì)性修復(見圖5);GBR術(shù)后12周,骨缺損區(qū)域無明顯感染,B、C組屏障膜已完全降解,各組均可探及實質(zhì)性新生骨組織,可見少量散在的骨粉殘余(見圖6)。
圖5 8周時的骨樣本
圖6 12周時的骨樣本
2.2 組織學觀察:8周時,各組均可見到早期新骨結(jié)構(gòu)的形成(見圖7~8)。其中空白組中可見到較多的纖維結(jié)締組織的長入,實驗組和對照組中則纖維結(jié)締組織較少,各組均可見少量的炎癥細胞和新生血管的存在,同時各組還可見未降解的骨粉顆粒組織。12周時,各組的新生骨小梁結(jié)構(gòu)更為成熟,更多的纖維結(jié)締組織有在向骨質(zhì)分化的趨勢,可見較多新生血管,炎癥細胞和未降解的骨粉相比8周時有所減少(見圖8~10)。
2.3 組織定量學分析:GBR術(shù)后各組織樣本新生骨量定量分析結(jié)果顯示:8、12周大組內(nèi),新生骨量均為C組>B組>A組(表1)。可見:B組與C組相比,8周時的成骨效果的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),12周時C組成骨效果略高于B組(P<0.05);而A組在8周和12周時的成骨效果均顯著低于
B、C兩組(P<0.05)。
圖7 8周A組成骨區(qū),紅色淡染為纖維結(jié)締組織(黑色箭頭),占了絕大部分(HE×40)
圖8 8周B組成骨區(qū),新生骨小梁明顯增多??梢娸^多新生血管以及骨髓腔(HE×40)
圖9 8周C組成骨區(qū),可見新生骨小梁以及未降解的骨粉顆粒(黑色箭頭)(HE×40)
圖10 12周A組成骨區(qū),可見纖維結(jié)締組織在向骨組織分化(HE×40)
圖11 12周B組成骨區(qū),可見較多成熟的骨組織(HE×40)
圖12 12周C組成骨區(qū),成熟骨組織數(shù)量增多,新生血管數(shù)量增多,未降解的骨粉減少(HE×40)
GBR技術(shù)中,屏障膜的使用是關鍵,它能夠選擇性阻擋上皮和成纖維細胞進入擬成骨空間,同時又不會妨礙組織缺損的自然愈合的過程[14]。屏障膜一方面可以在局部維持足夠的成骨空間,以利于來充填足量的人工材料或自體骨;另一方面因其自身具有一定的穩(wěn)定性,可保證有充足的時間讓成骨細胞占據(jù)成骨空間,同時還可在其降解過程中引導新生血管的長入,從而促進和引導屏障膜兩側(cè)組織的自我修復過程。在所有可吸收性膜中,膠原膜因具有很強的生物活性和生物功能、較高的細胞黏附水平以及一定的生物降解率,同時具有較弱的抗原性和良好的生物相容性[15],已經(jīng)成為臨床上最常用的可吸收膜。但由于相關畜類疾病和某些宗教信仰限制了人們對陸生哺乳動物膠原蛋白及其制品的使用,利用水生生物來源的膠原蛋白逐漸成為人們研究的熱點。
巴沙魚(Pangasisushaniltoa)是一種優(yōu)質(zhì)的東南亞特產(chǎn)淡水魚類,原產(chǎn)于越南湄公河三角洲和泰國湄南河流域,資源豐富,加工過程中產(chǎn)生下腳料如魚皮、魚肚、魚鰭等數(shù)量巨大,原料來源廣泛。I型膠原纖維為構(gòu)成該種魚膠原蛋白基本骨架的主要成分,其已被證實具有較低的免疫原性,優(yōu)良的生物相容性以及良好的促進細胞增殖能力[16]。魚I型膠原的主要特征之一為在酸溶液中具有極高的溶解性,因此較鳥類和哺乳類膠原蛋白更易于提取[17-18]。魚類膠原的氨基酸組成也與哺乳動物類似[19-23],這說明魚膠原蛋白與哺乳動物膠原蛋白具有相似的穩(wěn)定性。在GBR過程中,以巴沙魚皮膠原蛋白膜作為屏障膜,其空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)、誘導并促進宿主細胞長入;隨著成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞及多種生長因子的長入和增殖,便可形成新生骨組織和新生血管,并逐漸將膜內(nèi)物質(zhì)降解、吸收,替換成為有宿主自體特征的細胞外組織基質(zhì)。
Bio-Gide膠原膜是一種已被實驗證實能有效發(fā)揮屏障膜作用的膠原膜材料[24],以I型膠原纖維和III型膠原纖維為主要成分,構(gòu)成空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),并通過雙層膜的設計而使其能保持較長時間的屏障作用,面對缺損區(qū)的疏松多孔的一面具有聚集黏附成骨因子的作用,可誘導骨基質(zhì)釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和成纖維細胞生長因子等,而面對結(jié)締組織光滑致密的一面則不會表現(xiàn)骨誘導性。所以即使膠原本身并沒有釋放或結(jié)合這些成骨因子的能力,它結(jié)合了對這些因子具有高結(jié)合能力的細胞外基質(zhì)蛋白[25],就可以使膠原膜聚集骨誘導因子,將先前遷移來的細胞分化成具有成骨性能的細胞,促進新骨的生成。同時,I型膠原蛋白可以在成骨細胞分化中起到直接和重要的作用[26-27]。同時,許多臨床醫(yī)生報道在GBR中使用Bio-Gide膠原膜取得了較高的成功率[4]。
本實驗中將巴沙魚皮膠原蛋白支架材料、Bio-Gide膠原膜和人工骨替代物Bio-Oss配合使用。分別于GBR術(shù)后的8、12周時觀察發(fā)現(xiàn),B組(巴沙魚皮膠原蛋白膜)和C組(Bio-Gide膠原膜)在組織學表現(xiàn)上較為類似,8周即可觀察到一定的新生骨小梁并伴有部分未骨化的纖維結(jié)締組織和未完全降解的骨粉顆粒。l2周時兩組的新生骨小梁數(shù)量均顯著增加。無論8周還是12周,各組的新生骨量均為C組最高,其次為B組,8周時,B組與C組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而12周時,C組成骨量高于B組,兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而A組(無膜覆蓋組)的新生骨量則明顯低于B、C組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。12周與8周相比,各組的新生骨量的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組織學觀察顯示,12周時的所有實驗組仍未形成完全成熟的致密骨板和哈弗系統(tǒng),僅可見部分骨小梁融合和少量骨髓腔形成,骨粉均未完全降解完。本結(jié)果表明,巴沙魚皮膠原蛋白膜和Bio-Gide膠原膜均能在GBR技術(shù)中發(fā)揮屏障膜作用,并促進兔顱骨缺損的骨組織再生和修復,成骨效果相差不多。但其促進和引導缺損區(qū)骨組織修復的遠期效果是否存在差異尚需進一步的實驗論證。
表1 各組新生骨量百分比比較 (%,xˉ±s)
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Osteogenetic Effects of Collagen Scaffold Material from Basa Fish (Pangasisushaniltoa) Skin on GBR of Rabbit Skull Defect
CHEN Tong1,WU Gang2,Zulpiye·Ablikim1,ZHU Qing-feng1,WANG Shao-hai1,YI Yang-hua3
(1.ChangHai Hospital Department of Stomatology,Shanghai 200433,China; 2.The 85 Hospital of People’s Liberation Army Department of Stomatology,Shanghai 200052, China; 3.School of Pharmacy, The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
guided bone regeneration;fish collagen;rabbit skull defect models;collagen scaffold material from fish;Dental implants
Q591.2 R782.12
A
1008-6455(2017)02-0076-05
2016-11-12
2017-01-28
編輯/張惠娟
海洋公益性行業(yè)科研專項(201405015;201305013)資助;國家自然科學基金(81271177)資助
王少海(1974-),男,教授;研究方向:口腔修復學;E-mail:48321987@qq.com
易楊華(1946-),男,教授;研究方向:海洋藥物;E-mail:yiyanghua@126.com
陳彤(1990-),女,碩士研究生;研究方向:口腔修復材料學
Abstract: ObjectiveTo research the effects of collagen scaffold material from Basa fish skin on the repair of the rabbit skull defects.MethodsAcycloid skull defect with the diameter of 8mm was made on both sides of the sagittal suture of 12 rabbits.The rabbits were randomly divided in to 3 groups.The skull defects were treated with implantation of Bio-Oss,collagen scaffold material from Basa fish skin+Bio-Oss, Bio-Gide+Bio-Oss, respectively. After 8 and 12 weeks,6 rabbits were sacrificed respectively and the bone samples were examined by HE staining.ResultsCollagen scaffold material from Basa fish skin could play a role as barrier membrane in guiding and promoting osteogenesis in rabbit skull defects. There was no significant difference between group B and group C in promoting osteogenesis at 8 week after treatment(P>0.05) but both more than group A(P<0.05).At 12 week, group B is better than group A(P<0.05)and worse than group C.ConclusionCollagen scaffold material from Basa fish skin can promote osteogenesis in bone defect.