喇文軍，林孝發(fā)，蔣 偉，王 妍，尹衛(wèi)民，林嘉歡，林 峰

不同培養(yǎng)基對皮膚來源的成纖維細(xì)胞增殖、衰老及膠原蛋白分泌的影響

喇文軍1，林孝發(fā)1，蔣 偉1，王 妍1，尹衛(wèi)民2，林嘉歡1，林 峰1

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 廣東 深圳 518055；2．深圳市君焯醫(yī)療美容整形研究所廣東 深圳 518040）

目的：探討不同培養(yǎng)基組成對皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、衰老及膠原蛋白分泌的影響。方法：采用兩步酶消化法從健康人耳后皮膚中獲得成纖維細(xì)胞，依據(jù)培養(yǎng)基種類不同分為A組（FM無血清培養(yǎng)基）、B組（DMEM+10%FBS）、C組（RPMI-1640+10%FBS）、D組（DMEM+F12(1∶1)+10%FBS），采用MTT法、細(xì)胞劃痕實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗、β-半乳糖苷酶試驗、軟瓊脂克隆形成試驗比較不同培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖、遷移、膠原分泌、老化、變異的影響。結(jié)果：采用酶消化法在2d～4d內(nèi)即可從組織塊中獲得大量成纖維細(xì)胞；其中B、D組較A、C組細(xì)胞增殖較快，且趨勢與MTT細(xì)胞增殖相同；劃痕實驗顯示B、D組較A、C組向缺損部位遷移更為明顯；此外，D組膠原蛋白分泌量高于其余三組（P＜0.05），且連續(xù)傳代30次后，細(xì)胞無明顯衰老及瘤變跡象。結(jié)論：兩步酶消化法可快速高效的從人組織塊中獲得成纖維細(xì)胞，且采用DMEM+F12(1∶1)完全培養(yǎng)基有利于促進(jìn)細(xì)胞增殖、分泌膠原蛋白及延緩細(xì)胞衰老。

成纖維細(xì)胞；培養(yǎng)基；膠原蛋白；細(xì)胞增殖；原代培養(yǎng)

醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及人們生活水平的提高，使人類平均壽命得到有效延長的同時，也使延緩衰老漸漸進(jìn)入人類視野。而皮膚作為人體最大的器官，其結(jié)構(gòu)完整、美觀不僅影響著心情，也體現(xiàn)其生活質(zhì)量的高低。因此，越來越多的愛美人士渴望通過醫(yī)療技術(shù)干預(yù)皮膚老化。然而，目前市場主流的抗衰老產(chǎn)品多以化學(xué)藥物或激光療法為主，其短期效果明顯，但長期效果及安全性卻一直備受質(zhì)疑[1-2]。自體細(xì)胞回輸技術(shù)，其采用體外培養(yǎng)自體成纖維細(xì)胞達(dá)一定數(shù)目及活性后，將其回輸入人體執(zhí)行特定皮膚部位老化細(xì)胞的功能，從而對延緩皮膚衰老起到促進(jìn)作用，具有更高的安全性及有效性[3]。然而，如何快速獲得活性細(xì)胞在一定程度上制約了自體細(xì)胞回輸技術(shù)的臨床應(yīng)用。因此，本研究對耳后皮膚中成纖維細(xì)胞進(jìn)行提取，傳代，通過研究不同培養(yǎng)基對成細(xì)胞細(xì)胞增殖、膠原分泌以及細(xì)胞傳代中的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期為該技術(shù)的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料：①正常耳后皮膚組織由深圳市君焯醫(yī)療美容整形研究所提供；A549肺癌細(xì)胞由深圳市大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞資源庫公共技術(shù)服務(wù)平臺提供；②0.25%胰酶，II型膠原酶、人膠原酶I型酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自sigma公司；MTT試劑盒、β-半乳糖苷酶購自碧云天公司；FM無血清培養(yǎng)基購自sciencell公司；Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基、Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基、Nutrient Mixture F-12（F12）培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分組：A組FM無血清培養(yǎng)基，B組DMEM+10%FBS，C組RPMI-1640+10%FBS, D組DMEM+F12(1:1)+10%FBS；

1.2.2 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：無菌條件下取正常耳后皮膚約2cm×3cm，將其放入無菌PBS中迅速帶回實驗室，去掉皮下組織及血管，按體積質(zhì)量比5∶1加入消化液I（0.25%胰酶+0.02EDTA）,4℃過夜處理。第二日取出皮膚，去掉表皮，按體積質(zhì)量比10∶1加入消化液2（1mg/ml II型膠原酶），37℃，2h處理。將上述混懸液過200目篩網(wǎng)，吹打濾過液，并將其等分成4份進(jìn)行離心 500r/min，10min，補加相應(yīng)培養(yǎng)基重懸后，加到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2過夜培養(yǎng)，并鏡下觀察細(xì)胞是否呈現(xiàn)放射狀或漩渦狀生長。

1.2.3 細(xì)胞增殖實驗：單層成纖維細(xì)胞經(jīng)消化液1消化后，依據(jù)分組情況，加入相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度至約5×103個/ml，以100μl/孔接種于6塊96孔板中，每組12個孔，且96孔板外圍不設(shè)實驗孔。隨后將6塊96孔板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在12h、24h、48h、72h、96h、120h時間點取一塊96孔板棄去培養(yǎng)液，加入MTT（50μl/孔），37℃、5%CO2培養(yǎng)4h，緩慢吸取培養(yǎng)液并用清水沿孔壁吸取未反應(yīng)的MTT，濾紙拍干，隨后加入DMSO（150μl/孔），室溫振蕩10min，在波長490nm下讀取各孔吸光度值，并計算各組吸光度平均值。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實驗：將四種培養(yǎng)基培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，按2×105cell/孔，接種至6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜至細(xì)胞鋪滿六孔板，采用無菌槍頭在六孔板底部人為劃出幾道橫，PBS清洗3次后，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，每隔2h在同一部位拍照觀察細(xì)胞遷徙情況。

1.2.5 膠原酶分泌：將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每次傳代前，吸取細(xì)胞上清液-20℃凍存，PBS清洗一次，加入消化酶1消化3min，離心，取出消化酶1,加入培養(yǎng)基重懸，吸取一半補加入原瓶37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，共收集各組在傳代前、傳代1次、傳代2次、傳代3次、傳代4次上清液，離心3 000r/min,10min，將樣品存于-20℃冰箱備用，并按照試劑盒說明書進(jìn)行人膠原蛋白酶I酶聯(lián)免疫試驗。

1.2.6 細(xì)胞衰老：采用β-半乳糖苷酶檢測試劑盒，大致步驟如下：將細(xì)胞傳代按5×104cell/孔接種至6孔板中，PBS清洗，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫放置15min，吸棄固定液，PBS清洗3次，3min/次，加入1ml染色液放置于不含CO237℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，隔日顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.2.7 軟瓊脂克隆形成實驗：配置2X DMEM-F12完全培養(yǎng)基（含2X FBS），并與等體積1.2%低熔點瓊脂混合加入6孔板中，每孔1.6ml，常溫放置待其凝固。將傳代30次的成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、離心，添加2X完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至1×105cell/ml；另將2X DMEM-F12完全培養(yǎng)基與等體積0.7%低熔點瓊脂糖混合后，并加入100μl細(xì)胞懸液混勻，添加至含有下層凝固的瓊脂完全培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱10d～14d后，每孔加入1ml(0.01%)結(jié)晶紫，室溫染色10min，拍照計數(shù)。其中，本實驗以A549肺癌細(xì)胞作為陽性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件，對其中計量資料以（xˉ±s）表示，并進(jìn)行重復(fù)資料方差分析或成組t檢驗。當(dāng)P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)：皮膚組織經(jīng)消化液1及消化液2處理后，各組均在37℃，5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。其中B、D組在培養(yǎng)72h后均可見大量成纖維細(xì)胞及少量上皮樣細(xì)胞（見圖1A），依據(jù)兩種細(xì)胞對消化酶I耐受度不同，通過3次傳代后，視野下即無上皮樣細(xì)胞（見圖1B）。而A、C組則需培養(yǎng)96h以上才可達(dá)到細(xì)胞融合度80%以上并進(jìn)行傳代。

2.2 MTT實驗結(jié)果：其結(jié)果顯示，培養(yǎng)24h后，四組細(xì)胞均開始增殖。其中B組、D組細(xì)胞在培養(yǎng)48～72h細(xì)胞增殖最快，而A、C組在72～96h增殖快。經(jīng)統(tǒng)計分析，四組在培養(yǎng)72h后，OD值差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.353,P=0.034）（見圖2）。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗：自細(xì)胞劃痕后24h內(nèi)，每隔2h對細(xì)胞遷徙情況進(jìn)行拍照，其結(jié)果顯示，當(dāng)采用D組培養(yǎng)液細(xì)胞遷移速度明顯快于其余各組。見圖3。

2.4 膠原蛋白檢測：各組均先扣除傳代前膠原蛋白含量，其中A組細(xì)胞分泌膠原含量相對穩(wěn)定，而B、D組在傳代3次后膠原分泌達(dá)到最大后膠原分泌量逐漸減少，見表1。

圖1 細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞MTT實驗結(jié)果

表1 各組細(xì)胞膠原蛋白分泌檢測 （xˉ±s）

2.5 β-半乳糖苷酶：自細(xì)胞傳代至38代時，對四組細(xì)胞分別進(jìn)行β-半乳糖苷酶檢測，其中B組細(xì)胞衰老明顯，而C組次之，A、B組較不明顯。見圖4。

2.6 軟瓊脂克隆形成實驗：以A549肺癌細(xì)胞為陽性對照品，其結(jié)果顯示，皮膚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)30代后，接種在軟瓊脂上培養(yǎng)15d后，不形成克隆且細(xì)胞均死亡，見圖5。

3 討論

衰老是人類生命歷程中不可缺少的環(huán)節(jié)，且往往從一個細(xì)胞群的老化為起點。而成纖維細(xì)胞作為是皮膚中重要的細(xì)胞之一，其不僅能合成及分泌膠原蛋白來維持皮膚彈性及韌性，同時也可在皮膚受到損傷時，參與組織修復(fù)。而目前研究證實，成纖維細(xì)胞活性減弱，膠原蛋白分泌量減少是皺紋產(chǎn)生的重要因素[4]。目前抗皺化妝品種多含有人表皮神經(jīng)生長因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子等，這類生長因子也主要作用于成纖維細(xì)胞[5]。此外，針對皮膚性疾病或燒傷等意外引起的皮膚缺損，單靠自體皮膚移植已不能滿足臨床應(yīng)用需求，若能在短時間內(nèi)，通過體外培育出大量的人表皮成纖維細(xì)胞或?qū)榕R床應(yīng)用提供新的思路。由此可見，表皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)具有極高的臨床應(yīng)用價值。

圖3 細(xì)胞遷移實驗

圖4 各組細(xì)胞衰老實驗

圖5 軟瓊脂克隆形成實驗

針對以往研究中多采用包皮組織作為實驗用皮膚，雖其具有取材方便的優(yōu)點，但皮膚來源均為男性，在實際應(yīng)用中并不能廣泛代表所有人群皮樣特點。而鑒于大多數(shù)人群的耳后皮膚在實際生活中均較少受到摩擦，皮膚細(xì)胞更替慢，其個體間差異較小，從而能更具有廣泛性結(jié)果。因此，本研究特以人耳后皮膚作為實驗用組織。另外，本研究采用酶消化法替代植塊法。對于0.5cm×0.5cm皮膚塊，經(jīng)酶消化后24h即可見成纖維細(xì)胞貼壁，消化后72～96h可見大量成纖維細(xì)胞貼壁，不僅保證的細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞正常形態(tài)，同時減少細(xì)胞增殖次數(shù)，縮短實驗周期。而朱靜、叢敬[6-7]等采用植塊法，不僅操作步驟繁瑣如及時翻轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶等，且細(xì)胞需培養(yǎng)14d以上才可順利進(jìn)行傳代，且遠(yuǎn)離組織塊處細(xì)胞已明顯變大、老化，使得獲得細(xì)胞質(zhì)量及數(shù)量均不如酶消化法。陳甫寰、趙洪良[8-9]等采用酶消化法處理人皮膚組織，其獲得的目的細(xì)胞時間大大縮短。此外，針對酶消化法中的殘留的表皮細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)報道[10]，表皮細(xì)胞較成纖維細(xì)胞更加耐受胰酶，但貼壁速度慢，因此采用快速酶消化，早期替換培養(yǎng)液的方法可獲得高純度的成纖維細(xì)胞。

雖然采用酶消化法可在短時間內(nèi)獲得大量成纖維細(xì)胞，但成纖維細(xì)胞是否也有自身偏愛的營養(yǎng)成分？我們發(fā)現(xiàn)，采用DMEM+F12培養(yǎng)基可有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖，采用RPMI-1640培養(yǎng)基時，細(xì)胞增殖速度相對緩慢，而MTT實驗進(jìn)一步證實了，即使是相同細(xì)胞密度下，DMEM及DMEM+F12對于細(xì)胞的促增殖作用也明顯高于RPMI-1640及FM無血清培養(yǎng)基。如以往文獻(xiàn)報道[11]，貼壁類細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)時可獲得較快生長速度，其高濃度的細(xì)胞增殖成分使得剛分離的成纖維細(xì)胞可快速適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。此外，考慮臨床應(yīng)用細(xì)胞的部位多為受損或老化部位，因此本文通過人為創(chuàng)造創(chuàng)面，來模擬細(xì)胞在注射入人體內(nèi)后的遷移情況。其結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞填充創(chuàng)面速度為：DMEM+F12≥DMEM＞FM＞RPMI-1640。但對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，DMEM細(xì)胞形態(tài)變大，而DMEM+F12仍保持原有細(xì)胞形態(tài)。由于細(xì)胞衰老時多出現(xiàn)細(xì)胞核增大現(xiàn)象，以便利于細(xì)胞吸收更多物質(zhì)。而衰老細(xì)胞在分泌膠原蛋白、纖維粘連蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)能力明顯減弱，而這類物質(zhì)不僅對細(xì)胞起到支撐、連接作用，同時也是細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的重要橋梁[12-13]。因此，在保證細(xì)胞增殖速度的同時，更要防治細(xì)胞過早衰老。雖然DMEM細(xì)胞營養(yǎng)成分濃度較高，但其營養(yǎng)成分種類較少，而F12培養(yǎng)基似乎可以彌補DMEM在此方面的缺陷，從而在促進(jìn)細(xì)胞增殖過程中，避免了細(xì)胞過度老化[15]。而從β-半乳糖苷酶結(jié)果也驗證了以上猜測，對以上四組細(xì)胞進(jìn)行相同次數(shù)傳代至38代可知，DMEM培養(yǎng)下的細(xì)胞衰老速度明顯快于其余三組細(xì)胞，而其余三組未見明顯差異。

另外，細(xì)胞自體回輸，除了要保證細(xì)胞數(shù)量，其質(zhì)量及安全性也至關(guān)重要。其中膠原蛋白分泌量是檢驗成纖維細(xì)胞活性的最佳標(biāo)準(zhǔn)之一[15]。而對四組細(xì)胞培養(yǎng)液中膠原蛋白進(jìn)行ELISA結(jié)果顯示，F(xiàn)M無血清培養(yǎng)基可使細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)膠原蛋白，而DMEM+F12則有利于提高細(xì)胞前期膠原蛋白表達(dá)。另外，我們對培養(yǎng)30代的D組成纖維細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實驗，其結(jié)果證實，在體外培養(yǎng)30代情況下，細(xì)胞暫時可保持正常生長狀態(tài)，無明顯腫瘤化生長跡象。

綜上所述，采取酶消化法有助于快速從人皮膚組織中獲得成纖維細(xì)胞，而采用DMEM+F12培養(yǎng)基有助于成纖維細(xì)胞的增殖及膠原蛋白的分泌。

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The Effects of Different Culture Medium on the Proliferation, Aging and Collagen Secretion of Fibroblasts From Skin

LA Wen-jun1,LIN Xiao-fa1,JIANG Wei1,WANG Yan1,YIN Wei-min2,LIN Jia-huan1,LIN Feng1
(1.School of Applied Chemistry and Biotechnology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055, Guangdong,China; 2.Institute for Jun Zhuo Medical Cosmetology and Plastic Surgery of Shenzhen,Shenzhen 518040,Guangdong,China)

Objective To investigate the effects of different culture medium on the proliferation, aging and collagen secretion of fibroblasts.MethodsFibroblasts were obtained from healthy human ear skin after using two-step enzyme digestion method. According to different kinds of culture medium, they were divided into A group (serum-free medium), B group (DMEM+10%FBS), C group (RPMI-1640+10%FBS), and D group (DMEM+F12 (1∶1) +10%FBS), MTT assay,cell scratch assay,enzyme-linked immunosorbent assay,beta galactosidase assay,and soft agar colony formation test were used to compare the effects of different medium on cell proliferation,migration, collagen secretion,aging and mutation.ResultsA large number of fibroblasts were obtained from the tissue by enzyme digestion within 2d-4d; group B and group D proliferated more rapidly than group A and group C, which was the same as MTT cells proliferation;the result of scratch test showed that group B and group D migrated to the defect site more obviously than group A and group C; in addition, the collagen secretion of group D was the highest in all the four groups (P＜0.05),and after 30 passages,cells had no obvious signs of aging and neoplasia.ConclusionUsing two-step enzyme digestion method can obtain fibroblasts from human tissue quickly and efficiently, and the use of DMEM+F12 (1∶1) complete culture medium is beneficial to promote cell proliferation and collagen secretion and to delay cell aging.

fibroblasts; culture medium; collagen; cell proliferation; primary culture

Q813.1

A

1008-6455（2017）02-0068-05

2016-10-18

2016-12-25

編輯/張惠娟

深圳市科技創(chuàng)新委（GGJS20130331152344401）

林峰，男，教授，研究方向為精細(xì)化工；E-mail：linf2000@szpt.edu.cn