（武漢大學 資源與環(huán)境科學學院，武漢 430079）

富營養(yǎng)化淡水中黑色金屬試樣腐蝕加速的微生物學機制研究

呂博學，崔佳鑫，毛旭輝，甘復興

（武漢大學 資源與環(huán)境科學學院，武漢 430079）

目的探究黑色金屬在污染淡水中后期腐蝕加速規(guī)律的生物學機制。方法采用高通量測序分析A3鋼在富營養(yǎng)化水體和清潔水體中腐蝕產(chǎn)物內(nèi)微生物的種群結(jié)構(gòu)，并結(jié)合元素分析和XPS分析。結(jié)果獲得了A3鋼的腐蝕產(chǎn)物內(nèi)微生物的門水平物種分布柱狀圖、OTU估計數(shù)統(tǒng)計表、OTU韋恩圖、硫酸鹽還原菌各屬的相對豐度、微生物屬水平熱圖等數(shù)據(jù)。結(jié)論在富營養(yǎng)化水體中，硫酸鹽還原菌呈現(xiàn)更顯著的水平，造成金屬的硫化腐蝕更為嚴重，驗證了黑色金屬在富營養(yǎng)化污染淡水水體中后期腐蝕速率反轉(zhuǎn)加速的現(xiàn)象。

富營養(yǎng)化；金屬腐蝕；高通測序；硫酸鹽還原菌

我國的淡水資源短缺，而淡水水體污染的程度之深、范圍之廣，已逐漸成為環(huán)境污染中的一個突出問題。富營養(yǎng)化是水污染的一種常見形式，水體中氮、磷等營養(yǎng)水平超出水生生態(tài)系統(tǒng)的自凈能力，從而造成水體中浮游植物大量增加、溶解氧消耗以及特定魚種和沉水植物減少等一系列負面影響[1—2]。淡水環(huán)境是金屬材料服役的重要場所，而淡水水體富營養(yǎng)化之后，其水質(zhì)環(huán)境的變化必然會引起結(jié)構(gòu)金屬的腐蝕行為的改變[3—4]。

通過多年的清潔水體和污染水體的現(xiàn)場掛片試驗，對比發(fā)現(xiàn)碳鋼黑色金屬在富營養(yǎng)化污染淡水水體中前期腐蝕速度比清潔淡水水體低，而后期則會發(fā)生腐蝕速率反轉(zhuǎn)加速[5]。R. E. Melchers等認為[6—7]，黑色金屬在自然水體中的腐蝕分為幾個階段，其中第一階段和第二階段都是與氧濃度有關(guān)的好氧腐蝕過程，氧的擴散速率對于這兩個階段的腐蝕起到?jīng)Q定性作用。腐蝕的第三階段是好氧向厭氧腐蝕的轉(zhuǎn)換階段，而第四階段則是黑色金屬的厭氧腐蝕線性階段。在富營養(yǎng)化水體中，溶解氧的濃度低，因此，在初期階段可以觀測到富營養(yǎng)化水體中黑色金屬的腐蝕速率更低，而在厭氧腐蝕階段，金屬腐蝕與水體污染程度的相關(guān)性尚不明確。

通過多年的淡水掛片發(fā)現(xiàn)，富營養(yǎng)化淡水中黑色金屬的厭氧腐蝕更加顯著，說明富營養(yǎng)化水體中存在造成黑色金屬厭氧腐蝕加速的因素。S.A. Main和T.H. Arnold在早期發(fā)現(xiàn)，硫酸鹽還原菌（SRB）參與了碳鋼的腐蝕[8]?？紤]到金屬的垢下厭氧腐蝕與微生物密切相關(guān)，對全浸3年的金屬試樣的腐蝕產(chǎn)物進行了取樣研究，首次采用高通量生物測序，分析了腐蝕產(chǎn)物內(nèi)微生物的種群結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果為探索黑色金屬在污染淡水中的后期腐蝕加速規(guī)律的生物學機制，提供了有價值的線索。

1 實驗方法

按照GB 5776—1986《金屬材料在表面海水中常規(guī)暴露腐蝕試驗方法》，制備了Q235鋼試樣。對鋼樣進行6，12，18，24，30，36個月等6個周期掛片試驗。全浸腐蝕試驗的地點選擇在武漢東湖的沙灘浴場全浸掛樣點（輕度富營養(yǎng)化水體）和湖南龍源水庫（一類清潔水體）。兩個掛樣點的水質(zhì)參數(shù)見表1，一般認為總氮(TN)質(zhì)量濃度ρTN為 0.2 mg/L、總磷(TP) 質(zhì)量濃度ρTP為0.02 mg/L是判定水體富營養(yǎng)化的標準[9]。

表1 現(xiàn)場腐蝕掛片試驗點水質(zhì)情況

淡水環(huán)境掛片樣品的腐蝕產(chǎn)物取樣與高通量測序分析。將在水體中浸沒36個月的樣品從水體中取出（東湖和龍源水庫兩處的現(xiàn)場掛片樣），去除表面覆蓋的藻類和泥沙，采集樣品底部的銹層（樣品a為污染水體的樣品，樣品b為清潔水體的樣品）。冷凍保存后，在1個星期內(nèi)進行腐蝕產(chǎn)物中微生物的高通量測序分析，比較二者的細菌種群差異，特別是硫酸鹽還原菌的分布情況。腐蝕產(chǎn)物的C，H，N，S元素分析采用Elementarvario EL-III 元素分析儀器，XPS分析采用Thermo Scientific公司的Escalab 250Xi型號測試儀。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 富營養(yǎng)化淡水中黑色金屬腐蝕反轉(zhuǎn)加速的現(xiàn)象

圖1給出了A3鋼樣在富營養(yǎng)化水體和清潔水體中4年期掛樣的腐蝕速率的對比。在全浸試驗第一時間階段（0～580天），金屬在富營養(yǎng)化水體的腐蝕速率要低于清潔水體；在580天以后，相對于清潔水體，A3鋼的腐蝕速率增加更為明顯，呈現(xiàn)出后期“反轉(zhuǎn)加速”的規(guī)律。在4年的試驗周期內(nèi)，A3鋼在富營養(yǎng)化淡水中腐蝕減薄達到0.13mm，而在清潔水體中腐蝕只有0.09mm。這一結(jié)果表明，對于湖泊、水庫等淡水水體環(huán)境中的鋼結(jié)構(gòu)材料，富營養(yǎng)水質(zhì)條件會加速金屬材料的腐蝕。A3鋼金屬材料在全浸580天后，已經(jīng)形成較厚的腐蝕層，因此，腐蝕過程主要是垢下的厭氧腐蝕過程?？紤]到這一過程與硫酸鹽還原菌等微生物過程密切相關(guān)，因此需要采用分子生物學手段進一步研究。

圖1 富營養(yǎng)化水體中A3鋼樣腐蝕后期反轉(zhuǎn)加速的現(xiàn)象[5]

2.2 金屬試樣腐蝕產(chǎn)物中微生物的高通量測序分析

硫酸鹽還原菌 (Sulfate-Reducing Bacteria，簡稱SRB) 是一類能把硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等硫氧化物以及元素硫還原形成硫化氫的細菌統(tǒng)稱[10]。它廣泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油氣井等缺氧環(huán)境中，在無氧或極少氧情況下，能利用金屬表面的有機物作為碳源，并利用細菌生物膜內(nèi)產(chǎn)生的氫作為主電子給體，將硫酸鹽還原成硫化氫，從氧化還原反應(yīng)中獲得生存的能量[11—13]。相比于清潔水體，富營養(yǎng)化水體中有機物增多導致微生物大量生長繁殖，消耗掉水中的溶解氧使得水體含氧量下降，同時營養(yǎng)水平增加，形成微生物的共代謝物質(zhì)，有利于硫酸鹽還原菌等厭氧性微生物的生長。

兩個樣品（樣品a為富營養(yǎng)化水體金屬樣的內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物，樣品b為清潔水體的對照樣）在門水平的物種分布如圖2所示，可以看出，微生物的種類以及各微生物的序列數(shù)，即各微生物的相對豐度。微生物群落中存在最多的為藍藻細菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），這三類微生物的總相對豐度在兩個樣品中都達到了80%以上。

圖2 門水平物種分布

該研究在97%相似水平下的OTU 進行生物信息統(tǒng)計分析[14]，見表2。樣品a和樣品b中被分入所有OTU中的總優(yōu)化序列數(shù)（Reads）分別為21501和21079，而樣品優(yōu)化序列劃分得到的OTU數(shù)目則分別為3621和4336。表明樣品a（污染水體中金屬的內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物）的微生物種類相比于樣品b（清潔水體金屬的內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物）較少。表2中Reads SRB表示被分入硫酸鹽還原菌的總優(yōu)化序列數(shù)，樣品a和樣品b中的序列數(shù)分別為333和63，在一定程度上顯示污染水體樣品中硫酸鹽還原菌的數(shù)量高于清潔水體樣品。OTUSRB表示在劃分得到的OTU中硫酸鹽還原菌的OTU數(shù)目，可以看出，在污染水體樣品腐蝕產(chǎn)物中硫酸鹽還原菌的OTU數(shù)目要高于清潔水體樣品，即樣品a硫酸鹽還原菌的種類也要多于樣品b。

圖3 全浸試樣腐蝕產(chǎn)物中的硫酸鹽還原菌OTU韋恩圖

表2 樣品中OTU估計數(shù)統(tǒng)計(97%的相似水平)

圖3表示的是污染水體金屬試樣（樣品a）和清潔水體金屬試樣（樣品b）腐蝕產(chǎn)物中硫酸鹽還原菌OTU數(shù)目的韋恩圖，顯示金屬試樣硫酸鹽還原菌總的OTU數(shù)目為71。其中兩種環(huán)境下腐蝕產(chǎn)物都含有的硫酸鹽還原菌OTU的數(shù)目為15，污染水體腐蝕產(chǎn)物獨有的數(shù)目為38，清潔水體獨有的數(shù)目為18。

通過測序分析，還發(fā)現(xiàn)的硫酸鹽還原菌分布在以下目：綠菌目（Chlorobiales）、脫硫盒菌目（Desulfarculales）、脫硫桿菌目（Desulfobacterales）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）、硫還原菌目（Desulfurellales）、除硫單胞菌目（Desulfuromonadales）和互營桿菌目（Syntrophobacterales）。其中數(shù)量最多的為脫硫弧菌目（Desulfovibrionales），脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）下面包括四個科，分別為脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae），脫硫化鹵菌科（Desulfohalobiaceae），脫硫化微菌科（Desulfomicrobiaceae）和脫硫化蘇打菌科（Desulfonatronumaceae）。樣品中所有的脫硫弧菌屬均為脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）中的脫硫弧菌屬（Desulfovibrio），其對應(yīng)的序列總數(shù)為182，占硫酸鹽還原菌對應(yīng)序列總數(shù)（333）的54.7%。表3顯示的是硫酸鹽還原菌在屬水平上的相對豐度，同樣說明在樣品a中硫酸鹽還原菌的量要多于樣品b。由上述的分析可以看出，硫酸鹽還原菌群落中的優(yōu)勢菌種為脫硫弧菌屬，并且在污染水體樣品的腐蝕產(chǎn)物中，硫酸鹽還原菌無論從種類和數(shù)量來說，都呈現(xiàn)更加顯著的水平。

從兩個樣品的屬水平熱圖（如圖4所示）可以看出，樣品中微生物群落的差異性。圖4中脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）在樣品a和樣品b中分別為淺灰色和黑色，這反映出脫硫弧菌屬在樣品a（即污染水體腐蝕產(chǎn)物）中豐度較高，而在樣品b（清潔水體樣品）中很低。

表3 在屬水平上硫酸鹽還原菌各屬的相對豐度

在自然環(huán)境中，氮磷等營養(yǎng)元素能夠促進微生物的繁殖，這已經(jīng)是公認的現(xiàn)象，也是氮磷水平較高的水體容易發(fā)生水華現(xiàn)象的原因。例如，磷是合成核酸、磷脂、一些輔酶及高能磷酸化合物的重要原料，細菌在有磷源培養(yǎng)基中的生長繁殖，明顯比在無磷源培養(yǎng)基中的好[15—16]。富營養(yǎng)化水體中有豐富的氮、磷物質(zhì)和小分子有機物，這些物質(zhì)能夠滲透到腐蝕產(chǎn)物的內(nèi)層，促進腐蝕產(chǎn)物中包括硫酸鹽還原菌在內(nèi)的微生物生長。因此，可以觀測到在富營養(yǎng)化水體中金屬內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物中，硫酸鹽還原菌的種類和豐度都呈現(xiàn)更高的水平。該研究采用高通量測序這一先進手段，進一步提供了在自然腐蝕條件下氮磷水平促進硫酸鹽還原菌繁殖的證據(jù)。

圖4 全浸試樣腐蝕產(chǎn)物中的微生物屬水平熱圖

2.3 腐蝕產(chǎn)物的元素分析和XPS分析

高通量測序的結(jié)果充分說明在富營養(yǎng)化淡水中，金屬內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物中廣泛存在硫酸鹽還原菌。進一步分析內(nèi)層腐蝕產(chǎn)物的硫元素含量，特別是低價硫元素的存在（因為水體中不含有低價硫），能夠確證硫酸鹽還原菌是否對金屬加速腐蝕產(chǎn)生了作用。表4是富營養(yǎng)化水體（樣品a）和清潔水體（樣品b）金屬試樣底層腐蝕產(chǎn)物的元素分析結(jié)果?？梢钥闯?，富營養(yǎng)化水體中金屬腐蝕產(chǎn)物的C，N含量明顯增高，S含量也高于清潔水體。進一步采用XPS研究了靠近金屬基體界面的腐蝕產(chǎn)物，結(jié)果（如圖 5所示）能夠清楚地反映出，富營養(yǎng)化水體中金屬腐蝕產(chǎn)物包含SO42-，—HS和S2-，而清潔水體的樣品中僅含有SO42-。SBR在生長和繁殖過程中可將SO42-還原為H2S，從而確證了富營養(yǎng)化水體中金屬的厭氧腐蝕過程的發(fā)生。因此，在腐蝕發(fā)生的后期，硫酸鹽還原菌的活性在富營養(yǎng)化水體中更強，造成硫化物增多，使得金屬的腐蝕加劇。

表4 金屬掛片試樣表面腐蝕產(chǎn)物元素分析 %

圖5 兩種水體中金屬腐蝕產(chǎn)物的S2p3/2 XPS光譜及分峰[17]

3 結(jié)論

在富營養(yǎng)化水體中，黑色金屬腐蝕產(chǎn)物中的硫酸鹽還原菌，在種類和數(shù)量上都呈現(xiàn)更顯著的水平，并且硫酸鹽還原菌群落中的優(yōu)勢菌種為脫硫弧菌屬。在金屬腐蝕的后期，腐蝕垢下的厭氧腐蝕已經(jīng)成為金屬腐蝕減薄的主要原因。由于富營養(yǎng)化水體中，氮磷的營養(yǎng)水平更高，造成硫酸鹽還原菌繁殖更多、活性更高，造成金屬的硫化腐蝕更為嚴重，出現(xiàn)了腐蝕速率高于清潔水體的反轉(zhuǎn)加速現(xiàn)象。從富營養(yǎng)化水體的腐蝕產(chǎn)物中檢出了金屬硫化物，證實了這一推斷的正確性。綜上所述，通過該實驗的研究工作，確證了黑色金屬在富營養(yǎng)化淡水中后期反轉(zhuǎn)加速的現(xiàn)象，并通過高通量測序、腐蝕產(chǎn)物分析，進一步明確了氮磷水質(zhì)環(huán)境中硫酸鹽還原菌在后期反轉(zhuǎn)加速中的作用。

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Microbiological Mechanisms for Accelerated Corrosion of Black Metals in Eutrophic Fresh Water

LYU Bo-xue, CUI Jia-xin, MAO Xu-hui, GAN Fu-xing
(School of Resource and Environmental Sciences, Wuhan University,Wuhan 430079,China)

ObjectiveTo explore the biological mechanism for acceleration rules in later corrosion of black metal in polluted fresh water.MethodsHigh-throughput sequencing was used for the first time to analyze the microbial community structure in the corrosion products of A3 steel in eutrophic and clean water, combining elements analysis and XPS analysis.ResultsData on corrosion products of A3 steel were obtained, including the microbial species distribution histogram on gate level, statistical tables of OTU estimate number, OTU Wayne map, relative abundances for each genus of sulfate-reducing bacteria and microbial infraredimages on genus level.ConclusionSulfate-reducing bacteria in corrosion products are more significant in eutrophic water, causing more serious metal sulfide corrosion. Finally, the phenomenon of reversed acceleration corrosion in later corrosion of black metal in polluted eutrophic fresh water is verified..

eutrophication; metal corrosion; high-throughput sequencing; sulfate-reducing bacteria

10.7643/ issn.1672-9242.2017.02.004

TJ04；TG172

A

1672-9242(2017)02-0019-05

2016-11-06；

2016-12-08

呂博學（1994—），男，碩士研究生，主要研究方向為電化學材料與環(huán)境修復。