黃江鴻王大平熊建義*丁文斌王大明劉威尤微朱偉民段莉陳潔琳劉啟頌賈兆鋒

三維打印雙相磁性納米復(fù)合支架材料的性能測(cè)定*

黃江鴻1,2,3王大平1,2,3熊建義1,2,3*丁文斌4王大明1,2,3劉威1,2,3尤微1,2,3朱偉民1,2,3段莉1,2,3陳潔琳1,2,3劉啟頌1,2,3賈兆鋒1,2,3

目的研究制備出一種新型雙相磁性納米復(fù)合支架材料（PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3），通過(guò)各項(xiàng)生物學(xué)性能檢測(cè)，評(píng)價(jià)并探討其作為骨組織工程支架的可行性。方法通過(guò)低溫快速成型方法制備雙相磁性納米復(fù)合支架材料（PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3），采用電子試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)支架材料的抗彎，抗壓，彈性模量評(píng)價(jià)其力學(xué)性能，通過(guò)電鏡觀察支架材料超微結(jié)構(gòu)；以介質(zhì)（乙醇）浸泡法測(cè)定支架材料的孔隙率，將支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合共培養(yǎng)，檢測(cè)其生物相容性。結(jié)果雙相磁性納米復(fù)合支架材料力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示其具有良好的力學(xué)性能，電鏡觀察結(jié)果顯示上下兩層孔徑均勻分布，上層軟骨相孔徑較小，中間連續(xù)相良好融合，孔徑及孔隙率檢測(cè)結(jié)果顯示軟骨層支架的孔徑為189um，孔隙率86.5%。骨層支架的孔徑為364um，孔隙率77.1%，符合雙層支架材料的設(shè)計(jì)要求。雙相磁性納米復(fù)合支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖效果很好，能更好的促進(jìn)分化為目的細(xì)胞，說(shuō)明雙相磁性納米復(fù)合支架材料具有良好的生物相容性。結(jié)論雙相磁性納米復(fù)合支架材料（PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3）有很好的力學(xué)性能和生物相容性，孔徑及孔隙率達(dá)到細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的要求，與正常的關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨生理結(jié)構(gòu)更加接近，有望可以更好的修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎或者外傷等疾病帶來(lái)的軟骨和軟骨下骨損傷。

低溫快速成型；3D打??；雙相磁性納米

臨床上各種疾病，如關(guān)節(jié)炎或者外傷等疾病造成等關(guān)節(jié)軟骨損傷，多伴有軟骨下骨一并損傷，因此，軟骨及軟骨下骨共同修復(fù)比僅修復(fù)軟骨的效果要好。骨組織工程中的支架主要為三維立體的多孔形態(tài)，并需要滿足細(xì)胞粘附、細(xì)胞間的調(diào)節(jié)及相互作用，具有一定的力學(xué)性能和釋放生物活性分子等特點(diǎn)，并可促進(jìn)種子細(xì)胞的誘惑分化和增殖，如形成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的微環(huán)境，促進(jìn)骨或軟骨生組織形成[1]。雙相骨組織工程支架主要原理是由兩層不同的支架空三維空間結(jié)合，將不同或相同的種子細(xì)胞接種于兩層不同的支架，病理檢查其形成不同骨組織類型。因此，這樣的雙相骨組織工程支架可以更好的模擬正常骨組織中不同層次的理化性質(zhì)和生物活性，良好的與軟骨下骨契合，以達(dá)到良好的固定和修復(fù)缺損病灶[2]。

快速成型技術(shù)為制造三維支架材料的主要方法，包括熔融沉積、選擇性激光燒結(jié)、三維打印等，具有制備迅速，數(shù)字化可調(diào)控材料生產(chǎn)，具有支架商品化潛質(zhì)及三維打印可調(diào)控等優(yōu)勢(shì)，目前研究廣泛[3]。低溫快速成型技術(shù)基于結(jié)合相分離法，快速成型，操作簡(jiǎn)便，具有支架成型可控性。低溫環(huán)境下各材料的生物學(xué)活性保持良好，并在打印過(guò)程中可三維控制支架材料的行走及空間孔隙率，目前已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程支架的制備[4]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)低溫成型技術(shù)制備出一種新型的雙相磁性納米復(fù)合支架材料（PLGA/Col-IPLGA/n-HA/Fe2O3），并檢測(cè)復(fù)合材料的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

聚乳酸-聚羥基乙酸（PLGA），I型膠原（Col-I），納米羥基磷灰石（n-HA），磁性三氧化二鐵（Fe2O3）（深圳欣城生物科技有限公司）；低溫快速成型儀（中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院），力學(xué)試驗(yàn)機(jī)CTM4000，（深圳清華大學(xué)研究院），電子顯微鏡（MIRA3TESCAN，深圳清華大學(xué)研究院）。1.2PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的制備方法

1.2.1 軟骨相支架溶液配制

向PLGA加入有機(jī)溶劑（1,4-二氧六環(huán)），混勻，加入Col-I粉末，配成質(zhì)量比為20%的溶液。震蕩15分鐘，電磁攪拌12小時(shí)，混勻。

1.2.2 骨相支架溶液配制

向PLGA加入有機(jī)溶劑（1,4-二氧六環(huán)），混勻，按質(zhì)量比加入n-HA，F(xiàn)e2O3，配成20%的溶液。震蕩15分鐘，電磁攪拌12小時(shí)，混勻。

1.2.3 PLGA-Col-I/PLGA-n-HA-Fe2O3制備

在低溫快速成型儀上，先打印出軟骨相PLGA-Col-I，再打印骨相PLGA-n-HA-Fe2O3，-4℃條件下打印，先將配置的溶液轉(zhuǎn)入低溫快速成型儀中打印，打印出具有一定間隔的空間平行排列的三維材料初產(chǎn)品，此時(shí)具有一定的孔隙，向三維材料的孔隙中加入配制好的生物復(fù)合材料溶液，填充，材料表面磨平整理，使加入的復(fù)合材料均勻分布，重復(fù)以上步驟。

成形后藏室，復(fù)合材料中冰融化的空余空間即為磁性納米多孔人工骨支架材料的初步空間孔隙，真空冷凍干燥，以此去除有機(jī)溶劑；風(fēng)干2天，代有機(jī)溶劑升華后，三維復(fù)合支架材料的空間孔隙將進(jìn)一步增大，即得所需的到PLGACol-I/PLGA-n-HA-Fe2O3復(fù)合材料（見圖1，彩圖見插頁(yè)）。

圖1 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料

1.3 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的生物學(xué)性能檢測(cè)

力學(xué)性能測(cè)試：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度、彎曲強(qiáng)度、彎曲模量測(cè)試均在抗彎拉伸實(shí)驗(yàn)室的三思電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)CTM4000，用三點(diǎn)彎曲法予以表征，測(cè)試指點(diǎn)的跨距為20mm，加載速率為5.00mm/min。

顯微結(jié)構(gòu)觀察：制備PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的新鮮斷口，噴金處理后，進(jìn)行斷口掃描分析，用捷克泰思肯的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，圖像為二次電子圖像和背散射電子圖像，觀察分析試樣橫斷面的形態(tài)和顯微特征。

孔隙率的測(cè)定：采用介質(zhì)（乙醇）浸泡法測(cè)定。先測(cè)得PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料總體積（V）及質(zhì)量m1，浸入乙醇，充分填滿孔隙，吸去表面乙醇，測(cè)出此時(shí)支架總質(zhì)量m2，計(jì)算孔隙率：=（m2-m1）/乙醇V。

主要觀察指標(biāo)：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的生物力學(xué)性能（拉伸強(qiáng)度、彎曲強(qiáng)度、彎曲模量），橫斷面微觀結(jié)構(gòu)，孔隙率。

1.4 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的生物相容性研究

取3月齡新西蘭大白兔，常規(guī)麻醉、消毒備皮，左側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子處骨穿，用含有2mL肝素注射器抽取約3mL骨髓。置于10mL離心管，加入PBS液至5mL，1200r/min離心10分鐘，棄上清，再加PBS液1000r/min洗滌2次。將沉淀的細(xì)胞懸液加入5mL高糖DMEM培養(yǎng)液中（含有10%FBS、1%雙抗（青霉素/鏈霉素）），5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)。48小時(shí)后換液，每2～3天換液1次，待貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞集落80%融合時(shí)傳代（圖2，彩圖見插頁(yè)）。取第3代的BMSCs與復(fù)合材料復(fù)合共培養(yǎng)，觀察復(fù)合材料的生物相容性。

圖2 BMSCs顯微鏡下形態(tài)呈橢圓形、梭形、三角形或不規(guī)則多邊形（100×），A：P0，B：P1，C：P3

1.4.1 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

采用CCK-8法。A、B兩組，每組5個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5、7、9天，于每孔中加入CCK-8液50 L，在37℃孵箱中孵育4小時(shí)，將各孔液體轉(zhuǎn)移到96孔板中，使各孔內(nèi)液體量相等，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)其光吸收值（A值），繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.4.2 立體光學(xué)顯微鏡觀察

分A、B兩組，A組：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料與BMSCs復(fù)合，B組：?jiǎn)渭兊腜LGA支架與BMSCs復(fù)合，共培養(yǎng)1周后的培養(yǎng)板去蓋直接放在立體光學(xué)顯微鏡下放大100倍觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4.3 掃描電子顯微鏡觀察

分為A、B兩組，A組：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料與BMSCs復(fù)合，B組：?jiǎn)渭兊腜LGA支架與BMSCs復(fù)合，共培養(yǎng)1周后，將兩組的材料用PBS清洗2次，2.5%戊二醛4℃固定2小時(shí)，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的黏附情況。

1.4.4 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料與BMSCs復(fù)合后成骨及成軟骨分化研究

將PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料與BMSCs復(fù)合后一周，骨層支架PLGA/n-HA/Fe2O3用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21天，而軟骨層支架PLGA/Col-I則用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21天，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4.4.1 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞Von Kossa染色

將細(xì)胞/支架的復(fù)合體的誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30分鐘，蒸餾水沖洗3次，加入1%硝酸銀放置紫外線孵育1小時(shí)。蒸餾水漂洗3次，流水沖洗10分鐘，加入5%硫代硫酸鈉孵育2分鐘，蒸餾水漂洗后顯微鏡下觀察。

表1 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料力學(xué)性能（±s，n=10）

1.4.4.2 誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

將細(xì)胞/支架的復(fù)合體的誘導(dǎo)的成軟骨細(xì)胞用4%多聚甲醛4℃固定1小時(shí)。用蒸餾水漂洗，配置好1%的甲苯胺藍(lán)染液，加入染液染1小時(shí)。去除多余染液，用PBS漂洗多余的染液，在顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，進(jìn)行方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料力學(xué)性能（見表1）

通過(guò)三點(diǎn)抗彎實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料的力學(xué)性能，結(jié)果顯示雙相磁性納米復(fù)合支架材料與單層的支架材料相比具有更好的力學(xué)性能。

2.2 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)性能

復(fù)合支架的分上下兩層，均為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，上層為軟骨相，相對(duì)下層骨相孔徑較小、稀疏，骨相與軟骨相結(jié)合緊密，孔徑大小差別逐漸過(guò)度，分布均勻。電鏡觀察見上下兩層孔徑均勻分布，上層軟骨相孔徑較小，中間連續(xù)相良好融合（見圖3）。

圖3 A：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料軟骨相掃描電鏡觀（2000×）；B：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料骨相掃描電鏡觀（2000×）；C：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料骨與軟骨相連接處的掃描電鏡觀（2000×）

2.3 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的孔徑及孔隙率

雙相磁性納米復(fù)合支架材料的孔徑及孔隙率檢測(cè)結(jié)果顯示軟骨層支架的孔徑為189um，孔隙率86.5%。骨層支架的孔徑為364um，孔隙率77.1%，符合雙層支架材料的設(shè)計(jì)要求。

表2 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的孔徑及孔隙率（±s，n=10）

表2 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的孔徑及孔隙率（±s，n=10）

支架材料孔徑（um）孔隙率（%）PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O324382.3±0.6 PLGA/Col-I18986.5±0.2 PLGA/n-HA/Fe2O336477.1±0.9

2.4 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料的生物相容性

2.4.1 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

CCK-8法檢測(cè)BMSCs在PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料上面的增殖情況（見圖4，彩圖見插頁(yè)）。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異（＞0.05）。

圖4 BMSCs在PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料表面的增殖率（A組）與組織培養(yǎng)塑料平板上的細(xì)胞增殖率（B組）無(wú)明顯差別（＞0.05）

2.4.2 立體光學(xué)顯微鏡觀察

培養(yǎng)1周后觀察到A組與雙層支架材料復(fù)合的BMSCs呈多角形外觀，細(xì)胞間通過(guò)突起相互間接觸，隨著時(shí)間增殖分化良好，并出現(xiàn)規(guī)則疊層生長(zhǎng)（見圖5-A），而B組與單純的PLGA支架復(fù)合的BMSCs呈多角形外觀，增殖良好，但是細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少（見圖5-B）?？梢婋p層支架材料具有更好的生物相容性。（圖5彩圖見插頁(yè)）

圖5 材料與BMSCs共培養(yǎng)1周的光學(xué)立體顯微鏡觀（100×），A組：細(xì)胞規(guī)則排列生長(zhǎng)，無(wú)雜亂變異生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖良好，數(shù)量較多；B組：細(xì)胞規(guī)則排列生長(zhǎng)，無(wú)雜亂變異生長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖數(shù)量相對(duì)較少

2.4.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡結(jié)果可見A組：PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3復(fù)合材料表面孔隙內(nèi)有大量梭形或多角形細(xì)胞貼附、聚集，而B組的PLGA材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)量較少，證實(shí)雙層支架材料與BMSCs的生物相容性良好（見圖6）。

圖6 材料與BMSCs共培養(yǎng)一周的掃描電鏡觀（2000×）。A組：材料表面孔隙內(nèi)有大量梭形或多角形細(xì)胞貼附、聚集；B組：材料表面表面粘附的細(xì)胞數(shù)量較少

2.4.4 雙層支架材料與BMSCs復(fù)合后成骨及成軟骨分化研究

2.4.4.1 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞Von Kossa染色

骨層支架與BMSCs復(fù)合后誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成礦化結(jié)節(jié)，經(jīng)Von-Kossa染色呈黑色結(jié)節(jié)（圖7，彩圖見插頁(yè)），可見BMSCs與雙層支架復(fù)合后能向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖7 Von Kossa染色顯微鏡下觀察（100×）A：BMSCs；B：BMSCs誘導(dǎo)成骨細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)

2.4.4.2 誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

軟骨層支架與BMSCs復(fù)合后誘導(dǎo)BMSCs向成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后細(xì)胞被染成藍(lán)色（圖8，彩圖見插頁(yè)），可見BMSCs與雙層支架復(fù)合后能向成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖8 甲苯胺藍(lán)染色顯微鏡下觀察（100×）A：BMSCs；B：BMSCs誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞被染成藍(lán)色

3 討論

骨與軟骨組織工程目前主要包括三個(gè)重要組成部分：種子細(xì)胞、細(xì)胞因子及支架材料，支架材料為細(xì)胞載體，為最基本的元素，并要求其各項(xiàng)生物學(xué)特性可促進(jìn)骨與軟骨組織的修復(fù)。理想的支架材料應(yīng)包括以下幾點(diǎn)：①生物相容性良好，對(duì)細(xì)胞毒性低；②可控的降解性；③合適的孔隙結(jié)構(gòu)；④力學(xué)性能良好，可載荷骨缺損部位的力學(xué)負(fù)荷；⑤能夠備承并協(xié)同生長(zhǎng)因子發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞活性、分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)等特點(diǎn)；⑥與周圍組織粘合延續(xù)良好，無(wú)明顯組織排斥反應(yīng)；但目前尚未研究出滿足上述要求的較為滿意的支架材料。

PLGA是由聚乳酸（PLA）和聚羥基乙酸（PGA）按照一定比例形成的高分子共聚物，降解性能及生物力學(xué)性能良好，體外細(xì)胞培養(yǎng)表明其細(xì)胞粘附能力良好，且無(wú)明顯細(xì)胞毒性，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的可用于人體植入的生物材料，因此本研究我們采用PLGA作為雙相復(fù)合支架的主體原材料[5-7]。I型膠原（Col-I）在生物體內(nèi)主要以結(jié)締組織的成分存在。從動(dòng)物的結(jié)締組織中提取膠原蛋白，并通過(guò)合適的方法去除其抗原性物質(zhì)，來(lái)制備成具有合適良好的生物相容性的材料，這種材料具有一定的促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖、降解產(chǎn)物毒性低以及引起的過(guò)敏及發(fā)熱反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。本研究中，在軟骨相的材料中加入Col-I，目的是利用其良好的軟骨特性，復(fù)合BMSCs誘導(dǎo)成軟骨修復(fù)軟骨缺損部位。納米羥基磷灰石（n-HA）為典型的生物陶瓷，其理化性質(zhì)接近人骨組織，為體內(nèi)骨和齒的主要無(wú)機(jī)成分，在納米分子水平，作為生物組織材料，保留了獨(dú)特的納米生物活性，目前骨組織工程領(lǐng)域里作為原材料研究廣泛。已經(jīng)證實(shí)其骨修復(fù)能力良好，并被廣泛應(yīng)用[8,9]，在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在骨相的材料中加入n-HA，目的是利用其良好的成骨特性，復(fù)合BMSCs填充并誘導(dǎo)缺損部位的成骨誘導(dǎo)分化。磁性納米鐵粒子（Fe2O3），不僅保留作為納米材料的生物活性，同時(shí)可以在恒定磁場(chǎng)下定向聚集和定位，即磁響應(yīng)性和超順磁性。在恒定磁場(chǎng)條件下，nFe2O3可通過(guò)偶聯(lián)方式與細(xì)胞表面結(jié)合，使得通過(guò)恒定的磁場(chǎng)進(jìn)行調(diào)控細(xì)胞功能具有一定的可行性[10]。Kazunorl[11]認(rèn)為nFe2O3在恒定的外加磁場(chǎng)條件下具有誘導(dǎo)h-BMSCs分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的能力，可作為一個(gè)可調(diào)控的物理因子及方法應(yīng)用于骨及軟骨的修復(fù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

孔徑和孔隙率是骨與軟骨組織工程支架材料的一個(gè)重要參數(shù)，直接影響到支架材料的力學(xué)性能，并與細(xì)胞生物相容性有關(guān)，與細(xì)胞的粘附和增殖有關(guān)[12]。生物支架材料不僅要求材料具有100～500um的大孔直徑，同時(shí)也應(yīng)包含10～50um的微孔，而對(duì)于其孔隙率并無(wú)明確的定量標(biāo)準(zhǔn)，目前研究認(rèn)為一般將材料的孔隙率控制在40%以上，且要求生物支架材料在三維層面上具有良好的貫通性。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)綜合考慮骨和軟骨的力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)的差異，將雙相復(fù)合支架材料中的軟骨層孔隙率設(shè)定為83%～87%，孔徑150～200um左右；而成骨相中的孔隙率設(shè)定在75%～78%，孔徑300～400um左右。將制備好的雙相生物材料通過(guò)電鏡觀察并驗(yàn)證是否滿足參數(shù)設(shè)定的要求，包括孔徑及孔隙率，是否分布均勻，雙相復(fù)合材料結(jié)合處是否逐漸延伸，保證結(jié)合處為均一逐漸過(guò)渡的過(guò)渡層，及是否緊密結(jié)合，有無(wú)明顯界限。以滿足與正常組織中的關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的結(jié)構(gòu)層次相適應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)研究中雙相復(fù)合磁性納米支架材料通過(guò)低溫快速成型技術(shù)制備，此方法為3D制造，可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制成型材料的孔徑及孔隙率，力學(xué)測(cè)試表明制備的雙層復(fù)合材料的生物力學(xué)性能可滿足骨與軟骨組織工程支架材料的要求，且雙層復(fù)合支架材料的過(guò)渡延伸層面在電鏡下觀察到緊密結(jié)合，不易再次裂開。雙層復(fù)合支架材料與BMSCs共培養(yǎng)的生物相容性研究中，CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMSCs可大量增殖，長(zhǎng)勢(shì)良好，證實(shí)此種雙相的復(fù)合納米材料生物相容性良好，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，對(duì)BMSCs的增殖分化有一定的正性作用，光鏡和電鏡下均觀察到BMSCs粘附在雙層復(fù)合支架上，增殖分化良好，細(xì)胞/支架復(fù)合21天后通過(guò)Von Kossa染色和甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)BMSCs可以在雙層支架材料上向軟骨和成骨細(xì)胞雙向分化。本研究顯示雙層支架材料可滿足正常體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨組織的生理結(jié)構(gòu)的差異，后期將進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)影像學(xué)、病理學(xué)等方式來(lái)動(dòng)態(tài)分析其修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨損傷的能力，并對(duì)修復(fù)的標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)、降解性能等方面的檢測(cè)，探討其作為骨與軟骨組織工程修復(fù)骨和軟骨缺損支架材料的可能性。

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Determination of the three-dimensional magnetic properties of duplex printing nanocomposite scaffold

HuangJianghong 1,2,3,Wang Daping 1,2,3,XiongJianyi 1,2,3,et al.1 NationalKeyOrthopedicDepartment,Shenzhen SecondPeople'sHospital;2ShenzhenTissueEngineeringKey Laboratory;3 ShenzhenDigitalOrthopaedic Engineering Laboratory,Shenzhen GuangDong,518035;4 Department of Orthopedic,Huangshan People's Hospital,Huangshan AnHui,242700,China

Objective Study prepared a novel two-phase magnetic nanocomposite scaffolds(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/ Fe2O3),through various biological performancetesting,evaluationandtoexplorethefeasibility of bonetissue engineering scaffolds.Methods Preparation of two-phase magnetic nanocomposite scaffolds(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)by cryogenic rapidprototypingmethod,usingelectronic detectionmachinescaffoldflexural,compressive strength,elastic modulus to evaluate the mechanical properties by electron microscopy ultrastructure scaffold;in the medium（ethanol）immersion assay scaffold porosity between the scaffold and bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured detect its biocompatibility.Results Duplex magnetic nanocomposite scaffold mechanical test results show it has good mechanical properties,electron microscopy showed uniform pore size distribution of the upper and lower layers,the upper layer of cartilage with smaller pore size,good fusion between successive phase,pore size and porosity of the test results showed cartilage aperture layer scaffold to 189um,a porosity of 86.5%.Aperture bone scaffold layer is 364um,a porosity of 77.1%,in line with the double scaffold design requirements.Duplex between magnetic nano composite scaffold co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells,showed that bone marrow mesenchymal stem cell proliferation effect isverygood,betterable topromote the differentiationofcells for the purposedescribedbiphasic magneticnanocomposite scaffolds have good biocompatibility.Conclusion Duplex magnetic nanocomposite scaffolds（PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3）has good mechanical properties and biocompatibility,pore size and pore growth rate of cell adhesion requirements,and normal joint subchondral bone and cartilage physiological structure closer,is expected to be able to better repair osteoarthritis and other diseases caused by trauma or cartilage and subchondral bone damage under.

Lowtemperaturerapid prototyping;3D printing;Duplex magnetic nano

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.01.003

swgk2016-09-00220

黃江鴻（1982-）男，碩士，副主任技師。研究方向：骨科生物材料。

*[通訊作者]熊建義（1963-）男，碩士，主任醫(yī)師。研究方向：骨科。

深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目（編號(hào)：CXZZ20140813160132596）

1深圳市第二人民醫(yī)院國(guó)家重點(diǎn)骨科；2深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3深圳市數(shù)字骨科技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518035；4黃山市人民醫(yī)院骨科，安徽黃山242700