強新新，馬雯雯，王 平，王 曼，梅曉丹

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工業(yè)酶的發(fā)展現(xiàn)狀與展望

強新新，馬雯雯，王 平*，王 曼，梅曉丹

（大連百奧泰科技有限公司，遼寧 大連 116025）

工業(yè)酶是生物催化技術在的各個行業(yè)應用的關鍵，也是建立可持續(xù)發(fā)展社會，解決高消耗、高污染問題的工業(yè)基礎。本文介紹了近年來工業(yè)酶在各行業(yè)的應用情況，概述了工業(yè)酶發(fā)展存在的問題及對策，并對工業(yè)酶的市場發(fā)展前景進行了展望。

工業(yè)酶； 工業(yè)酶應用； 酶固定化； 酶分子修飾

生物催化技術是工業(yè)可持續(xù)發(fā)展最有希望的技術，而工業(yè)酶是生物催化在工業(yè)生產應用過程中解決高消耗和高污染等問題的關鍵?！吨袊圃?025》中曾明確指出，截至2020年，中國將建成千家綠色示范工廠和百家綠色示范園區(qū)，重點行業(yè)主要污染物排放強度下降20%。毫無疑問，工業(yè)酶將在這一場綠色發(fā)展的技術革命中擔當重要角色。

隨著新的生物技術如定向進化、基因工程的出現(xiàn)，利用生物技術對工業(yè)酶進行有目的的改造優(yōu)化將逐步實現(xiàn)。

1 簡介

工業(yè)領域生物催化與生物轉化的核心是生物催化劑——工業(yè)酶[1]。工業(yè)酶參與的酶催化工藝是發(fā)展第二代生物能源、開展生物修復、保障食品安全的關鍵技術[2]。

由于工業(yè)酶在生產過程中具有催化效率高、專一性強和污染少等特點，酶催化已經和化學工藝方法一樣，大量應用于紡織、造紙、石油、食品、飼料、洗滌等生產過程中。酶可以催化反應位點、化學結構和立體構型選擇性的反應，而這些對于傳統(tǒng)的化學反應，非常具有挑戰(zhàn)性。盡管不是每一個酶都能夠在溫和、使用相對無毒試劑的條件下進行，但這對工業(yè)生產來講是十分有用的。

生物酶的工業(yè)應用前景是非常有吸引力的，不僅因為他們在底物到產物的轉化過程是高效和高度選擇性的，還因為應用工業(yè)酶容易生產純度較高的產品，從而最大限度地減少廢物的產生。工業(yè)酶制劑的應用能大大降低了工業(yè)生產中的資源消耗和環(huán)境污染，是工業(yè)技術轉型升級的重要方向之一。

但到目前為止，已報道發(fā)現(xiàn)的酶有5 000多類，其中已實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產的只有約200多種[3]。工業(yè)酶還存在熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和有機溶劑耐受性等問題，這些都限制了在工業(yè)化生產中的大規(guī)模應用。一種酶能否應用于工業(yè)生產中，需要從三個方面考慮，概括為轉化效率，穩(wěn)定性和可用性。這些是酶應用于工業(yè)生產時必須要克服的障礙。工業(yè)酶還必須在在合理的成本下滿足工業(yè)生產的用量要求。

2 工業(yè)酶分類與選擇標準

國際生物化學與分子生物學聯(lián)合會（Interna- tional Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUBMB）根據(jù)酶所催化的反應類型，將酶分成六個大類，如表 1所示。

每個酶都有一個分類號，稱為“EC編號”，它由四個數(shù)字組成，這些數(shù)字代表逐步更細致地為酶進行分類，依次為大類、子類、作用的化學基團編碼、酶自身編碼。如EC編號：EC4.3.2.1，數(shù)字“4”表示酶的大類為裂解酶；編碼“4.3”表示酶為作用與Ｃ－Ｎ鍵的裂解酶；編碼“4.3.2”表示作用于酰胺類、脒類基團的裂解酶；編碼“4.3.2.1”代表精氨琥珀酸裂解酶。

圖1表示了更適合應用的生物酶的概念，在這里每個來自宏基因組的候選酶按照特定的標準從低（1分）到高（6分）排序，以產生一個多參數(shù)指紋圖譜[4]。

表1 酶的分類

圖1 用于酶篩選的表示酶性能指標的雷達圖

工業(yè)酶應用性能的評價指標包括酶活性，效率，特異性和穩(wěn)定性。這一決策矩陣顯示了每一個候選酶的優(yōu)勢和劣勢，因此，可以從不同的酶庫，通過重新篩選、蛋白質工程或定向進化的方法進一步開發(fā)更有應用前景的工業(yè)酶。

酶在功能和活性上是非常獨特的。當反應體系中不需要酶時，可以通過簡單的方法對酶去活化。這種不需要過多危險化學品或能源，并能進行復雜、特異化學反應的能力，使工業(yè)酶在工業(yè)領域的應用具有強大的吸引力和廣闊前景。

3 工業(yè)酶的生產和應用

3.1 工業(yè)酶的生產

酶可以從植物，動物和微生物中獲得。然而，在工業(yè)生產中，來自真菌和細菌的酶占主導地位，并且，絕大多數(shù)酶來自數(shù)量非常有限的微生物物種，其中以曲霉、木霉、芽孢桿菌和酵母菌為主。工業(yè)酶的主要品種是淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、連接酶、植酸酶、纖維素酶和木聚糖酶等[5]。

生產工業(yè)酶的專業(yè)性很強，對產品品質的要求也很高，因而需要菌種、生產技術等技術方面的長期積累和不斷優(yōu)化。進行工業(yè)酶的開發(fā)的專業(yè)研究機構或公司通常需要具有以下技能[6]：

（1）酶和生產菌株的選擇。

（2）利用基因工程技術構建高產菌株。

（3）培養(yǎng)基和生產條件的優(yōu)化。

（4）酶回收工藝的優(yōu)化。

（5）穩(wěn)定酶制劑的配方工藝。

工業(yè)酶的生產需要對相關的科學和技術問題有清晰的理解。這些問題包括酶的生物來源鑒定，酶過度表達的遺傳操作，細胞發(fā)酵培養(yǎng)及條件優(yōu)化，酶產物的分離、純化和酶制劑的穩(wěn)定策略等。

3.2 工業(yè)酶的應用

工業(yè)酶是現(xiàn)代工業(yè)生物技術中相對成型而又潛力巨大的核心產業(yè)，應用領域遍及化學品生產、醫(yī)藥、輕工、食品、能源及環(huán)境保護等[7]。

酶可以通過消除或部分替代在生產中的化學處理過程，提供更為安全的工作條件。因此，在淀粉、造紙和紡織品加工中，使用酶時，有害化學品的用量會大大減少[6]。例如，在紡織工業(yè)中，酶可以替代織物退漿過程中使用的堿或氧化劑，減少環(huán)境污染的同時，還可提高織物的感官和纖維斷裂強度[8]；在制革工業(yè)中，酶可以減少加脂劑、鞣劑、脫毛劑等助劑的使用，降低污染物的排放[9]；在飼料中添加酶制劑，讓動物更完全地消化吸收飼料中的營養(yǎng)成分，并減少糞便的產生[10]；在洗滌劑中加入酶制劑，可以代替漂白劑，去除衣物上的頑固污漬；并在較低的溫度下實現(xiàn)衣物的洗滌，從而節(jié)省能源[11]。

在食品生產領域[12]，如果汁類產品的生產中，是無法離開酶的作用的。果汁的混濁主要是由果膠和淀粉等多糖引起的。酶處理是降低果汁的混濁的有效途徑，還可以降解植物細胞壁使植物細胞中營養(yǎng)成分釋放出來。果汁處理工藝中主要使用果膠酶和其它酶如淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖氧化酶等。

在其它領域工業(yè)酶也有廣泛及重要的應用。一些具有的立體選擇性、區(qū)域選擇性等特點的工業(yè)酶在有機合成工業(yè)中得到了越來越多的應用。如酶催化的Aldol縮合反應、Mannich反應、Michael加成反應等高級反應已經能夠應用于有機合成工業(yè)[3]。在能源領域，也有關于酶的深入研究和應用。除了在木質纖維素降解制燃料乙醇的生產中應用外[13]，在石油生產中的應用如生物酶在油井、氣井壓裂施工中作為破膠劑，相比傳統(tǒng)氧化破膠劑，具有溫度范圍可調（20~150 ℃），返排率高，地層傷害小等優(yōu)點[14-16]。

酶在各行業(yè)中的應用舉例如表2。應用與各個行業(yè)中的工業(yè)酶品種主要是淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶等主要品種。

表2 各行業(yè)中工業(yè)酶的使用情況

通過以酶為催化劑的生物催化工藝來改造傳統(tǒng)工業(yè)，發(fā)展和完善基于工業(yè)酶的綠色生物工藝產業(yè)鏈，特別是紡織、造紙、皮革等高污染、高能耗行業(yè)，是工業(yè)酶行業(yè)最有價值的發(fā)展方向之一。

工業(yè)酶應用于工業(yè)生產中，需要滿足工藝條件的要求。舉例來說，根據(jù)工藝條件的不同，不同行業(yè)對酶的作用溫度有不同的要求，如表3所示。

工業(yè)酶在生物催化工藝中的應用是需要滿足一定條件的。上表中的例子是一些工藝條件對工業(yè)酶耐受溫度性能的要求。工業(yè)酶是一類以蛋白質為主體的催化劑，其催化活性易受溫度及pH的影響。隨著溫度的上升，反應速度加快，但達到某一溫度以上（一般45～50 ℃），蛋白質就會變性失活，其催化活性就會急速降低；同樣生物酶也只在有限的pH值范圍內起反應，故每種酶都有其最佳溫度和pH值。而有些工業(yè)生產過程需在一定的溫度、壓力、pH值或有機溶劑條件下進行，因此要求所用生物催化劑具有較高的耐受力，以適應工業(yè)化生產需要。目前生物催化技術的應用主要局限于無合適的生物酶催化劑。

表3 不同行業(yè)對酶溫度范圍的要求

4 工業(yè)酶的技術改進

當前工業(yè)生物催化發(fā)展的制約因素之一就是商品化的工業(yè)酶種類不夠多、適用的反應類型有限、底物耐受濃度、反應速度、轉化率、對有機溶劑耐受性等性質難以十全十美。

自然環(huán)境中產生的酶在性能上往往不能滿足工業(yè)的需要，所以酶的性能需要靠生物技術加以改進。應用現(xiàn)代篩選技術可獲得理想的生物催化劑。傳統(tǒng)的方法包括常規(guī)的物化誘變技術、原生質體融合技術等。隨著現(xiàn)代生物技術的不斷發(fā)展，又出現(xiàn)了基因工程技術、基因組改組技術及最近發(fā)展起來的分子標簽插入突變技術等，已成功用于工業(yè)酶的性能改良。

通過對天然酶進行分子改造，能夠為工業(yè)生產提供具有穩(wěn)定性更高、活性更高、選擇性更高、極端環(huán)境耐受性更高的新酶。酶的改造可以通過固定化、理性設計或者定向進化技術來實現(xiàn)。

4.1 酶的分子改造

除了從自然選擇外，隨著分子生物學、蛋白質工程、基因工程和計算技術等相關學科的迅速發(fā)展，高通量篩選技術和裝置的發(fā)展與成熟，定向進化與理性設計相結合的半理性分子設計方法陸續(xù)出現(xiàn)。大量計算方法如Pro SAR、SCHEMA、Rosseta等的應用，大大提高了突變體設計分析的效率和準確性。同時，在突變體文庫的構建方面也出現(xiàn)了迭代飽和突變、簡化密碼子表、基于簡并密碼子的限制性文庫方法等。這些技術使得直接進化和合理設計生物酶催化劑的效率大大提高，可能在更短的時間內創(chuàng)造出越來越多新的高效而經濟的工業(yè)酶制劑。

目前酶改造和設計大多通過定點突變、片段優(yōu)化替換等各種傳統(tǒng)蛋白質工程手段，或者涉及常規(guī)生物信息學的分子改造等而獲得新型酶。但有些酶由于蛋白質骨架性質不夠好，很難通過這些小修小補的手段，獲得性能的巨大提升。近年來，酶學理論得到了迅速的發(fā)展，在改造和設計新型酶，特別是自然界不存在的全新酶的過程中，出現(xiàn)了把酶的折疊模式與酶活中心分別加以研究的設計思路。將某種酶功能關鍵結構安裝在性能達到工業(yè)生產要求的蛋白質骨架上，實現(xiàn)可工業(yè)應用的新型酶的改造和設計[31]。

在酶的分子改造中最具代表性的案例之一，是糖尿病藥物西他列?。⊿tagliptin）合成用酶的分子改造[32,33]。基于蛋白質結構，通過分子模擬和點飽和突變對節(jié)桿菌轉氨酶進行重新設計，最終通過多輪特定環(huán)境下的定向進化所獲得的突變酶有27個突變位點，具有較廣的底物適應范圍、較高的活性和很強的環(huán)境耐受能力（反應溫度45～50℃、50% DMSO、底物濃度200 g/L），而傳統(tǒng)的定向進化方法幾乎不可能得到具備如此多性能優(yōu)勢的酶。該酶的生物催化活性提高了2 500倍，替代了原有工藝中昂貴的金屬釕催化劑，并且沒有副產物左旋對映體的生成。酶法工藝解決了高壓生產過程的危險性和高成本等問題，反應產率提高10%～13%，廢物的產生量降低了19%，還增產56%。Merck和Codexis公司也因此獲得了2010年美國總統(tǒng)綠色化學挑戰(zhàn)獎。

4.2 酶的固定化

酶在工業(yè)過程中的應用被以下幾個因素限制，主要包括酶的成本高，酶的不穩(wěn)定性，以及酶規(guī)?；目捎眯浴Ａ硗猓捎诿溉苡谒橘|中，催化過程結束后從反應液中回收酶，再次利用的成本很高，并且這在技術上是非常困難的，這造成了酶的使用成本居高不下。并且，使用可溶性酶的生產過程，由于需要進行含酶溶液處理，使生產過程被限制為間歇式的生產方式，這也限制了酶法工藝的生產效率的提高。此外，酶在外界條件的影響下，活性很容易受到影響，且不穩(wěn)定。

為解決上述問題，固定化酶技術被提了出來[34]。酶的固定化是指采用有機或無機材料作為載體，將酶包埋起來或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收重復使用的方法與技術。酶的固定化技術將酶與不溶性基質保留在反應器中，便于酶的再利用以降低成本。酶的固定化有助于連續(xù)生產工藝過程的發(fā)展，使生產以更少的成本、更高的產量、自動化地進行生產運作。固定化酶還可使產品具有更高的純度，以滿足醫(yī)藥、食品等行業(yè)對產品純度更苛刻的要求。

現(xiàn)有的固定化方法包括包埋法、吸附法、共價法等[35,36]。包埋酶可以制備成珠狀、纖維狀、薄膜狀等。由于包埋為物理過程，不涉及酶的修飾，不需要氨基酸殘基參與反應，因而基本不改變酶的活性中心及高級結構，酶活損失較少。但缺點在于：酶包埋在載體中，由于擴散限制影響酶的催化效率。此方法較適用于以小分子物質作為底物的酶，底物容易擴散進入固定化酶的活性部位。包埋法常用的包埋材料有多糖、膠束、脂質體等。

共價法是指酶分子和載體之間以共價鍵相互連接。共價法的優(yōu)點在于酶與載體間連接牢固，酶與載體很難分離，因此具有良好的穩(wěn)定性及重復使用性。但由于共價法需要酶分子與載體的共價結合，反應通常是復雜、劇烈、非特異性的，使酶活中心受到一定程度的破壞，因而會影響酶的活性。

吸附法[37]是通過氫鍵、疏水鍵、靜電作用等分子作用力完成酶的固定。如以硅膠吸附固定脂肪酶，提高脂肪酶的催化活性；或以氧化鋁為載體吸附淀粉酶，使淀粉酶具有更高的pH穩(wěn)定性等。吸附法具有工藝簡單、酶殘余活力高、載體材料多樣的特點。其缺點在于酶與載體的結合力小，外界因素的改變容易導致酶與載體分離，導致酶的損失。

近年來，酶的固定化方法及應用研究得到了長足進展，開發(fā)新型固定化技術、研究其在工業(yè)生產中的應用是酶固定化研究的主要趨勢。

5 工業(yè)酶的市場前景展望

中國酶制劑產業(yè)經過50多年的長足發(fā)展，已進入世界酶制劑生產的大國行列。在引進國外先進設備、優(yōu)良菌種、新型酶制劑的基礎上，中國酶制劑工業(yè)得到迅猛發(fā)展，中國本土酶制劑企業(yè)也得到較快發(fā)展。目前，中國本土競爭實力相對較強的酶制劑生產企業(yè)不斷涌現(xiàn)。

2015年7月，美通社在線發(fā)布《2014年全球工業(yè)酶行業(yè)研究報告及未來三年預測》。近年來，全球工業(yè)酶制劑市場規(guī)模逐年增加，年產值增長率為5%，2014年已達42.2億美元的規(guī)模。目前，全球工業(yè)酶市場基本上是寡頭壟斷。在2014年，諾維信作為工業(yè)用酶巨頭，占據(jù)了44%的市場份額，是全球工業(yè)酶制劑和微生物制劑市場的絕對領導者；而杜邦公司和DSM分別占有為20%和6%的市場份額。全球各地區(qū)需求呈現(xiàn)較大差異，歐洲和北美地區(qū)對工業(yè)酶的需求量最大，占據(jù)80%；而中國僅占9.4%。

在市場需求擴大和國家相關政策的雙重刺激下，2014年中國的工業(yè)酶制劑產量已達116.57萬噸并保持10%年產量增長趨勢，預計2017年產量將達到150噸。通過引進國外先進的設備、優(yōu)良的菌株以及新型酶制劑的開發(fā)，中國已開始進入酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展期。但在酶制劑研發(fā)的原始創(chuàng)新方面尚有一定差距，多數(shù)企業(yè)的自主開發(fā)能力還十分有限。

6 結 語

酶催化過程比傳統(tǒng)化學過程更清潔、環(huán)保，酶技術在工業(yè)生產過程中的廣泛應用，是建設可持續(xù)發(fā)展社會的必要條件。盡管一些酶的性能還不能完全滿足需求，但隨著生物技術的發(fā)展，工業(yè)酶必將在工業(yè)生產中發(fā)揮更加強大的作用。

正如20世紀中期石油化工的飛速發(fā)展改變了人們的生產、生活方式一樣，生物催化的廣泛應用，將會給人們提供性能更佳的材料和能源以可再生的生物原料為基礎的生物生產過程，將逐步取代化石原料生產過程，成為21世紀化工生產的主體，從而實現(xiàn)綠色化工、綠色生產的目標。

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Development Status and Prospect of Industrial Enzymes

（Dalian BITeomics,Inc, Liaoning Dalian 116025, China）

Enzyme is the key to application of bio-catalysis technology in different industries, and it is also industrial base to establish a sustainable society and to solve the problem of high energy consumption and heavy pollution. In this paper, application of industrial enzymes in various industries in recent years was introduced, and the problems during development of industrial enzymes were summarized as well as the countermeasures.At last， themarket of industrial enzymes was prospected.

Industrial enzyme；application of industrial enzyme；immobilized enzyme；modification of enzyme molecular

TQ 814.9

A

1004-0935（2017）03-0243-06

2016-12-22

強新新（1983-），男，博士，2012年畢業(yè)于大連理工大學應用化學專業(yè)，研究方向：油田用劑研究開發(fā)。

王平（1978-），女，中級，博士，研究方向：主要從事油氣田開發(fā)及提高采收率方法研究。郵箱：wangping@biteomics.com。