鄂 文，夏德安

（東北林業(yè)大學(xué)，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

毛果楊富含谷氨酸蛋白PtrGARP1基因啟動(dòng)子特性

鄂 文，夏德安

（東北林業(yè)大學(xué)，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

為了研究PtrGARP1與楊樹(shù)木質(zhì)化生長(zhǎng)的相關(guān)性，明確木材發(fā)育及形成的分子機(jī)制，以毛果楊幼樹(shù)為材料，提取各組織的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建植物表達(dá)載體在模式植物擬南芥中進(jìn)行PtrGARP1組織表達(dá)分析。結(jié)果顯示，PtrGARP1基因在毛果楊木質(zhì)化組織內(nèi)高豐度表達(dá)，且表達(dá)水平與幼莖木質(zhì)化程度同步增加；用Gateway技術(shù)構(gòu)建該基因啟動(dòng)子融合報(bào)告基因GUS的ProPtrGARP1::GUS植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥獲得5個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系；GUS活性染色分析顯示，PtrGARP1基因啟動(dòng)子活性集中在轉(zhuǎn)基因植株發(fā)達(dá)的維管組織內(nèi)。這個(gè)結(jié)果暗示著PtrGARP1與楊樹(shù)木質(zhì)化生長(zhǎng)相關(guān)，可能參與木材發(fā)育及形成。

楊樹(shù)；富含谷氨酸蛋白；PtrGARP1；啟動(dòng)子

木材源自于樹(shù)木次生生長(zhǎng)，由形成層活動(dòng)產(chǎn)生次生維管組織（vascular system）而形成，這一過(guò)程包括形成層細(xì)胞增殖、伸長(zhǎng)、分化，次生壁加厚以及細(xì)胞程序性死亡（Programmed cell death, PCD）等生理反應(yīng)[1-5]。近年來(lái)，這方面的研究報(bào)道主要集中在模式植物擬南芥中[6-8]。研究表明，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素等控制形成層活動(dòng)[9-11]，而MYB、NAC、HD-ZIPⅢ和KNOX等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控木質(zhì)部次生壁形成[12-14]。此外，木質(zhì)組織內(nèi)進(jìn)化出高豐度、特異表達(dá)的Tubulin微管蛋白家族成員與次生壁微纖絲沉積（microfibril deposition）有關(guān)，不少微管相關(guān)蛋白（microtubule associated proteins, MAPs）也被報(bào)道參與了次生壁的形成[15-18]。

最近，通過(guò)蛋白組學(xué)策略篩選鑒定出多個(gè)參與楊樹(shù)幼莖木質(zhì)化生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)[19]。其中，一個(gè)富含谷氨酸的蛋白（Glutamic Acid Rich Protein）簡(jiǎn)稱GARP，雖然功能未知，但其豐度隨幼莖木質(zhì)化生長(zhǎng)而劇烈增加，其基因（Potri.014G162800, 被命名為PtrGARP1）轉(zhuǎn)錄水平也與幼莖木質(zhì)化程度同步增加。研究還表明，該基因的表達(dá)模式為PtrGARP1基因啟動(dòng)子表達(dá)模式，且驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的活性主要集中在轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)達(dá)的維管組織區(qū)域。研究以毛果楊幼樹(shù)為材料，提取各組織的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建植物表達(dá)載體在模式植物擬南芥中進(jìn)行PtrGARP1組織表達(dá)分析，以期進(jìn)一步證實(shí)PtrGARP1與楊樹(shù)木質(zhì)化生長(zhǎng)的相關(guān)性，明確木材發(fā)育及形成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為溫室栽培4個(gè)月、株高約1.5 m的毛果楊幼樹(shù)，取其頂端到基部第1、2、3、4、5和6莖節(jié)以及木質(zhì)部、形成層和韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽、根的組織，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。以Columbia野生型擬南芥為植物表達(dá)載體進(jìn)行PtrGARP1基因啟動(dòng)子的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

植物總RNA采用pBIOZOL Reagent（Bioflux公司）提取。cDNA第一鏈采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNAeraser（Takara公司）合成。高保真DNA聚合酶為KOD-Plus（Toyobo公司）。膠內(nèi)DNA采用Silica Bead DNA Gel Extrction Kit （Thermo Scientific公司）回收。質(zhì)粒采用E.A.N.A Plasmid Mini Kit I（Omega公司）提取。GUS染液：0.1 mol/L Na3PO4（pH值為7.0），10 mmol/L EDTA，2 mmol/L K3[Fe（CN）6], 2 mmol/L K4[Fe（CN）6]，1 mmol/L X-Gluc, 0.1% （v/v） Triton X-100?；蛞锖铣梢约癉NA測(cè)序工作由Invitrogen公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PtrGARP1氨基酸序列分析 毛果楊PtrGARP1基因信息在植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并獲取，其他物種的氨基酸序列在NCBI中查找獲取，然后運(yùn)用BioEdit生物學(xué)軟件對(duì)這些同源基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2 植物總RNA、基因組DNA提取和cDNA第一鏈合成 擬南芥總RNA的提取與cDNA第一鏈合成參照各試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。擬南芥基因組DNA提取采用CTAB法[20]。

1.2.3 RT-PCR和啟動(dòng)子DNA片段擴(kuò)增 以毛果楊各組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ACT2為內(nèi)參基因，基因引物如下：ACT2，5′-CCCAGTGTTGTTGGTAGG CCAAGAC-3′和5′-CATAGCGGGAGAGTTAAAGG TCTC-3′；PtrGARP1，5′-TCTCCAGAGGAAGTAC CTGC-3′和5′-GAACTCAGCGTACGTACTCG-3′；啟動(dòng)子引物：5′-CACCCTTCAACTCCCACAAGACA-3′和5′-TGGAACTGAAAGGAAAATAAAGCAA-3′。擴(kuò)增體系（20 μL）：13.5 μL ddH2O，2 μL dNTPs （2 mmol/L），2 μL 10×Taq Buffer，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板或基因組DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性，94℃ 3 min；循環(huán)擴(kuò)增，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s或2 min；后延伸，72℃ 7 min。ACT2基因擴(kuò)增24個(gè)循環(huán)，PtrGARP1基因擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，PtrGARP1啟動(dòng)子片段擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)。

1.2.4 植物表達(dá)載體構(gòu)建 植物表達(dá)載體構(gòu)建采用Gateway系統(tǒng)。擴(kuò)增的PtrGARP1啟動(dòng)子片段從膠內(nèi)回收后，連接插入Gateway入門載體pENTR/SD/ D-TOPO vector。連接體系（2.5 μL）：0.5 μL TOPO Vector，0.5 μL Salt Solution，1 μL DNA片段（40 ng），0.5 μL ddH2O。將經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)含目的片段的入門載體與pGWB3植物表達(dá)載體進(jìn)行LR交換反應(yīng)。LR反應(yīng)體系（3 μL）：1 μL含基因片段的TOPO質(zhì)粒（40 ng），0.5 μL pGWB載體（120 ng）, 0.5 μL LR Enzyme Mix II，1 μL ddH2O。LR反應(yīng)條件為22℃、2 h。將交換連接含目的片段的pGWB3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 擬南芥栽培與遺傳轉(zhuǎn)化 消毒后的擬南芥種子于4℃春化2 d，播種在含1%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)、生長(zhǎng)7 d后，幼苗移栽到土中，置于長(zhǎng)日照環(huán)境（16 h光照/8 h黑暗）培養(yǎng)，環(huán)境溫度20～23℃，光強(qiáng)80～100 μmol/(m2·s)。栽培約8周，采用浸花法[21]進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.6 GUS組織化學(xué)染色 將植物組織浸沒(méi)在GUS染液中抽真空，負(fù)壓脫氣5 min再回復(fù)正常氣壓，這一操作重復(fù)3～5次，然后置于37℃水浴8～10 h。染色結(jié)束后加入70%乙醇于37℃下脫色12～16 h，觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrGARP1氨基酸序列分析

據(jù)推測(cè)，PtrGARP1蛋白有172個(gè)氨基酸，其中谷氨酸有57個(gè)，約占氨基酸總數(shù)的1/3。用該序列同源性檢索顯示，毛果楊基因組存在1個(gè)高度同源的編碼基因（Potri.002G223100）。此外，在NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast同源性檢索顯示，胡楊、可可、葡萄、赤楊、雷蒙德氏棉、陸地棉、荷花及甜橙物種均存在PtrGARP1同源蛋白質(zhì)。對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行一致性比對(duì)（圖1）顯示，這類蛋白質(zhì)保守氨基酸位點(diǎn)幾乎均為谷氨酸，暗示谷氨酸殘基是這類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能行使的關(guān)鍵。

2.2 PtrGARP1組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：PtrGARP1在毛果楊的木質(zhì)部、形成層和葉柄組織內(nèi)高豐度轉(zhuǎn)錄，其次是老葉和韌皮部，而在幼葉、葉柄、頂芽和根中幾乎檢測(cè)不到（圖2b）；在第1至6逐漸木質(zhì)化生長(zhǎng)的莖節(jié)中，PtrGARP1轉(zhuǎn)錄水平逐步升高，且在已木質(zhì)化的第5和6莖節(jié)內(nèi)高豐度轉(zhuǎn)錄（圖2a）。這表明，PtrGARP1僅在木質(zhì)化的組織內(nèi)高豐度表達(dá)，暗示著該基因很有可能與次生細(xì)胞壁形成相關(guān)，參與了楊樹(shù)木材發(fā)育及形成過(guò)程。

2.3 ProPtrGARP1::GUS植物表達(dá)載體構(gòu)建

用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/） 分析PtrGARP1基因啟動(dòng)子區(qū)域，長(zhǎng)度為3 182 bp。以毛果楊基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)片段，插入到pENTR/SD/D-TOPO載體中。由圖3b可知，PtrGARP1啟動(dòng)子DNA片段成功連接到pENTR/SD/D-TOPO載體。通過(guò)LR重組反應(yīng)將pENTR/SD/D-TOPO載體上ProPtrGARP1片段重組到植物表達(dá)載體pGWB3上，以重組質(zhì)粒為模板使用ProPtrGARP1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，得到的特異DNA片段長(zhǎng)度與目標(biāo)DNA片段大小相符（圖3 d）。這一結(jié)果顯示ProPtrGARP1::GUS植物表達(dá)載體已構(gòu)建成功，將其轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中用于轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定

圖1 PtrGARP1及其同源蛋白推測(cè)氨基酸序列比對(duì)

圖2 PtrGARP1在不同組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

圖3 PtrGARP1基因啟動(dòng)子的pGWB3植物表達(dá)載體構(gòu)建

采用浸花法對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)卡那霉素抗性篩選獲得ProPtrGARP1::GUS抗性植株5棵，分別提取各轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，用上游引物和GUS基因下游引物對(duì)基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從圖4中可以看出，野生型擬南芥無(wú)擴(kuò)增帶而ProPtrGARP1::GUS轉(zhuǎn)基因各株系中均可見(jiàn)特異帶，表明ProPtrGARP1::GUS融合基因已成功轉(zhuǎn)入野生型擬南芥基因組中。

圖4 ProPtrGARP1::GUS轉(zhuǎn)基因植株鑒定

2.5 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色

對(duì)ProPtrGARP1::GUS轉(zhuǎn)基因材料的幼苗以及生長(zhǎng)至開(kāi)花期的成熟植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。由圖5可知，藍(lán)色信號(hào)主要出現(xiàn)于幼苗葉脈、葉柄、上胚軸和根中柱區(qū)域；在成熟植株的莖和花器官中均被觀察到強(qiáng)烈的GUS活性；進(jìn)一步分析顯示，在莖組織的維管發(fā)達(dá)區(qū)域的維管束、木質(zhì)部和束纖維內(nèi)GUS活性較高。這些數(shù)據(jù)表明PtrGARP1基因的啟動(dòng)子活性主要存在于維管系統(tǒng)發(fā)達(dá)的組織內(nèi)，這暗示PtrGARP1與楊樹(shù)木質(zhì)化生長(zhǎng)相關(guān)，可能參與木材形成。

圖5 ProPtrGARP1::GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色

3 討 論

富含谷氨酸蛋白（GARPs）是一類新奇的蛋白質(zhì)，由于按富含Glu歸類則不同源的GARPs功能是不同的。一些非植物GARPs功能被報(bào)道，如柱狀感光蛋白、人屬纖維蛋白原類似蛋白等[22-23]。然而，植物GARPs的文獻(xiàn)較少，僅有的幾篇文獻(xiàn)描述幾個(gè)不同源GARPs基因克隆、表達(dá)或推測(cè)性功能[24-26]。目前，還沒(méi)有植物GARP功能被證實(shí)。PtrGARP1同源性檢索顯示（圖1），擬南芥和玉米中不存在GARP1同源基因，而赤楊（A. glutinosa）、木薯（M. esculenta）和葡萄（V. vinifera）等植株中存在GARP1同源基因。

木薯中PtrGARP1同源基因被命名Pt2L4，主要表達(dá)在次生維管組織區(qū)域[27-28]。前期研究表明，PtrGAPR1蛋白豐度隨幼莖木質(zhì)化生長(zhǎng)而劇烈增加[19]。而從RT-PCR分析可知，PtrGAPR1轉(zhuǎn)錄水平也隨幼莖木質(zhì)化生長(zhǎng)而同步增加（圖2），進(jìn)一步研究表明（圖5），PtrGARP1基因啟動(dòng)子活性主要集中在轉(zhuǎn)基因植株的維管組織區(qū)域。這些結(jié)果均暗示著PtrGARP1與楊樹(shù)木質(zhì)化生長(zhǎng)相關(guān)，可能參與了木材形成過(guò)程。植物Tubulin微管蛋白的氨基酸序列中含有多個(gè)谷氨酸[17]，且可通過(guò)微管組織參與細(xì)胞壁纖維素微纖絲沉積、介入細(xì)胞壁增厚等生理過(guò)程[15-16]。由此推測(cè)，PtrGARP1很可能與楊樹(shù)微管組織相關(guān)，進(jìn)而參與次生壁合成（木質(zhì)化）過(guò)程。然而，PtrGARP1的準(zhǔn)確功能有待通過(guò)其突變體材料鑒定。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Characterization of the PtrGARP1 Promoter from Populus trichocarpa

E Wen，XIA De-an
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, PRC）

Reverse transcriptional (RT)-PCR analysis showed that the PtrGARP1 gene was highly expressed in the lignified tissues of Populus trichocarpa and the transcriptional expression levels were significantly increased with the lignification of young stems. DNA fragment of PtrGARP1 promoter was constructed into plant expression vector (ProPtrGARP1::GUS) by fusing GUS reporter gene using Gateway technology. Five transgenic lines were obtained after the transformation of Arabidopsis. Analysis of GUS activity staining showed that the activity existed in the developing vascular tissues of transgenic plants. The result suggests that PtrGARP1 gene function is associated with the lignification of Populus trichocarpa and may be involved in wood development and formation.

Populus trichocarpa; glutamic acid rich protein; PtrGARP1; promoter

Q789

：A

：1006-060X（2017）02-0001-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.002.001

2016-12-14

國(guó)家863計(jì)劃課題（2013AA102702）

鄂 文（1991-），女，黑龍江雞西市人，碩士研究生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。

夏德安