陳宜均+榮齊仙+姜丹+申業(yè)+黃璐琦

[摘要]牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS）是二萜類物質(zhì)合成途徑中的一個關(guān)鍵酶。該文采用生物信息學方法對9種唇形科植物的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶的核苷酸及其編碼的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、信號肽、導肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、疏水性/親水性和亞細胞定位特征、二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)功能域、三級結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系進行了初步預測和分析，并構(gòu)建了牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶蛋白家族的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，9種唇形科植物的GGPS氨基酸序列理化性質(zhì)基本一致，主要表現(xiàn)為親水性蛋白，有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，不存在信號肽，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域；大多數(shù)定位于葉綠體，少數(shù)定位于線粒體。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中最主要的結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，含有多聚異戊二烯基合成酶的活性結(jié)構(gòu)域、2個天冬氨酸富集區(qū)結(jié)構(gòu)域、活性位點殘基蓋結(jié)構(gòu)域和鎂離子結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域。研究結(jié)果將為GGPS的酶學特性及二萜類生物合成的分子機制研究提供理論參考。

[關(guān)鍵詞]唇形科； GGPS合酶； 二萜生物合成； 生物信息學

[Abstract]Geranylgeranyl pyrophosphate synthase enzyme is one of the key enzymes in the synthesis pathway of diterpenoid. Nine Lamiaceae genus GGPS synthase in Genebank was analyzed in this article. GGPS synthase the nucleic acid sequences and amino acid sequences， physicochemical properties， the signal peptide， leader peptides， transmembrane topological structure， hydrophobic， hydrophilic， subcellular localization， secondary structure， function domain， tertiary structure and evolutional relationship were predicted by using bioinformatics methods.Phylogenetic tree was constructed for the geranylgeranyl pyrophosphate synthase enzyme protein family. The results showed that GGPS amino acid sequence of the physical and chemical properties were basically identical， mainly hydrophilic protein， there existed chloroplast transit peptide， and no signal peptide and membrane structure domain， which mainly located in the chloroplast， the minor part located in mitochondria. The main secondary structures of the proteins are alpha helix and random coil. All these proteins have catalytic residues， aspartate-rich region， active site lid residues， substrate-Mg2+ binding site. The results provide theoretical reference for study on both the enzymatic characteristics of GGPS and the biosynthesis pathway of diterpenoid.

[Key words]Lamiaceae； geranylgeranyl pyrophosphate synthase （GGPS）； diterpene biosynthesis； bioinformatics

二萜類化合物是由4個異戊二烯結(jié)構(gòu)單元組成的C20類萜類化合物，是以二萜類化合物的共同前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸 （geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP）為底物，在不同的二萜合酶的催化下形成的，廣泛地分布于自然界，在植物、動物和海洋生物中均有二萜類化合物的存在。目前研究發(fā)現(xiàn)，二萜類化合物共有119種骨架，1萬多種化合物。主要的骨架類有克羅烷（cleordane）型、貝殼杉烷（kaurane）型、半日花烷（labdane）型和松香烷（abietane）型等。二萜類化合物廣泛存在于植物中，包括唇形科鼠尾草屬植物、巴豆屬植物、香茶菜屬植物、黃芩屬植物、番茄枝屬植物、Eurycoma 屬植物等，而且二萜類化合物具有重要的生理活性，如治療腫瘤的的紫杉醇^[1]；治療心血管系統(tǒng)疾病、抗菌消炎的丹參酮^[2]以及在農(nóng)業(yè)上用于高效調(diào)控植物生長發(fā)育的赤霉素^[3]等。途徑（pyruvate/ glyceradehyde-3-P pathway），此途徑最初的前提物質(zhì)是丙酮酸和3-磷酸甘油醛（G3P），二者在1-脫氧-D木酮糖-5-磷酸合成酶（DXPS）的催化作用下聚合成1-脫氧-D-木酮糖-5-5磷酸（DXP），DXP經(jīng)異構(gòu)中間體、磷酸化、環(huán)化等步驟逐漸形成2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）中間體，再經(jīng)過磷酸化、環(huán)化生成異戊烯基二磷酸（IPP）。IPP在異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）的作用下部分轉(zhuǎn)化為雙鍵異構(gòu)體DMAPP。高等植物體內(nèi)，IPP與DMAPP經(jīng)頭尾縮合形成具有C₁₀骨架的牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP），GPP加上第2個IPP單元形成具有C₁₅骨架的法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP），F(xiàn)PP由GGPP合成酶催化再加上第3個IPP單元縮合反應產(chǎn)生具C₂₀骨架的GGPP。由于GGPP是多種初生和次生代謝物等共同前體，因此，GGPS能夠起到調(diào)節(jié)碳流的作用^[4]，從而成為初生和次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。

目前，有多種植物的GGPS已經(jīng)或正在被深入研究，包括冷杉Abies grandis、銀杏Ginkgo biloba和紅豆杉Taxus canadensis，T. wallichiana，T. wallichiana var. chinensis，T. x media）等裸子植物，以及以擬南芥Arabidopsis thaliana為代表的多種被子植物。已知以GGPP為前體的具有藥用價值的化合物有紫杉醇^[5]、銀杏酚和丹參酮等，且已證明GGPP是決定紅豆杉植物合成紫杉醇類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一。對模式植物擬南芥GGPS的研究表明^[6]，GGPS還參與植物的發(fā)育過程，并具有時空特異性。該基因在花期表達，而且其活性只有在花瓣和葉片中檢出，隨著花瓣的發(fā)育，酶活性逐漸降低。另外，在丹參過表達GGPS株系中隱丹參酮含量的顯著降低，RNAi株系中肉眼可見的顯著表型為根縮短、葉發(fā)黃，這提示赤霉素含量的升高及葉綠素和/或類胡蘿卜素含量的降低^[7]。

唇形科Lamiaceae植物通常含有豐富萜類化合物，廣泛應用于醫(yī)藥和食品行業(yè)，如具有利濕、消腫止痛等功效的黃芩^[8-9]，具有強心、抗壓、平喘、抗血栓及降低眼內(nèi)壓等藥理作用的鞘蕊蘇^[10]和用于治療婦科、心血管及腎臟疾病的益母草屬，都具有很高的經(jīng)濟價值及實用價值。目前唇形科中已從丹參^[11]，毛喉鞘蕊花^[12]和米團花^[13]中克隆了GGPS基因。其作為植物二萜類化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶之一，正在受到越來越多的關(guān)注，本文利用生物信息學方法，對唇形科植物中已克隆的9個GGPS合酶的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、信號肽、導肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、疏水性/親水性、亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系進行預測和分析，以期為今后深入研究更多植物GGPP合酶的功能和結(jié)構(gòu)特征以及其生理功能提供一些理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)下載

以“Lamiaceae”和“geranylgeranyl diphosphate synthase”為搜索關(guān)鍵詞，從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）下載來自丹參（Salvia miltiorrhiza，Sm）、毛喉鞘蕊花（Plectranthus barbatus，Pb）、米團花（Leucosceptrum canum，Lc）的9種完整的唇形科GGPS核苷酸序列和氨基酸序列（表1）。

2 方法

利用美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 對唇形科植物GGPS 核苷酸和氨基酸序列進行在線分析^[14-15]。核苷酸及其編碼氨基酸序列的組成成分、相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)利用ProtParam 在線進行分析，開放閱讀框的查找利用ORF Finder在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）。信號肽（signal peptide）預測利用SignalP 軟件3.0 版^[16]。轉(zhuǎn)運肽的預測利用Target P1.1Server^[17]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）；跨膜結(jié)構(gòu)域用TMHMMServer v. 2.0^[18]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）進行預測；用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）對疏水/親水性進行預測；PSORT Prediction^[19] （http：//psort.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位分析。用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）觀測其二級結(jié)構(gòu)，功能域的預測用Pfam 27.0（http：//pfam.janelia.org/）和SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de/）^[20]進行；用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）完成GGPS 蛋白高級結(jié)構(gòu)同源建模；MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 唇形科植物牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶核苷酸序列的結(jié)構(gòu)及其氨基酸序列的理化性質(zhì)

利用ORF Finder和ProtParam在線工具對唇形科9種植物GGPS氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析（表2）。可知其核苷酸序列的起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TGA。氨基酸殘基（amino acids，aa）數(shù)在346～379 aa；各蛋白序列的相對分子質(zhì)量為37 424.3～41 299.7 kDa，中位值為39 408.66 kDa；理論等電點均在6 PI左右，平均6.33 PI，提示GGPS蛋白為酸性蛋白。從GGPS氨基酸組成中可以看到，9種植物的GGPS蛋白除SmGGPS3外，所含酸性氨基酸殘基比例均高于所含堿性氨基酸殘基比例，進一步提示GGPS蛋白為酸性蛋白。各種植物GGPS蛋白中，含量最豐富的氨基酸殘基主要集中在亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val），均不含硒半胱氨酸（Sec）、吡咯賴氨酸（Pyl）。總原子數(shù)，消光系數(shù)，基本一致。除SmGGPS1，PbGGPS，LcGGPS1的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其他均為不穩(wěn)定蛋白。

3.2 牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶的信號肽、導肽，跨膜結(jié)構(gòu)域，疏水性/親水性和亞細胞定位特征

3.2.1 信號肽、導肽的預測和分析 信號肽（signal peptide）是分泌蛋白和膜蛋白以前體形式合成時在N端的15～30個氨基酸序列^[21]。導肽（leader peptide）是一段引導新合成的肽鏈進入細胞器的識別序列^[22]，導肽的預測與分析對蛋白質(zhì)的功能分析、作用機制和作用途徑等具有重要意義^[23]。信號肽屬于導肽的一部分，位于靠近N端的一段氨基酸序列，導肽功能的發(fā)揮需要信號肽的存在^[24]。利用在線工具SignalP 4.1 Server的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對9種唇形科植物的GGPS蛋白進行信號肽的預測，結(jié)果表明丹參GGPS氨基酸序列中不存在信號肽，毛喉鞘蕊花和米團花GGPS氨基酸序列進行信號肽預測也得到相類似的結(jié)果。通過在線預測工具TargetP 1.1Server，對唇形科植物GGPS氨基酸序列進行了預測。以SmGGPS1為例，預測可能性是4，即可能含有低相似度的N端葉綠體轉(zhuǎn)運肽（chloroplast transit peptide）。轉(zhuǎn)運肽序列長52個氨基酸，剪切位點位于Ser52～Ala53。無法確定SmGGPS1是否具有導肽，也未發(fā)現(xiàn)其導肽分裂位點。其他8種唇形科植物的GGPS預測分析結(jié)果顯示，SmGGPS2的可靠性為5級，其余都在4級以上。LcGGPS4，LcGGPS5具有導肽分裂位點，具有導肽性，且它們的導肽很可能都是葉綠體轉(zhuǎn)運肽，提示這些米團花中的GGPS蛋白合成后，可能轉(zhuǎn)運到葉綠體中發(fā)揮作用。剩下與SmGGPS1相似，都不存在導肽分裂位點，不能確定具有何種導肽。

3.2.2 跨膜結(jié)構(gòu)域特征 跨膜結(jié)構(gòu)域一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋，常由跨膜蛋白的效應區(qū)域所展現(xiàn)。利用在線工具TMHMM Server v.2.0對SmGGPS1蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)進行預測，分析可知，其整條肽鏈都位于細胞膜之外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。毛喉鞘蕊花和米團花GGPS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果與丹參一致，提示本實驗中的GGPS蛋白均不具跨膜結(jié)構(gòu)域。信號肽是指導靶標蛋白質(zhì)跨膜定位到膜上的N端氨基酸序列^[25-26]，所以不含信號肽，理應無跨膜結(jié)構(gòu)域，說明預測結(jié)果的合理性。

3.2.3 蛋白疏水性/親水性的預測 蛋白質(zhì)親疏水性氨基酸組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力^[27]，用Protscale在線工具預測親疏水性，結(jié)果表明，SmGGPS1的多肽鏈中第167位氨基酸有最低的親水性分值-2.911。位于260位氨基酸疏水性最強，其分值為2.544。其中，親水性氨基酸占65%，疏水性氨基酸占35%。兩端多親水性氨基酸，中間多疏水性氨基酸，推測折疊的蛋白為親水性蛋白。其余8種GGPS合酶的疏水性/吸水性都與SmGGPS1類似，這也與跨膜結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果相吻合。

3.2.4 亞細胞定位特征 細胞中蛋白質(zhì)在合成后被轉(zhuǎn)運到特定的細胞器中，蛋白質(zhì)的亞細胞定位分析及預測能極大的加速了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究^[28]。對9種唇形科植物的GGPS基因編碼的氨基酸采用PSORT Prediction在線生物學工具進行亞細胞定位。結(jié)果表明（表3），SmGGPS1，PbGGPS，LcGGPS1，LcGGPS4，LcGGPS5位于膜結(jié)構(gòu)上的可能性大于0.4；SmGGPS2，SmGGPS3位于線粒體基質(zhì)上的可能性大于0.5；LcGGPS2，LcGGPS3位于細胞質(zhì)的可能性大于0.4。

3.3 二級結(jié)構(gòu)預測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈氨基酸殘基借助氫鍵折疊和盤繞形成的α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲以及模體等組件，其中，α-螺旋和β-折疊是最常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。利用SOPMA對9種唇形科植物的GGPS合酶序列進行二級結(jié)構(gòu)預測（表4），結(jié)果顯示，唇形科GGPS合酶中均有α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈。以SmGGPS1為例，其主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋（45.33%）和無規(guī)則卷曲（30.22%），其次是延伸鏈（18.13%）和β-折疊（6.32%）。余下蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件與SmGGPS1完全一致。

3.4 蛋白質(zhì)功能域的預測和分析

功能域（functional domain）又稱結(jié)構(gòu)域，是蛋白質(zhì)分子中介于二級與三級結(jié)構(gòu)之間的一種獨立結(jié)構(gòu)和功能單位，具有特定的生物學功能^[29-30]。利用Smart在線軟件對SmGGPS1蛋白的氨基酸序列進行功能域的預測和分析，結(jié)果表明（圖1），SmGGPS1蛋白含有多聚異戊二烯基合成酶的活性結(jié)構(gòu)域、2個天冬氨酸富集區(qū)結(jié)構(gòu)域、活性位點殘基蓋結(jié)構(gòu)域和鎂離子結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域，其屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，為類異戊二烯生物合成酶。對其他植物也進行了功能域的預測和分析，除SmGGPS3只有多聚異戊二烯基合成酶的活性結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合位點外，其余唇形科植物的GGPS蛋白均存在上述結(jié)構(gòu)域，這可能是由于SmGGPS3開放閱讀框全長明顯短于其他植物。

3.5 GGPS蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測和分析

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)在其二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上依靠氨基酸側(cè)鏈之間的疏水相互作用、氫鍵、范德華力和靜電作用等進一步盤繞、折疊所形成的天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)的功能與其三級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預測和分析，有助于理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性^[31-32]。利用同源建模工具SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）完成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預測和分析工作，找到了模板蛋白（ACCESSION：5E8L_A；Sequence Idenity：76.87%；GMQE：0.73），再用Swiss Pdb-Viewer工具顯示丹參GGPS1結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)^[33-35]。結(jié)果顯示：SmGGPS1蛋白由12個α-螺旋和一些不規(guī)則卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果一致-SmGGPS1主要結(jié)構(gòu)單元為螺旋結(jié)構(gòu)（圖2）。

3.6 GGPS合酶的系統(tǒng)進化樹分析

來源于同一祖先的不同植物在進化過程中的關(guān)系可以通過進化樹來描述，通過構(gòu)建植物進化樹，可以了解一種植物在進化過程中的地位^[36]。用MEGA 7.0軟件對唇形科在內(nèi)的25種有代表性的GGPS合酶蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建（圖3）。結(jié)果顯示，來源于植物，細菌，真菌，動物的GGPS合酶按照不同類群分為4群，在進化遺傳學上親緣越近的物種，在GGPS合酶的分子系統(tǒng)進化樹上距離較近，依據(jù)氨基酸序列所得出的系統(tǒng)演化關(guān)系雖不能真實的反映植物在漫長歷史長河中的自然進化關(guān)系，其結(jié)果對判斷不同植物之間的親緣關(guān)系仍具有一定的借鑒意義^[37]。

4 討論

GGPP是合成赤霉素類、二萜類、胡蘿卜素類物質(zhì)的起始前體物，而GGPS則是合成GGPP的關(guān)鍵酶，在植物的次生代謝中，調(diào)控處于代謝分支點前體的代謝方向。一般認為二萜類化合物以質(zhì)體來源GGPP為前體，已證明，在擬南芥中，質(zhì)體定位的GGPS蛋白可為赤霉素、類胡蘿卜素、脫落酸和葉綠素等物質(zhì)的合成提供GGPP前體^[38]；在辣椒中，GGPS被證明分別在果實成熟期和花發(fā)育過程中提供類胡蘿卜素的合成前體^[39-40]，在煙草中，GGPS則為煙草抗蟲（煙草天蛾）物質(zhì) HGL-DTGs（17-hydroxygeranyllinalool diterpenoid glycosides）的合成提供前體^[41]。此外，茉莉酸甲酯（MJ），已經(jīng)驗證其在曼地亞紅豆杉、加拿大紅豆杉和番茄等植物中可上調(diào)GGPS合酶的基因表達，對二萜類物質(zhì)的產(chǎn)生具有促進作用。

蛋白一級結(jié)構(gòu)預測分析結(jié)構(gòu)表明，GGPS蛋白為酸性，親水性，多為不穩(wěn)定蛋白，具有明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，不具有信號肽，可推測出GGPS可能不是分泌性蛋白，這與其都沒有跨膜結(jié)構(gòu)相對應。通過導肽分析發(fā)現(xiàn)，GGPS蛋白在細胞中的分布多樣，說明其在細胞中廣泛參與生物合成，參與的次生代謝是多樣的。結(jié)合信號肽預測結(jié)果，可推知GGPS蛋白在游離核糖體上合成后，可能通過2種途徑發(fā)揮作用，一是通過導肽進入葉綠體發(fā)揮作用；二是不進行蛋白轉(zhuǎn)運，保留在細胞質(zhì)基質(zhì)中產(chǎn)生催化作用。GGPS蛋白的二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-折疊分布于整個肽鏈結(jié)構(gòu)中。所有唇形科GGPS蛋白氨基酸序列中都含有多聚異戊二烯基合成酶的活性結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域，其屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族，為類異戊二烯生物合成酶。

利用生物信息學的方法對唇形科GGPS氨基酸序列的生理生化特性進行預測和分析，可以為GGPS蛋白及其編碼基因的克隆提供可靠的依據(jù)；對其序列結(jié)構(gòu)的預測和分析，可為其蛋白表達與修飾提供指導；并為更多物種GGPS蛋白及其編碼基因的克隆提供可靠的依據(jù)。對其二級及高級結(jié)構(gòu)的預測和分析有利于深入探討該酶結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系、作用機制和代謝過程。

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[責任編輯 呂冬梅]