楊爍+薛淵元+李美慧+趙奉熙+趙宏+張偉

[摘要]ITS2是中藥鑒定的核心DNA條形碼之一，基于ITS2的中藥鑒定方法已被納入《中國藥典》，但分辨力不足仍是制約其推廣應(yīng)用的主要因素，因此需要進(jìn)一步挖掘其有助于中藥鑒定的遺傳信息。在細(xì)胞內(nèi)，ITS2以二級(jí)結(jié)構(gòu)形式發(fā)揮功能，這種結(jié)構(gòu)所蘊(yùn)含的豐富遺傳信息是核酸序列所無法體現(xiàn)的。該研究以茄屬Solanum 26個(gè)物種的40個(gè)樣本為研究對(duì)象來探究ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)在茄屬藥用植物鑒定中的價(jià)值。作者利用PicXAA-R，MASTR和LocARNA軟件來比對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用RNAstat軟件將二級(jí)結(jié)構(gòu)信息轉(zhuǎn)為系統(tǒng)發(fā)育信息，最后利用最大簡約法進(jìn)行建樹分析。研究結(jié)果表明將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)發(fā)育信息后信息位點(diǎn)增加了88.57%，物種關(guān)系樹上50%，75%，90%以上支持率的支系分別增加了19.05%，66.67%，66.67%，從而很好地解決了茄屬幾種藥用植物的鑒定問題。鑒于以上結(jié)果，作者建議將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息作為系統(tǒng)發(fā)育信息的有益補(bǔ)充加入到目前DNA條形碼分析中。

[關(guān)鍵詞]DNA條形碼； ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)； 藥用植物； 茄屬

[Abstract]Internal transcript spacer 2 （ITS2） is one of the broadly used standard core barcodes and also the only nuclear barcode in identification of Chinese traditional medicine. Although the DNA barcode method based on ITS2 is popular and has been used in Chinese Pharmacopoeia， its low discriminatory efficiency is still a problem to its extensive application. Therefore， further study is still necessary to explore its phylogenetic information for medicinal plants identification. In cells， ITS2 activity is based on its secondary structure. The secondary structures are particularly useful in phylogenetic analysis because they include information not found in the primary sequence. In this study ITS2 secondary structure of 40 samples from 26 species were predicted and used to explore their utility in addressing the identification problems of Chinese traditional medicine in Solanum. The secondary structures were predicted and aligned， and their consensus models were generated using the three different software of LocARNA， MASTR and PicXAA-R. RNAstat software was used to transform the secondary structures into 28 symbol code data for maximum parsimony （MP） analysis. The results showed that the phylogenetic information increased 88.57% after ITS2 secondary structure information has been added， and then the support values above 50%， 75% and 90% in the tree increased 19.05%， 66.67% and 66.67%， respectively， indicating that the identification of Solanum medical plants has been well resolved. Thus， our analysis suggests that ITS2 secondary structure information should be incorporated into the current DNA barcoding analysis as a beneficial supplement of phylogenetic information.

[Key words]DNA barcode； ITS2 secondary structure； medical plants； Solanum

DNA條形碼技術(shù)作為一種新興的分子鑒定技術(shù)，近年來受到廣泛的關(guān)注。該技術(shù)是利用一種短而標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行快速而準(zhǔn)確鑒定的方法^[1-2]。由于它不受物種的形態(tài)學(xué)特征及發(fā)育階段的限制，且準(zhǔn)確性較高，在藥用植物鑒定中備受關(guān)注。ITS（internal transcribed spacer）具有進(jìn)化速率快、易于擴(kuò)增、通用性好和雙親遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化研究中最重要的分子標(biāo)記之一^[3-5]。ITS2是ITS系統(tǒng)發(fā)育信息的主要來源，它在物種水平甚至種下水平都具有明顯的序列變異，具有更高的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)價(jià)值，因此被建議作為種子植物、真菌物種鑒定的DNA條形碼^[6-8]。在藥用植物鑒定中基于ITS2的藥用植物鑒定方法已被《中國藥典》收錄^[9]。盡管ITS2作為DNA條形碼有諸多優(yōu)點(diǎn)，然而它還不能像COI在動(dòng)物中那樣成為物種鑒定的理想DNA條形碼，主要原因是分辨力依然較低^[10]。提高分辨率的傳統(tǒng)做法是增加單一DNA片段的長度或片段組合數(shù)，然而這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，更重要的是隨著基因片段的增加，PCR成功率呈幾何倍數(shù)下降^[11-12]，不適用于像中藥材這樣DNA容易降解的材料。因此，如何在不增加片段長度的情況下提高DNA條形碼的分辨率是解決問題的關(guān)鍵。

以往的DNA條形碼研究大多基于ITS2一級(jí)結(jié)構(gòu)（堿基替換信息），近年來有關(guān)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究與應(yīng)用逐漸被報(bào)道^[13-17]。它是由RNA單鏈自身回折而形成的配對(duì)和未配對(duì)堿基交替而成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這為核糖體的剪切、正確組裝與成熟提供了必需信號(hào)^[18]。這種生理結(jié)構(gòu)的形態(tài)和進(jìn)化特征是核酸序列所不能體現(xiàn)的，它們蘊(yùn)含著潛在的系統(tǒng)發(fā)育信息^[19-21]。早在20世紀(jì)80年代就有RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)發(fā)育中的價(jià)值研究^[22]。然而由于當(dāng)時(shí)難以獲得和比對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有引起足夠重視。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，關(guān)于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的算法大量涌現(xiàn)^[23-26]。在二級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì)方面也有諸多的算法和軟件^[27-29]，特別是基于共有結(jié)構(gòu)來比對(duì)長RNA的快速算法，如MRNA^[30]，MXSCARNA^[31]，R-Coffee^[32]以及近年來出現(xiàn)的最大期望精確度算法（maximum expected accuracy，MEA）^[33]大大提高了序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和運(yùn)算速度。這些算法和運(yùn)算軟件的發(fā)展為挖掘ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育價(jià)值提供了技術(shù)保障。

茄屬Solanum L.植物廣泛分布于熱帶及溫帶地區(qū)，是藥用植物資源利用歷史較早且物種豐富的類群。該屬除了茄S. melongena L.、白英S. lyratum Thunb、龍葵S. nigrum L.被載入《中國藥典》之外，還有很多民間傳統(tǒng)中藥資源，如歐白英S. dulcamara L.、少花龍葵S. americanum Miller、澳洲茄S. laciniatum Aiton、珊瑚櫻S. pseudocapsicum L.等。茄的果實(shí)與葉片均含有葫蘆巴堿，有顯著的抗癌作用，茄根有散熱消腫，止血的功效，用于治療久痢便血、腳氣、凍瘡等^[34]；白英全草入藥，用于風(fēng)熱外感，發(fā)熱咳嗽，濕熱黃疸等，外用于風(fēng)濕痹痛等；龍葵全草有清熱解毒、利水消腫的功效，用于治療小便不利、瘡癰腫毒等^[35]。這3種植物均為傳統(tǒng)中藥材，由于它們的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)、本草記載的植物來源不一、植物分布和藥材產(chǎn)地較廣、地方用藥習(xí)慣不同等原因，使得這些藥材與其替代品之間相互混用現(xiàn)象嚴(yán)重。這種混亂的現(xiàn)象嚴(yán)重影響了藥材的使用安全。然而由于正品和替代品之間形態(tài)特征非常相似，傳統(tǒng)的鑒定方法難以對(duì)它們進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定。

本研究將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育價(jià)值與DNA條形碼研究結(jié)合，并將其應(yīng)用到茄屬常見中藥材的分子鑒定上，擬解決以下問題：①比較目前有關(guān)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和比對(duì)的經(jīng)典或最新方法，根據(jù)預(yù)測的準(zhǔn)確性評(píng)估出最適用于DNA條形碼的方法；②比較ITS2核酸序列信息、ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息以及ITS2核酸信息和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息聯(lián)合分析在茄屬藥用植物DNA鑒定中支持率和鑒定效率的差別，搞清楚ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)是否能夠以及在多大程度提高物種鑒定效率。在此基礎(chǔ)之上為相關(guān)藥用植物的DNA條形碼鑒定提供方法參考。

1 材料

本研究選取了茄屬中部分具有藥用價(jià)值的物種，包括藥典收錄的白英、茄、龍葵及其近緣種，一些民間藥用植物，以及茄屬不同進(jìn)化支系上的代表物種^[36]，共計(jì)26種，40樣本（表1）。

2 方法

2.1 ITS2序列的獲取及比對(duì)

從GenBank上下載相關(guān)物種的ITS序列，根據(jù)GenBank基因注釋信息或隱馬爾可夫模型（HMMs）^[37]識(shí)別出ITS2的區(qū)域，去除在3′端和5′端的5.8S和26S rDNA序列，獲得完整的ITS2序列。利用Clustal X軟件對(duì)ITS2序列進(jìn)行序列對(duì)比，比對(duì)結(jié)果使用Bioedit 7.0.5進(jìn)行人工校正。

2.2 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測、二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)及比對(duì)方法評(píng)估

本研究分別選取了最新的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)非漸進(jìn)式的算法MASTR^[38]，最大期望精確度算法PicXAA^[39]，以及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)中經(jīng)典的LocARNA算法^[40]。MASTR和PicXAA軟件具有二級(jí)結(jié)構(gòu)生成和二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)的雙重功能，將ITS2核酸序列矩陣的Fasta格式輸入后可直接產(chǎn)生各個(gè)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的共有模型。本研究還使用了LocARNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)功能，利用軟件Mfold^[41]或網(wǎng)站ITS2 database二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測在線服務(wù)器（http：//its2-old.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/cgi-bin/index.pl？custom）將核酸序列折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)后，再將核酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣輸入到LocARNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)。 比較3種方法獲得的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型，篩選出最優(yōu)模型。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)信息編碼和系統(tǒng)發(fā)生分析

利用Subbotin等^[42]提出的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)28字符編碼法（圖1），即將螺旋中的4種堿基分為6種狀態(tài)（如AA，AC，AG，AU，A-，-A），同時(shí)將環(huán)上的4種堿基狀態(tài)作為額外特征一起考慮，一共得到28種堿基編碼，通過軟件RNAstat將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)信息矩陣。使用PAUP4.0b10中的最大簡約法（maximum parsimony，MP）對(duì)ITS2核酸信息、ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息分別進(jìn)行單獨(dú)和聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析。分析參數(shù)設(shè)置為啟發(fā)式搜索隨機(jī)重復(fù)1 000次，TBR分枝交換法獲取系統(tǒng)樹，選擇多重樹（multrees）選項(xiàng)。自舉分析1 000次重復(fù)以檢測分支的可靠性。利用PAUP4.0b10中的數(shù)據(jù)同質(zhì)性檢驗(yàn)（ILD test）模塊對(duì)核酸序列和其二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育信息的一致性進(jìn)行評(píng)估。

3 結(jié)果

3.1 序列矩陣

3.1.1 3種二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)軟件產(chǎn)生的結(jié)果比較 3種二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)軟件產(chǎn)生了40條ITS2核酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)共有模型，都為莖環(huán)結(jié)構(gòu)模型。其中LocARNA產(chǎn)生了典型的一環(huán)四臂結(jié)構(gòu)，其中臂Ⅲ最長，臂Ⅱ最為保守，臂Ⅳ保守位點(diǎn)最少、變異最大。在堿基組成上LocARNA產(chǎn)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出了規(guī)律性：臂Ⅱ有一個(gè)嘧啶組成的鼓凸（bulge），臂Ⅲ有一段TGGT的共有序列（sequence motif），在臂Ⅰ和臂Ⅳ之間的大環(huán)富含嘌呤，這些特點(diǎn)都符合ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)在植物中的共有特征^[44]。除此之外，在茄屬還有一些特征性共有序列，如臂Ⅰ上的UCCG，GCC序列，臂Ⅱ上的CCGUG序列，臂Ⅲ上GUCGCGGC序列（圖2A）。MASTR和PicXAA產(chǎn)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)共有模型只顯示了結(jié)構(gòu)，沒顯示核酸組成。PicXAA也產(chǎn)生了一環(huán)四臂的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)基本式樣，然而由于堿基配對(duì)過度嚴(yán)謹(jǐn)，大環(huán)上6～9，118～121位點(diǎn)處進(jìn)行了互補(bǔ)配對(duì)打破了大環(huán)的整體結(jié)構(gòu)（圖2B）。MASTR產(chǎn)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)共有模型為一環(huán)三臂類型（圖2C）。除此之外由于對(duì)每條序列插入/缺失處理不一樣，使得排列后矩陣的長度不一樣，LocARNA，MASTR，PicXAA排列后序列矩陣的長度分別為237，255，228 bp，與之對(duì)應(yīng)的是各個(gè)臂上鼓凸的數(shù)量也有所不同。由于ITS2在植物中一環(huán)四臂的基本結(jié)構(gòu)已被證實(shí)^[45]，因此LocARNA產(chǎn)生的運(yùn)算結(jié)果較準(zhǔn)確。

3.1.2 常規(guī)序列比對(duì)軟件與LocARNA序列比對(duì)軟件產(chǎn)生的結(jié)果比較 作者將常規(guī)序列比對(duì)軟件Clustal X對(duì)ITS2的序列比對(duì)結(jié)果（圖3A）與基于ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)產(chǎn)生的矩陣（圖3B）進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者存在一些差別。首先兩矩陣的長度不一樣，Clustal X產(chǎn)生的矩陣長度為248 bp，ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)產(chǎn)生的矩陣長度為237 bp。這是由于它們插入/缺失的位置不同，因此它們產(chǎn)生的信息位點(diǎn)也不一致（表2）。由于二級(jí)結(jié)構(gòu)形式是ITS2在細(xì)胞內(nèi)的存在形式，而常規(guī)軟件所假定的計(jì)算模型都是序列線型形式，因此基于ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)的運(yùn)算結(jié)果更能反應(yīng)序列差異的真實(shí)狀態(tài)。

3.2 系統(tǒng)學(xué)分析

3.2.1 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)育信息與核酸序列系統(tǒng)發(fā)育信息比較 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)由RNAstat編碼，共生成了169個(gè)堿基位點(diǎn)，包括111個(gè)變異位點(diǎn)和61個(gè)簡約位點(diǎn)。MP分析共產(chǎn)生106棵最短樹，每棵樹的步長均為265，CI為0.713 2，RI為0.836 6。作者將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)編碼信息構(gòu)建的嚴(yán)格一致樹與核酸序列信息構(gòu)建的嚴(yán)格一致樹進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)幾乎一致（圖4），ILD測試結(jié)果也表明，在序列數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)間沒有明顯的系統(tǒng)發(fā)育信息沖突（P=1.00），因此作者將這2組數(shù)據(jù)結(jié)合到一個(gè)數(shù)據(jù)集中，聯(lián)合矩陣中共406個(gè)位點(diǎn)，包括227個(gè)變異位點(diǎn)和132個(gè)簡約位點(diǎn)，與核酸常規(guī)序列比對(duì)算法（Clustal X）產(chǎn)生的矩陣相比信息位點(diǎn)增加了88.57%。聯(lián)合矩陣共計(jì)生成2棵步長為513的最短樹，其CI為0.690 1，RI為0.830 5（表2），這表明二級(jí)結(jié)構(gòu)信息的加入在沒有顯著改變數(shù)據(jù)的異質(zhì)性的情況下大大提高了信息位點(diǎn)的數(shù)量。

3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與物種鑒定結(jié)果 ITS2核酸序列與其二級(jí)結(jié)構(gòu)編碼的信息聯(lián)合分析產(chǎn)生了一棵嚴(yán)格一致樹，該樹圖與常規(guī)使用的核酸信息相比解決了更多的種間關(guān)系。如在核酸信息構(gòu)建的關(guān)系樹圖上龍葵、紅果龍葵S. villosum和少花龍葵3個(gè)近緣種之間的親緣關(guān)系沒有得到解決（圖5A），而加入ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育信息后3個(gè)物種之間的關(guān)系得到了很好的解決（圖5B）。此外，ITS2核酸信息和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息聯(lián)合分析顯著提高了某些支系的支持率。如在核酸信息構(gòu)建的樹圖上大于50%（低度及以上支持）、75%（中度及以上支持）和90%（高度支持）的支系分別為21，9，6個(gè)（圖5A），而在聯(lián)合二級(jí)結(jié)構(gòu)信息構(gòu)建的樹圖上相應(yīng)的支系分別為25，15，10個(gè)。在該樹圖上傳統(tǒng)中藥龍葵與茄的不同個(gè)體自成單系，能夠與它們各自的近緣種區(qū)分出來。而白英與其近緣種歐白英、千年不爛心S. cathayanum相互嵌合在一起，并未區(qū)分開，研究結(jié)果提示需要在經(jīng)典分類上對(duì)這3個(gè)種進(jìn)行進(jìn)一步的修訂（圖5B）。

4 討論

茄屬有1 400余種，是一個(gè)進(jìn)化復(fù)雜、經(jīng)典分類混亂的類群，前人曾嘗試對(duì)該類群進(jìn)行DNA條形碼鑒定工作，但并未得到理想效果^[46]。本研究將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)作為條形碼鑒定信息的有益補(bǔ)充應(yīng)用到該類群部分藥用植物的鑒定上，研究結(jié)果表明這種信息可有效提高支系的支持率和物種的鑒定效率。中藥材經(jīng)過加工、長時(shí)間儲(chǔ)存之后DNA容易降解，因此后續(xù)的DNA提取和PCR擴(kuò)增十分困難。因此傳統(tǒng)上使用增加單一DNA片段的長度或片段組合數(shù)來提高物種分辨率的做法，并不適合中藥材。本研究將ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息轉(zhuǎn)化成了系統(tǒng)發(fā)育信息，在沒有增加片段長度的情況下提高DNA條形碼的分辨率，這為藥用植物DNA條形碼鑒定率低的難題提供了解決思路。ITS/ITS2是植物系統(tǒng)發(fā)育研究使用最多的分子標(biāo)記之一，也是中藥材分子鑒定的核心DNA條形碼，目前GenBank已有海量的ITS2數(shù)據(jù)，若有效利用ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息可進(jìn)一步促進(jìn)分子系統(tǒng)學(xué)、DNA條形碼鑒定等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。

雖然二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育價(jià)值在20世紀(jì)80年代就被提出和研究，但是大規(guī)模利用該信息還需要澄清和解決一些難題。一個(gè)核心問題是如何比對(duì)和編碼二級(jí)結(jié)構(gòu)，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，關(guān)于基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)的方法越來越多，出現(xiàn)了幾個(gè)不同的學(xué)派，例如德國的Wolf研究組、美國的Subbotin研究組和Coleman研究組，這些學(xué)派使用的分析方法均有不同。影響較大的Wolf研究組使用的4SALE比對(duì)方法是將ITS2核酸信息及其二級(jí)結(jié)構(gòu)作為整體比對(duì)產(chǎn)生編碼信息^[47]，而本研究所使用的Subbotin的28字符編碼法可以將二級(jí)結(jié)構(gòu)信息單獨(dú)編碼轉(zhuǎn)化成系統(tǒng)發(fā)育信息，并綜合比較了ITS2核酸序列信息、二級(jí)結(jié)構(gòu)指導(dǎo)排列的核酸序列信息、ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息以及ITS2核酸信息和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息聯(lián)合分析，可用于比較的系統(tǒng)發(fā)育信息更豐富，是一個(gè)很好的嘗試。此外，本研究所使用的MASTR，PicXAA，LocARNA這3種方法是目前最新的或最經(jīng)典的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)方法，通過對(duì)比檢驗(yàn)，本研究確定了最佳的LocARNA方法。這種方法不僅適用于ITS2序列，也適用于其他具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析分子標(biāo)記，因此該方法可能比4SALE更有價(jià)值。另一個(gè)核心問題是數(shù)據(jù)的處理問題。在分子系統(tǒng)學(xué)中，目前廣泛使用的核酸信息是基于堿基的變異和排列，而對(duì)堿基變異的假設(shè)是獨(dú)立和隨機(jī)的^[48]。二級(jí)結(jié)構(gòu)的維持是通過堿基的相互作用，例如規(guī)范的配對(duì)AU，GC，不規(guī)范的配對(duì)GU，不穩(wěn)固的AC，以及稀有的GA，AA^[49-50]。在核酸發(fā)生變異時(shí)，一側(cè)堿基突變后，另一側(cè)與它互補(bǔ)的堿基也常常發(fā)生相應(yīng)的替換（這可能與維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)），這種現(xiàn)象為堿基補(bǔ)償替換（compensatory base changes，CBCs）。如果一側(cè)堿基突變后，另一側(cè)與它互補(bǔ)的堿基沒有發(fā)生相應(yīng)的替換，這種現(xiàn)象為半補(bǔ)償性替換（hemi-CBC）^[51]。這種突變機(jī)制是目前的核酸所不具備的，而突變后堿基配對(duì)的方式也是核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)所無法體現(xiàn)的，因此二級(jí)結(jié)構(gòu)信息包含著一級(jí)核酸序列所沒有的額外的系統(tǒng)發(fā)育信息^{[19，45]}，充分挖掘這種信息可以獲得更多的信息位點(diǎn)，從而解決更多物種的種間關(guān)系。然而，由于當(dāng)前使用的JC69，K80，HKY85，GTR等分子進(jìn)化模型不適用于ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)化或堿基替代規(guī)律，因此依賴于進(jìn)化模型的建樹方法如最大似然法（maximum likelihood，ML），貝葉斯方法（Bayesian，BI）或鄰接法（neighbour-joining，NJ）都不適合直接分析ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。鑒于上述原因，本研究利用了不依賴于分子進(jìn)化模型的MP方法對(duì)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育分析做了很好的探索，然而后續(xù)研究需進(jìn)一步探索ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)化規(guī)律，以充分利用其分子變異信息。

基于ITS2序列信息構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示白英、歐白英及千年不爛心并不能進(jìn)行分子區(qū)分，而加上ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育信息后也沒有解決三者之間的關(guān)系和分類地位。這3個(gè)物種不僅形態(tài)學(xué)特征極其相似而且化學(xué)成分和藥效也幾乎相同^[52-53]，古代本草、現(xiàn)代藥著乃至民間中藥，經(jīng)常將它們共同作為中藥“蜀羊泉”、“白毛藤”或“苦茄”相互混用。如對(duì)“苦茄”的藥源植物，《中藥大辭典》認(rèn)定為千年不爛心，而《中華本草》認(rèn)定為歐白英。目前《Flora of China》將千年不爛心與白英合并為同一物種，而并未對(duì)歐白英進(jìn)行分類處理。然而，曾經(jīng)有研究認(rèn)為白英是歐白英的一個(gè)變種^[54]。歐白英與白英形態(tài)學(xué)特征極為相似，差別僅在莖與葉上被毛的長短，而且對(duì)于兩者的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系并沒有明確的分子證據(jù)^[54]。本研究通過ITS2及其二級(jí)結(jié)構(gòu)信息對(duì)歐白英與白英進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建，首次為歐白英和白英間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系提供了分子證據(jù)，支持將兩者進(jìn)一步合并的分類處理，研究結(jié)果為該類群后續(xù)進(jìn)一步的分類修訂提供了依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]