陶昱 喻金鳳 陳軍 余勇

從生物學(xué)的角度來(lái)看，要想實(shí)現(xiàn)良好的牙周組織再生需要2 個(gè)關(guān)鍵因素：合適的種子細(xì)胞和有利的局部微環(huán)境。1992 年Wise教授[1]首次發(fā)現(xiàn)人牙囊細(xì)胞(human dental follicle stem cells, HDFSCs)，大量研究證實(shí)HDFSCs可向成骨、成軟骨、成脂、成神經(jīng)方向分化[2-4]，并在適當(dāng)條件誘導(dǎo)下，HDFSCs可以在體內(nèi)外形成牙周膜樣組織、牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體及骨組織[5-6]。經(jīng)典牙齒發(fā)育理論認(rèn)為，HDFSCs是成牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，其分別形成牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨，這三者便構(gòu)成完整的牙周組織[7-8]。同時(shí)，有研究證明HDFSCs比牙周膜細(xì)胞有更好的分化潛能，所以HDFSCs在牙周組織再生過程中具有巨大的應(yīng)用前景[9]。在牙齒發(fā)育過程中，牙周膜的形成是由包繞成釉器的牙囊和發(fā)育中的牙髓共同作用的結(jié)果[10]。為了盡可能的模擬牙周膜形成過程中的局部微環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)采用牙髓細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)HDFSCs，探討人牙髓細(xì)胞條件培養(yǎng)液(human dental pulp stem cells- conditioned medium，HDPSCs- CM)對(duì)HDFSCs成骨分化的作用，以期為牙周組織再生提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

分選型流式細(xì)胞儀(BD influx,美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(TCS.SP8,Leica，德國(guó));兔抗人波形絲蛋白抗體(Immuno Way,美國(guó))；鼠抗人角蛋白(CK- 14)抗體(Santa Cruz,美國(guó))；鼠抗人CD34、CD73、CD105及Strol- 1抗體(BD Biosciences,美國(guó))；CCK- 8試劑盒(Dojindo,日本)； RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Syber Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(Takara,日本)。

1.2 HDFSCs的分離、純化及培養(yǎng)

HDFSCs來(lái)源于因正畸需要拔除的第三磨牙患者，患者簽知情同意書，且年齡在18～25 歲之間、無(wú)其他系統(tǒng)疾病,牙齒健康、處于牙根發(fā)育階段。取出牙囊組織后采用組織塊-消化聯(lián)合法分離培養(yǎng) HDFSCs并用單克隆細(xì)胞培養(yǎng)方法純化，第3代細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。采用免疫熒光方法(波形蛋白和角化蛋白CK- 14)對(duì)分離細(xì)胞進(jìn)行來(lái)源鑒定。

1.3 HDPSCs- CM的制備

HDPSCs來(lái)源同HDFSCs。取得的牙齒在無(wú)菌條件下劈開牙冠和牙根，取出牙髓組織，含2%雙抗的PBS反復(fù)沖洗。其余步驟同HDFSCs。每24 h換液1 次，直至細(xì)胞融合約80%時(shí)，收集培養(yǎng)液，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，收集上清液，0.22 μm過濾器過濾，加入等量新鮮的含10%FBS的DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)液制成HDPSCs條件培養(yǎng)液(HDPSCs- CM)，-80 ℃中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析

根據(jù)抗體說(shuō)明書，取第3代HDFSCs分別與抗體CD34、CD73、CD105和Stro- 1室溫下避光孵育45 min，PBS洗滌重懸后，上機(jī)檢測(cè)分析。

1.5 HDFSCs克隆形成能力檢測(cè)

取第3代HDFSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×102的密度接種到100 mm培養(yǎng)皿中，輕輕晃蕩，使細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)皿中，常規(guī)換液，待單個(gè)細(xì)胞增長(zhǎng)到50 個(gè)左右時(shí)，按照結(jié)晶紫染色說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞染色，體式顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 HDPSCs- CM誘導(dǎo)HDFSCs

取第3代HDFSCs隨機(jī)分為誘導(dǎo)組和對(duì)照組。誘導(dǎo)組加入HDPSCs- CM，對(duì)照組加入含10%FBS的DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)液，2 組均采用半換液1 次/2 d，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)改變。

1.7 CCK- 8檢測(cè)HDFSCs增殖活性變化

取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HDFSCs，以2×103/孔的密度接種到96 孔板中，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，24 h后，按分組情況加入HDPSCs- CM或?qū)φ战M培養(yǎng)液，采用CCK- 8進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)檢測(cè)7 d。

1.8 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)

取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HDFSCs，接種于6孔板，密度為2.5×104/孔，按分組情況分別加入HDPSCs- CM或?qū)φ战M培養(yǎng)液以及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。經(jīng)過7 d和21 d后分別進(jìn)行ALP染色和茜素紅S染色。

1.9 qRT- PCR檢測(cè)HDFSCs mRNA的表達(dá)差異

取第3代HDFSCs以5×104/孔接種到6孔板中，HDPSCs- CM誘導(dǎo)7 d后，根據(jù)TaKaRa試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行qRT- PCR檢測(cè)，均采用20 μl反應(yīng)體系，引物見表 1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表 1 引物信息

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HDFSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

與以往研究一致[1-3]，與其他間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞一樣，HDFSCs具有極強(qiáng)的克隆形成能力(圖 1A)，結(jié)晶紫染色呈藍(lán)紫色(圖 1B)。免疫熒光結(jié)果：波形蛋白陽(yáng)性著色(圖 1C)，提示細(xì)胞是間充質(zhì)來(lái)源；CK- 14陰性著色(圖 1D)，提示分離的HDFSCs無(wú)上皮來(lái)源。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

結(jié)果表明：間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO- 1及CD105陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為12.01%和97.02%；淋巴細(xì)胞標(biāo)志物CD73陽(yáng)性，陽(yáng)性率為98.70%，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34陰性，只有0.69%(圖 2)。

A： 克隆形成； B： 結(jié)晶紫染色； C： 波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性； D： CK- 14表達(dá)陰性

圖 2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定HDFSCs表型

2.3 誘導(dǎo)后HDFSCs形態(tài)學(xué)改變

對(duì)照組中HDFSCs始終保持長(zhǎng)梭形形態(tài)，即使連續(xù)培養(yǎng)2 周，其形態(tài)也未發(fā)生明顯變化(圖 3)；而在實(shí)驗(yàn)組中，經(jīng)HDPSCs- CM誘導(dǎo)2 周后，HDFSCs逐漸喪失其最初的長(zhǎng)梭形形態(tài)，呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞的短梭形或圓形(圖 3)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，短梭形或圓形細(xì)胞的比例會(huì)明顯增加。

2.4 誘導(dǎo)后HDFSCs活性的改變

CCK- 8結(jié)果示誘導(dǎo)組和對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)均呈“S”型。除第1天，誘導(dǎo)組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上HDFSCs活性均低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)(圖 4)。

2.5 誘導(dǎo)后HDFCS成骨分化能力的改變

在ALP染色中，誘導(dǎo)組有大量的藍(lán)紫色陽(yáng)性染色，而對(duì)照組則顏色較淡。茜素紅S染色的結(jié)果顯示誘導(dǎo)組的紅色礦化結(jié)節(jié)比對(duì)照組染色深而聚集，而對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)色淡且較分散(圖 5)。

圖 4 CCK- 8檢測(cè)HDFSCs活性

圖 5 成骨相關(guān)檢測(cè)

圖 6 qRT- PCR檢測(cè)HDFSCs基因表達(dá)

2.6 誘導(dǎo)后HDFSCs基因表達(dá)的變化

qRT- PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)HDPSCs- CM誘導(dǎo)1周后，誘導(dǎo)組和對(duì)照組HDFSCs均表達(dá)POSTN、Col- Ⅰ、ALP、BSP和OPN，誘導(dǎo)組相關(guān)基因表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)(圖 6)。

3 討 論

干細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景使得干細(xì)胞的研究成為21世紀(jì)最熱門的研究之一。HDFSCs具有與間充質(zhì)干細(xì)胞相似的特征，并且在體外具有向多種細(xì)胞系分化的潛能[2-6]。因此，HDFSCs是細(xì)胞治療和組織工程很好的種子細(xì)胞。有研究表明，局部微環(huán)境在人類多能干細(xì)胞的增殖、分化過程中發(fā)揮著重要作用[11]。其中局部微環(huán)境中產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子起著主要作用。傳統(tǒng)方法中，僅用某些生長(zhǎng)因子來(lái)模擬其微環(huán)境是很難實(shí)現(xiàn)完全模擬的，因?yàn)檫@不可能提供全部所需的生物因子。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HDPSCs- CM誘導(dǎo)HDFSCs的方式來(lái)建立牙周膜再生的微環(huán)境，為HDFSCs成骨分化提供合適的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)狀通路。

研究表明牙周膜干細(xì)胞來(lái)源于HDFSCs，表現(xiàn)為類似于外胚間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞的長(zhǎng)梭形形態(tài)[8,12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HDFSCs來(lái)源于外胚間充質(zhì)，且具有干細(xì)胞的特征。在HDPSCs- CM誘導(dǎo)下，HDFSCs還可以向類似于成牙骨質(zhì)或成骨細(xì)胞分化，這對(duì)牙周再生的實(shí)現(xiàn)具有重要的意義，并且將來(lái)有望建立成牙骨質(zhì)或成骨細(xì)胞系。盡管僅僅靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變并不能判斷細(xì)胞發(fā)生分化，但在對(duì)照組中，并沒有發(fā)現(xiàn)類似的成牙骨質(zhì)或成骨細(xì)胞形態(tài)的改變。

細(xì)胞增殖活性測(cè)定結(jié)果顯示：HDPSCs- CM誘導(dǎo)后HDFSCs增殖活性明顯降低，提示HDPSCs- CM促進(jìn)HDFSCs分化的同時(shí)抑制其增殖活性。這種現(xiàn)象與由于參與這兩個(gè)過程的雙功能調(diào)節(jié)的存在使得增殖和分化呈負(fù)性相關(guān)的理念是一致的[13]。

ALP作為成骨細(xì)胞分化和功能成熟的早期標(biāo)志物，在礦化過程中有著關(guān)鍵作用。HDPSCs- CM誘導(dǎo)組的ALP染色較對(duì)照組明顯。此外鈣鹽沉積是成骨分化晚期的標(biāo)志物，通過茜素紅S染色發(fā)現(xiàn)：相比對(duì)照組，HDPSCs- CM誘導(dǎo)組的紅色鈣鹽結(jié)節(jié)明顯。由此說(shuō)明HDPSCs- CM能促進(jìn)HDFSCs向成骨方向分化。

本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了牙周膜相關(guān)基因(POSTN、Col- Ⅰ)、成骨相關(guān)基因(ALP、BSP、OPN)的表達(dá)情況，后者通常被認(rèn)為是礦化相關(guān)基因，特別是牙源性硬組織[14-15]。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組中Col- Ⅰ、ALP、BSP和OPN表達(dá)明顯增強(qiáng)。提示HDPSCs- CM可以誘導(dǎo)HDFSCs成牙骨質(zhì)或成骨分化。POSTN作為牙周膜的特異性標(biāo)記基因[16]，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中其表達(dá)也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明經(jīng)HDPSCs- CM誘導(dǎo)的HDFSCs確實(shí)獲得了牙周膜干細(xì)胞的一些特征。

綜上所述，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)HDPSCs- CM誘導(dǎo)的HDFSCs在體外確實(shí)有潛能獲取牙周膜干細(xì)胞的一些特征，同時(shí)還能向成牙骨質(zhì)或成骨方向分化。HDPSCs- CM提供了其必需的生長(zhǎng)因子、生物分子和必要的信號(hào)網(wǎng)狀通路。然而，關(guān)于HDPSCs- CM促進(jìn)HDFSCs成骨分化的內(nèi)在機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。