王麗麗 孫源卿 張穎麗 孫宏晨 林權(quán) 于維先 李祥偉

口腔是一個有菌環(huán)境，細(xì)菌必然影響口腔疾病的治療效果及預(yù)后。口腔臨床常用的氧化鋅和氫氧化鈣類材料抑菌性能較差[1],氫氧化鈣材料穩(wěn)定性較差，易被吸收或溶解[2]，另外，殘余材料還會影響氧化鋅與丁香油的螯合反應(yīng)[3]而影響材料性能。因此，本研究檢測CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米材料的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

氧化鋅粉、丁香油酚、(上海阿拉丁生物試劑有限公司)；iRoot根管封閉劑(貝曼科學(xué)醫(yī)藥有限公司，瑞士，批號：14002SP)、鹽酸米諾環(huán)素軟膏(Sunstar INC，日本，批號：1509041)；臺式高速離心機(5810，Eppendorf，德國)；掃描電子顯微鏡(JEM- 6700F, JEOL,日本)；透射電子顯微鏡(H- 800，HITACHI，日本)；等離子體發(fā)射光譜儀(Optima 3300DV, PerkinElmer，美國)；酸度計(PB- 10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國)；變形鏈球菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC- 25135)、糞腸球菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC- 29212)、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC- 11229)、金黃色葡萄球菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC- 25923)。

1.2 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球制備及表征檢測

采用液相沉淀法制備CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球，掃描電鏡(SEM)觀察表面形貌，透射電鏡(TEM)觀察球粒大小、電感耦合等離子體(inductively coupled plasma, ICP)分析其離子組成。

1.3 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球的離子釋放

1.3.1 pH值檢測 將制備的CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米材料分散于PBS(pH 7.2)中，恒溫持續(xù)震蕩(90 r/min)，分別在3、6、12、24、48 h時間點，將反應(yīng)體系離心，取上清液5 ml，在室溫條件下，測定pH，反應(yīng)體系再補充等體積的新鮮PBS。

1.3.2 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米材料的鈣離子累積釋放量測定 用上述收集的上清液作為待測樣品，應(yīng)用甲基麝香草酚藍(lán)法(MTB)[4]，用紫外分光光度計測定待測試樣、對照試樣及標(biāo)準(zhǔn)樣。再檢測試樣的鈣濃度。鈣濃度(mmol/L)=樣品管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×2.5

1.4 抑菌性檢測

參照Morgental等[5]瓊脂擴散實驗，在無菌操作條件下，分別將金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌和變形鏈球菌復(fù)蘇，稀釋至密度為3.0×108CFU/ml，分別將上述各細(xì)菌懸液100 μl滴于MH瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌棉拭子將菌液均勻涂布至整個培養(yǎng)基表面。

在涂布好細(xì)菌的培養(yǎng)基內(nèi)打孔，每個培養(yǎng)基內(nèi)打5 個孔(孔徑為5.0 mm，深為5.0 mm)，將每個孔分別放置新鮮配制的氧化鋅-丁香油材料(1∶1粉/液比)、CaO/ZnO-丁香油材料(1∶1粉/液比)、iRoot SP材料，鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派力奧)(陽性對照)，PBS緩沖液(陰性對照)。室溫下放置2 h，再將所有培養(yǎng)皿在37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測得抑菌環(huán)直徑(是指打孔處圓心至細(xì)菌生長的最內(nèi)緣之間的距離)，所有實驗均做3 份。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球的表征

CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球的外觀為白色粉末(圖 1A)。SEM下材料顆粒為球形且分散均勻(圖 1B)，TEM下可見該納米球具有核-殼結(jié)構(gòu)(圖 1C)，粒徑范圍為80～90 nm(圖 1D)。

經(jīng)ICP檢測可見CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料含有2 種金屬元素Ca和Zn(表 1)，這說明，制備的CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料由ZnO和CaO組成。

A： 外觀； B： SEM觀察； C： TEM觀察； D： 粒徑分布

表 1 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球的ICP檢測結(jié)果

2.2 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料的離子釋放性

CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球分散在PBS后，在不同時間點，鈣離子釋放和溶液pH值的變化情況見圖 2。

A：Ca2+濃度變化； B： pH值變化

2.3 CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料的抑菌性

圖 3為CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球抑菌性檢測結(jié)果。3 種材料均能抑制細(xì)菌的生長，陰性對照組無抑菌性。CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球-丁香油材料對大腸桿菌、變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌所形成的抑菌環(huán)直徑均較大，分別為(21.38±0.66)、(26.86±0.51)、(18.45±0.77) mm，均優(yōu)于氧化鋅-丁香油組及iRoot SP組(P﹤0.01)；各材料對糞腸球菌形成的抑菌環(huán)均較小，但CaO/ZnO-丁香油組對其形成的抑菌環(huán)(9.99±0.40) mm仍大于其他材料所形成的抑菌環(huán)(P﹤0.01)。CaO/ZnO-丁香油組與陽性對照組間的抑菌環(huán)大小無統(tǒng)計學(xué)差異(P﹥0.05)。

3 討 論

牙體牙髓病及牙周病為口腔常見疾病，經(jīng)研究證實其主要致病因素為細(xì)菌感染[6]。ZnO和Ca(OH)2是治療該類疾病的較常用材料[7]，但是其抑菌效果較有限[1]。增強ZnO和Ca(OH)2類材料抑菌性的課題成為目前研究的熱點之一。為此，本研究設(shè)計和制備了CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球來提高其抑菌性能，經(jīng)表征觀察和相關(guān)檢測，證實該材料具有優(yōu)良的抑菌性和適宜的理化性質(zhì)。

圖 3 材料的抑菌性檢測結(jié)果

本研究制備的CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球的粒徑范圍為80～90 nm(圖 1)，而根管內(nèi)不同水平的牙本質(zhì)小管開口直徑為2.65～3.23 μm[8]，說明，本研究所制備的納米球在顆粒尺度方面易于填入牙本質(zhì)小管。

本實驗選擇了臨床上較常應(yīng)用的根管封閉劑(iRoot糊劑)和窩洞暫封材料(氧化鋅-丁香油)作為對照。通過對比可見，CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變形鏈球菌的抑菌性均大于iRoot及氧化鋅-丁香油(P<0.01)。CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料對糞腸球菌的抑制性較弱，但是，其抑菌效果較iRoot組和氧化鋅組均較強(P<0.01)；這可能與糞腸球菌經(jīng)常以生物膜的形式存在，而生物膜內(nèi)的細(xì)菌對抗生素的耐藥性較高有關(guān)，還可能與該菌在堿性條件下仍可繼續(xù)存活的特性有關(guān)[9]，而這些特性也是許多感染細(xì)菌難以被根除的重要原因之一[10]。由此可見，CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料具有很好的抗菌性。

研究制備的CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球在PBS中可持續(xù)釋放Ca2+和OH-，溶液pH值隨時間的增加而升高(圖 2)，pH值增高具有抑菌作用[11]，逐步釋放的Ca2+及升高的pH值可促進(jìn)局部組織礦化[12]，這在治療口腔病變，特別是牙體和牙周組織疾病方面具有積極效應(yīng)[13]。該材料通過升高局部pH值，改變細(xì)菌正常生長所需的酸性環(huán)境，破壞細(xì)菌蛋白質(zhì)及DNA，從而產(chǎn)生抑菌和殺菌作用[6]；中和細(xì)菌產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物[14]，這可能是本研究所制備的CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料具有優(yōu)異抑菌性的內(nèi)在機制。如將該新型材料用作根管封閉劑或其輔料，Ca2+可以與牙本質(zhì)中的羥磷灰石發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸鈣以封閉牙本質(zhì)小管[15]；還可以激活堿性磷酸酶活性，促進(jìn)根尖周組織修復(fù)和重建[12]。如將該材料用作窩洞暫封材料，Ca2+可促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)的再礦化[5]。

本研究結(jié)果證實所制備的CaO/ZnO核-殼結(jié)構(gòu)納米球材料具有很好的抑菌性，可望成為治療牙體等口腔硬組織疾病的抑菌性材料或其輔料。