賀曉麗 梁冬雨 劉峰 陳建霞 羅禮君

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種炎癥性的疾病，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞并攝入大量氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipid, ox- LDL)形成泡沫細(xì)胞是AS早期最主要的病理特征。相關(guān)的臨床研究均發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)的檢出率最高，幾乎達(dá)到100%，這就證明P.g與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。另外，各種研究也顯示P.g可能通過引起血小板的凝集、侵入動(dòng)脈和心臟內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的形成、引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)等方面加速和影響AS的發(fā)病進(jìn)程[2-5]。但其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

清道夫受體(scavenger receptors, SRs)是一類細(xì)胞表面糖蛋白,也是一種模式識(shí)別受體，主要分布于單核/巨噬細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)的功能，在AS等脂代謝相關(guān)疾病中起著重要作用。SRs可以分為A、B、C、D、E、F、G七大類型，B類清道夫受體主要包括SR- BI、SR- BⅡ、CD36 3 個(gè)亞型，合稱CD36超家族。其中CD36與ox- LDL的識(shí)別、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)的堆積等AS形成密切相關(guān)[6-8]。我們之前的研究證實(shí)[9]，P.g的炎癥刺激可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)，從而誘導(dǎo)加劇泡沫細(xì)胞形成。B類Ⅱ型清道夫受體(scavenger receptor class B type Ⅱ, SR- BⅡ, SR- B2)，又稱2型溶酶體整合膜蛋白(lysosomal integral membrane protein 2, LIMP2)，是一種溶酶體膜糖蛋白，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，并且在溶酶體及內(nèi)涵體等部位中大量存在[10-11]。本研究的目的是了解作為B類清道夫受體中的一員，SR- BⅡ在P.g誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成過程中的變化、作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 Lightcycler480熒光定量PCR儀(Roche,美國(guó))，倒置相差顯微鏡(Nikon,日本)等。

1.1.2 主要試劑 C57/BL6野生型小鼠(同濟(jì)大學(xué)提供)，ox- LDL(上海啟晰生物科技有限公司)，牙齦卟啉單胞菌ATCC3327(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所李鳴宇教授饋贈(zèng))，大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922(廣州環(huán)凱生物科技公司)，脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)來自大腸桿菌0111; B4、油紅O(Sigma,美國(guó))；siRNA1、siRNA2(吉瑪基因)，siPORTTMNeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑(Ambion,美國(guó))，兔抗人LIMP2單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞獲取及培養(yǎng) 6～8 周的C57/BL6小鼠，腹腔注射2 ml濃度為40 ml/L的巰基乙酸，2 d后用PBS灌洗腹腔收集細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后離心棄上清并重懸于含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞接種到12孔板和24孔板，每孔細(xì)胞數(shù)量分別為1×106和5×104。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 將P.g凍存羊血接種于BHI血瓊脂平板，置于厭氧箱進(jìn)行培養(yǎng)。待血平板上長(zhǎng)滿黑色菌落后刮取部分置于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h，鏡下和生化鑒定其為純培養(yǎng)后，離心(5 000 r/min, 5 min)、棄上清，無菌PBS洗滌3 次后使菌液重懸，用比濁儀測(cè)定OD600的值。

1.3 泡沫細(xì)胞形成的檢測(cè)

24孔板中的細(xì)胞在加入ox- LDL(100 μg/ml)、P.g(moi=200)等各種刺激后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，之后40 g/L甲醛固定30 min，沿側(cè)壁加入500 μl油紅O孵育10 min以后加入600 ml/L異丙醇并保持30 s～1 min，PBS洗滌3 次，倒置相差顯微鏡觀察泡沫細(xì)胞的形成并計(jì)算陽(yáng)性比。

1.4 Western blot檢測(cè)泡沫細(xì)胞形成過程中蛋白含量的變化

12孔板中的細(xì)胞加入各刺激之后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別在0、3、6、9、12、24 h時(shí)收集細(xì)胞蛋白并檢測(cè)蛋白含量。加入上樣緩沖液并煮樣，之后電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉后加入LIMP2單克隆抗體(抗體濃度1∶100)4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜5 min×5 次后二抗室溫孵育2 h，充分洗膜后顯影觀察。使用Image J 1.43軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化，并與GAPDH灰度值進(jìn)行比較分析。

1.5 Real- time PCR法檢測(cè)泡沫細(xì)胞形成過程中基因含量的變化

12孔板中的細(xì)胞加入刺激后在各時(shí)間點(diǎn)用Trizol收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA后進(jìn)行濃度測(cè)定并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃?zhèn)溆?。設(shè)計(jì)基因的上下游引物序列如下：Gapdh- F(5'- TGACCACAGTCCATGCCATC- 3' )，Gapdh- R(5'- GACGGACACATTGGGGGTAG- 3' )，Limp2- F(5'- TGGACCACAGACACATGCAAT- 3' )，Limp2- R(5'- CGTTCTCAAAGCTGCTGAAAG- 3' )。

引物均由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為95 ℃30 s→95 ℃5 s→60 ℃34 s，持續(xù)40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)內(nèi)參基因Gapdh以及目的基因Limp2的Ct值計(jì)算出各樣本RNA的表達(dá)量。

1.6 siRNA干擾

設(shè)計(jì)合成的siRNA序列如下：Negative control:5'- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT- 3' (正義鏈)，5'- ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT- 3' (反義鏈)；Mouse Limp2- 1:5'- CCA GAC GAU CGA GAA GAA UTT- 3' (正義鏈)，5'- AUU CUU CUC GAU CGU CUG GTT- 3' (反義鏈)；Mouse Limp2- 2:5'- GCU CCG GAA CAA GGC AAA UTT- 3' (正義鏈)，5'- AUU UGC CUU GUU CCG GAG CTT- 3' (反義鏈)。

在轉(zhuǎn)染試劑的作用下，將negative control、Limp2- 1、Limp2- 2、Limp2- 1+2(終濃度均為10 μmol/L)轉(zhuǎn)到12或24孔板中。轉(zhuǎn)染6～8 h后換成含雙抗的1640培養(yǎng)基，48 h后加入P.g刺激，8 h后收樣。24孔板用于油紅O染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 P.g促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成

ox- LDL以及P.g刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)過油紅O染色，可以觀察到空白組(NC)及P.g組沒有泡沫細(xì)胞的形成(圖 1)。只加入ox- LDL后，可以看到有少量泡沫細(xì)胞的形成，約占20%～30%，而共同加入P.g及ox- LDL后泡沫細(xì)胞約占60%～70%(圖 2)。結(jié)果表明P.g可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沫化進(jìn)程。

2.2 P.g誘導(dǎo)SR- BⅡ表達(dá)的增加。

圖 1 油紅O染色顯示P.g促進(jìn)泡沫細(xì)胞的生成

圖 2 4 組細(xì)胞中泡沫細(xì)胞陽(yáng)性百分比

蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，只加入ox- LDL刺激后，SR- BⅡ蛋白的表達(dá)有所增加，在3 h左右開始上升、6 h達(dá)到峰值；只加入P.g刺激后，SR- BⅡ蛋白的表達(dá)量比只加入ox- LDL有明顯增加和延長(zhǎng)；而同時(shí)加入P.g和ox- LDL刺激后，SR- BⅡ蛋白有較強(qiáng)的表達(dá)且明顯的延長(zhǎng)(圖 3A)。Real- time PCR結(jié)果顯示，各組刺激后SR- BⅡ基因的表達(dá)水平與蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)基本一致(圖 3B)。結(jié)果表明，在泡沫細(xì)胞形成過程中，ox- LDL和P.g的刺激都可以促進(jìn)SR- BⅡ的部分表達(dá)；但P.g的加入對(duì)SR- BⅡ表達(dá)有明顯的疊加效果。

圖 3 P.g誘導(dǎo)SR- BⅡ表達(dá)增加

比較P.g(moi=200)、E.coli(moi=10)、LPS(200 ng/ml)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后SR- BⅡ的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果示E.coli和LPS均未引起巨噬細(xì)胞中SR- BⅡ蛋白表達(dá)的明顯改變(圖 4)。表明P.g在泡沫細(xì)胞形成過程中促進(jìn)SR- BⅡ蛋白的表達(dá)具有特異性。

2.3 SR- BⅡ參與調(diào)控P.g誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成

采用siRNA沉默SR- BⅡ的表達(dá)后，檢測(cè)相關(guān)刺激對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響。結(jié)果顯示，siRNA干擾之后SR- BⅡ蛋白的表達(dá)量明顯降低，且2 種siRNA合用的干擾效果最佳(圖 5A)。與正常對(duì)照組相比較，siRNA干擾后，無論是單純ox- LDL刺激，還是P.g+ox- LDL刺激誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成均明顯減少(圖 5B)。

圖 4 P.g誘導(dǎo)SR- BⅡ表達(dá)增加具有特異性

圖 5 SR- BⅡ表達(dá)沉默后泡沫細(xì)胞生成減少(*, P<0.05； #, P<0.05)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)P.g、ox- LDL共同刺激能明顯增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化的形成。ox- LDL單獨(dú)誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成過程中有SR- BⅡ的表達(dá)；單獨(dú)采用P.g刺激巨噬細(xì)胞，SR- BⅡ的表達(dá)有所增強(qiáng)；而在二者共同刺激下，SR- BⅡ的表達(dá)呈現(xiàn)出非常明顯的疊加效果。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們分別采用P.g、E.coli和LPS刺激巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P.g對(duì)SR- BⅡ表達(dá)的上調(diào)具有特異性。同時(shí)，干擾沉默SR- BⅡ的表達(dá)，也會(huì)影響到P.g促進(jìn)的泡沫細(xì)胞形成。

既往研究表明，SR- BⅡ在對(duì)溶酶體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、介導(dǎo)某些病毒及細(xì)菌的侵入及心肌肥厚等方面發(fā)揮作用，與進(jìn)行性肌痙攣性癲癇、代謝病、心肌炎、手足口病等疾病有不同程度的關(guān)聯(lián)[12-14]，但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其在脂蛋白代謝及AS中的作用。Brown等[15]通過建立低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠模型研究P.g在加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用及機(jī)制，研究結(jié)論是TLR2- CD36/ SR- B2依賴的通路會(huì)促進(jìn)P.g介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化形成，但文中采用的抗體是針對(duì)CD36/ SR- B2的抗體，并非僅針對(duì)SR- BⅡ的特異性的研究。

心腦血管疾病是發(fā)展中國(guó)家的第一死亡原因[16]。AS是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。目前公認(rèn)[17-18]，長(zhǎng)期反復(fù)的慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化形成與擴(kuò)展的一個(gè)重要原因。清道夫受體家族和P.g是動(dòng)脈粥樣硬化形成的2 個(gè)關(guān)鍵要素。由于SR- BⅡ主要介導(dǎo)溶酶體對(duì)β- 葡糖腦苷脂酶的轉(zhuǎn)運(yùn)，也是腸道病毒71型和柯薩奇病毒的受體，所以研究者更多關(guān)注其在代謝病、手足口病等疾病中的作用。最近的研究證實(shí)[19]，SR- BⅡ蛋白形成螺旋束結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)與配體的結(jié)合(如β- 葡糖腦苷脂酶)，而根據(jù)同源性推斷，CD36，SR- BI也是通過相似的結(jié)構(gòu)結(jié)合配體。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步深入研究SR- BⅡ在脂蛋白代謝中的作用奠定了基礎(chǔ)。我們的研究表明，SR- BⅡ在泡沫細(xì)胞形成中，尤其是牙齦卟啉單胞菌促進(jìn)的泡沫細(xì)胞形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這對(duì)未來進(jìn)一步研究AS病理過程、了解P.g在AS過程中的致病機(jī)制有重要意義。