田芳++姚兆群++陳美秀++徐瑛++趙思峰

摘要：根據(jù)已知的番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）CCD7和CCD8基因的序列設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR克隆CCD7和CCD8基因片段，通過特定酶切將2個基因進(jìn)行拼接，再將串聯(lián)基因以反向重復(fù)的方式連入pUCCRNAi載體，并定向插入到p35植物表達(dá)載體上。結(jié)果表明，克隆獲得了大小約為400 bp的CCD7和CCD8基因片段，基因片段拼接后獲得800 bp左右的串聯(lián)片段CCD7-8；將該基因片段插入pUCCRNAi載體后得到1 700 bp大小的含Intron的反向重復(fù)序列In-7-8，并成功插入到植物表達(dá)載體p35中，通過酶切分析，RNAi載體構(gòu)建正確。最終成功構(gòu)建了番茄CCD7和CCD8 2個串聯(lián)基因的RNA沉默表達(dá)載體p35-In-7-8。

關(guān)鍵詞：番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）；獨腳金內(nèi)酯；列當(dāng)；類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7（CCD7）和8（CCD8）；RNA沉默載體

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5668-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.058

Construction of Strigolactones Key Genes CCD7、CCD8 of

Tomato RNA Silencing Expression Vector

TIAN Fang， YAO Zhao-qun， CHEN Mei-xiu， XU Ying， ZHAO Si-feng

（Key Laboratory of Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricul-tural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization /College of Agriculture， Shihezi Uni-versity， Shihezi 832003， Xinjiang， China）

Abstract： In order to construct tomato（Lycopersicon esculentum Mill.） carotenoid cleavage dioxygense 7（CCD7） and 8 （CCD8） RNA silencing expression vector， the specific primers were designed according to the published sequence of tomato CCD7 and CCD8. The CCD7 and CCD8 fragments were obtained by RT-PCR amplification，then they were concatenated through specific enzyme digestion，and cloned into pUCCRNAi vector in a inverted repeat manner，finally inserted into p35 plant expression vector. Results show that we cloned about 400 bp CCD7 and CCD8 gene fragment，respectively. The concatenation gene CCD7-8 of 800 bp was constructed by gene fragment splicing. Two copies of CCD7-8 gene was inserted into pUCCRNAi vector and got 1 700 bp contain Introns inverted repeat sequence In-7-8. Then they were inserted into p35 vector successfully and the RNAi vector was constructed correctly by enzyme digestion analysis. Finally successful constructed tomato CCD7 and CCD8 two concatenation genes RNA silencing expression vector p35-In-7-8.

Key words： tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）； strigolactones； orobanche； carotenoid cleavage dioxygense 7（CCD7） and 8（CCD8）；RNA silencing vector

列當(dāng)（Orobanche coerulescens Steph.）是一類無葉綠素并以全寄生方式寄生于其他植物根部獲取所需養(yǎng)分的植物，其可寄生在茄科、豆科、菊科、傘形科、葫蘆科等多種重要經(jīng)濟(jì)作物上，造成寄主植物減產(chǎn)5%～100%，已在亞洲、歐洲、非洲、南美洲和北美洲的較多國家和地區(qū)發(fā)生，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元[1-3]。人們采用農(nóng)業(yè)、物理、化學(xué)、生物等各項措施防治列當(dāng)，均無法完全防治，在列當(dāng)嚴(yán)重發(fā)生地區(qū)的農(nóng)民會因為防效和防治成本等問題直接放棄所種作物甚至棄耕土地[4，5]。列當(dāng)靠種子進(jìn)行繁殖，且種子產(chǎn)生量大，1株成熟植株可產(chǎn)生5萬～50萬粒種子，種子可隨風(fēng)、流水、人為活動等因素快速傳播，可在土壤中存活數(shù)十年，這是列當(dāng)難以防治的重要原因[1，3]。列當(dāng)種子內(nèi)的KAI2蛋白是一個受體蛋白，可感受到寄主植物根系分泌的獨腳金內(nèi)酯類似物的刺激然后誘導(dǎo)列當(dāng)種子萌發(fā)[6]，若能減少寄主植物分泌的獨腳金內(nèi)酯或使其不分泌，則有望培育出抗列當(dāng)?shù)募闹髌贩N[7]。Dor等[8]發(fā)現(xiàn)番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）突變株SL-ORT1因不能產(chǎn)生獨腳金內(nèi)酯從而對埃及（瓜）列當(dāng)表現(xiàn)出高抗特性；用類胡蘿卜素生物合成途徑抑制劑氟啶草酮處理番茄后，與對照相比，處理番茄植株根系幾乎檢測不到獨腳金內(nèi)酯，同時根際大麻列當(dāng)種子萌發(fā)率減少98%以上[9]。在植物體內(nèi)，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7（CCD7）和8（CCD8）是獨腳金內(nèi)酯合成途經(jīng)中最為關(guān)鍵的2個功能基因，可共同作用將β-類胡蘿卜素裂解成獨腳金內(nèi)酯，這2個基因缺失或者沉默，均會導(dǎo)致獨腳金內(nèi)酯合成量下降或不能合成[7，10]。列當(dāng)目前在新疆主要農(nóng)業(yè)區(qū)均有分布，已在加工番茄、甜瓜、向日葵等重要經(jīng)濟(jì)作物上造成嚴(yán)重?fù)p失[3，11]。本研究從番茄上克隆CCD7和CCD8基因，并利用獲得的基因，構(gòu)建RNA沉默載體，為獲得抗列當(dāng)?shù)莫毮_金內(nèi)酯合成量減少的植株提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：所用番茄品種為改良毛粉802，將番茄種子用2%的次氯酸鈉消毒后種植于營養(yǎng)土∶蛭石為 1∶1的花盆內(nèi)并置于溫室培養(yǎng)，2 d澆1次水，待長到7～8片真葉后將其從花盆中取出，切取根系并用水沖洗干凈，晾干。根據(jù)TRIzol法提取根部RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

載體：中間載體pUCCRNAi和植物表達(dá)載體p35由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師贈送。

菌株：大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

主要試劑：pMD18-T Vector、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物合成和基因測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 目的基因片段的獲得及驗證

根據(jù)NCBI上已知番茄CCD7和CCD8基因的序列信息，分別設(shè)計了兩個基因部分片段引物（表1）。為了便于載體的構(gòu)建，在擴(kuò)增CCD7目標(biāo)片段的上下游引物上分別引入XbaⅠ和StuⅠ酶切位點，在擴(kuò)增CCD8目標(biāo)片段的上下游引物上分別引入StuⅠ和SalⅠ酶切位點。

以提取的番茄根部cDNA為共同模板，7-F和7-R為引物，擴(kuò)增CCD7基因片段；再以8-F和8-R為引物，擴(kuò)增CCD8基因片段。利用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，割膠回收目的基因片段并連接于pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序驗證。

1.3 目的片段的串聯(lián)

將片段CCD7和CCD8分別克隆到pMD18-T載體上，通過PCR篩選目標(biāo)基因片段，分別記作pMD18-T-7和pMD18-T-8。

用限制性內(nèi)切酶StuⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T-7；再用StuⅠ和SalⅠ切取CCD8片段，用T4連接酶將片段CCD8連入pMD18-T-7中，并將新得到的克隆命名為pMD18-T-7-8。

1.4 反向重復(fù)序列在中間載體pUCCRNAi上的構(gòu)建

1）串聯(lián)片段正向插入pUCCRNAi質(zhì)粒。以pMD18-T-7-8為模板，7-F和8-R為引物，PCR擴(kuò)增串聯(lián)片段CCD7-8。載體pUCCRNAi和pMD18-T-7-8分別用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后，將串聯(lián)片段正向插入到pUCCRNAi中，記作+pRNAi-7-8。

2）串聯(lián)片段反向插入pUCCRNAi質(zhì)粒。因為pUCCRNAi質(zhì)粒上XbaⅠ、SalⅠ與SpeⅠ、XhoⅠ分別為同尾酶，所以載體+pRNAi-7-8用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，直接將串聯(lián)片段CCD7-8連入+pRNAi-7-8中，新得到的載體記作pRNAi-In-7-8。

1.5 沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

用PstⅠ將pRNAi-In-7-8上包含Intron在內(nèi)的反向重復(fù)序列切下，插入用同樣酶切且已去磷酸化的p35植物表達(dá)載體上，篩選轉(zhuǎn)化重組體得到CCD7-8基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體p35-In-7-8。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段的獲得及驗證

以7-F和7-R為引物，獲得的番茄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約400 bp大小的目標(biāo)條帶（圖1A）；以8-F和8-R為引物、番茄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約400 bp大小的目標(biāo)條帶（圖1B），均與預(yù)計結(jié)果接近。PCR產(chǎn)物與pMD-18-T載體連接后，挑選單克隆進(jìn)行測序。將測得的序列登陸NCBI進(jìn)行Blast比對。通過MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。CCD7的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2 A）顯示CCD7與Solanum lycopersicum CCD7 NM_001247504.1在同一個分支上聚為一組，同源性達(dá)到97%；CCD8的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2B）顯示，CCD8與Solanum lycopersicum CCD8 JF831532.1、Solanum lycopersicum CCD8 NM_001279347.2在同一個分支上聚為一組，同源性較高。結(jié)果表明，克隆的CCD7和CCD8序列正確。

2.2 目標(biāo)片段的串聯(lián)

將片段CCD7與T載體連接，轉(zhuǎn)化、挑克隆并搖菌，以7-F和7-R為引物進(jìn)行菌液PCR，得到約400 bp大小的片段，說明片段CCD7已連上T載體，記作pMD18-T-7（圖3A）。

用StuⅠ和SalⅠ雙酶切片段CCD8后，與同樣酶切的pMD18-T-7載體相連，以7-F和8-R為引物，PCR擴(kuò)增串聯(lián)片段CCD7-8，電泳檢測，得到800 bp左右的條帶，記作pMD18-T-7-8（圖3B）。獲得含有CCD7和CCD8 2個基因片段的串聯(lián)基因。

2.3 干涉中間載體的構(gòu)建

2.3.1 串聯(lián)片段正向插入pUCCRNAi質(zhì)粒 采用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ對pMD18-T-7-8質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得大小為800 bp的串聯(lián)基因片段CCD7-8。酶切片段經(jīng)割膠回收后連入同樣酶切開的pUCCRNAi載體，獲得+pRNAi-7-8重組載體。以7-F和8-R為引物，PCR擴(kuò)增，得到約800 bp的目標(biāo)條帶（圖4），表明CCD7-8已連入pUCCRNAi載體。

2.3.2 串聯(lián)片段反向插入pUCCRNAi質(zhì)粒 采用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和XhoⅠ酶切+pRNAi-7-8質(zhì)粒，將串聯(lián)基因CCD7-8連入其中，獲得pRNAi-In-7-8重組載體。采用PstⅠ對重組載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組載體能切下1 700 bp左右的目的基因條帶（圖5）。表明串聯(lián)基因CCD7-8已反向連入+pRNAi-7-8載體，pRNAi-In-7-8中間載體構(gòu)建成功。

2.4 沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶PstⅠ雙酶切pRNAi-In-7-8質(zhì)粒，獲取了包含Intron的In-7-8片段。將酶切后的In-7-8片段回收后定向插入以相同限制性內(nèi)切酶酶切且去磷酸化的植物表達(dá)載體p35上。重組載體用限制性內(nèi)切酶PstⅠ進(jìn)行酶切，可切下大小約1 700 bp的條帶（圖6），表明包含Intron在內(nèi)的串聯(lián)基因CCD7-8已成功連入p35，從而得到具有反向重復(fù)序列的植物表達(dá)載體p35-In-7-8。

3 小結(jié)與討論

獨腳金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）是一類新發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素衍生型植物激素，其在抑制植物分枝、調(diào)節(jié)根生長、葉老化和花的形成方面有重要作用，在刺激列當(dāng)種子萌發(fā)并與寄主植物建立寄生關(guān)系過程中也至關(guān)重要[6，7]。目前已知有多個酶參與獨腳金內(nèi)酯的合成，其中胡蘿卜素裂解雙加氧7（CCD7）和胡蘿卜素裂解雙加氧酶8（CCD8）發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究中克隆獲得的番茄CCD7和CCD8基因經(jīng)BLAST分析后與Solanum lycopersicum的CCD7和CCD8都有很高的同源性。Vogel等[10]將番茄中的CCD7沉默后，番茄上Orobanche ramosa的寄生量減少了90%，但同時番茄分枝量有了明顯的增加；Pasare等[12]將馬鈴薯的CCD8沉默后馬鈴薯表現(xiàn)出側(cè)枝增加，匍匐莖減少。Gomez-Roldan等[13]將豌豆體內(nèi)與獨腳金內(nèi)酯合成密切相關(guān)的CCD8基因被缺失突變后突變體無法有效合成獨腳金內(nèi)酯，列當(dāng)?shù)募纳鷶?shù)量也顯著減少。單個基因的沉默已經(jīng)取得了良好的抗列當(dāng)效果。

反向重復(fù)序列導(dǎo)入植物體是一種高效誘導(dǎo)RNA沉默的方法，其優(yōu)點是在任何遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟的植株中都可進(jìn)行，且產(chǎn)生的RNA沉默高效持久并能在后代穩(wěn)定遺傳[14]。本研究先在一個小型中間載體中構(gòu)建好反向重復(fù)序列后再轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體，并且兩個反向重復(fù)片斷之間有Intron隔開，選用小型中間載體pUCCRNAi構(gòu)建反向重復(fù)拷貝數(shù)高，操作容易。本研究在構(gòu)建RNA沉默載體時所用的pUCCRNAi中間載體中已經(jīng)插入了一段Intron序列，使用十分方便。同時把CCD7和CCD8進(jìn)行串聯(lián)，同時插入到一個載體中，減少了多余的試驗操作，省時省力。

本研究以番茄根部提取的cDAN為模板，克隆CCD7和CCD8基因片段并使其串聯(lián)，插入到中間載體pUCCRNAi中構(gòu)建反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，最后插入到植物表達(dá)載體p35上，成功構(gòu)建含2個基因片段的RNA沉默載體p35-In-7-8，為研究抗列當(dāng)?shù)姆研缕贩N培育提供了技術(shù)支撐。

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