亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析

        2017-03-18 14:57:54劉巧英李夢歌劉雪飛余昊
        湖北農(nóng)業(yè)科學 2016年21期
        關(guān)鍵詞:絲氨酸蛋白酶昆蟲

        劉巧英++李夢歌++劉雪飛++余昊++王運兵

        摘要:采用兼并引物和RACE的技術(shù),在中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)中獲得絲氨酸蛋白酶的全長cDNA序列,將該基因命名為ASJSP,cDNA全長為958 bp,開放閱讀框為885 bp,推測編碼295個氨基酸,預(yù)計分子量為31.20 kDa,等電點pI為9.38,預(yù)測分子式為C1 374H2 222N390O407S15,不穩(wěn)定系數(shù)為31.94,總親水性系數(shù)為0.114,為疏水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。序列分析表明ASJSP與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的核苷酸序列一致性為55.70%。

        關(guān)鍵詞:中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev);絲氨酸蛋白酶;RT-PCR;序列分析

        中圖分類號:S433.3 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)21-5659-05

        DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.056

        Cloning and Sequence Analysis of Serine Proteinase of Adelphocoris suturalis Jakovlev

        LIU Qiao-ying, LI Meng-ge, LIU Xue-fei, YU Hao, WANG Yun-bing

        (School of Resourse and Environment Science,Henan Institute of Science and Techology,Xinxiang 453003,Henan,China)

        Abstract: RT-PCR with degenerate primers and RACE were used to amplify partial cDNA fragments and full cDNA,one serine protease gene from Adelphocoris suturalis Jakovlev was identified, designated ASJSP. The full-length cDNAs of ASJSP is 958 bp,this gene contains 885 bp open-reading frames(ORF) which encodes a putative 295 amino acid protein,with a predicted molecular mass of 31.20 kDa and isoeletric point(pI) of 9.38. Its predicted molecular formula is C1 374H2 222N390O407S15. Bioinformatical analysis showed that it is a instability index is 31.94 and the GRAVY 0.114,suggesting that it is a stable hydrophobic protein. Sequences analysis showed that ASJSP had 55.70% identity with complete serine protease genes from other Miridae insects.

        Key words:Adelphocoris suturalis Jakovlev;serine proteinase;RT-PCR;sequence analysis

        絲氨酸蛋白酶主要消化昆蟲食物中的蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì),并參與合成與降解昆蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì),是大多數(shù)昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)較為重要的消化酶,其主要包含彈性蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等[1-5]。目前,已有一些關(guān)于半翅目盲蝽科昆蟲的絲氨酸蛋白酶方面報道,研究發(fā)現(xiàn)Lygus rugulipennis和Creontiades dilutus等盲蝽科昆蟲唾液中富含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶類[6-9],豆莢盲蝽Lygus Hesperus唾液腺內(nèi)的總蛋白酶活性也以胰蛋白酶活性為主[10-12]。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)美國牧草盲蝽取食后,主要依靠其唾液腺內(nèi)的絲氨酸蛋白酶先進行初步消化,之后其他腸道內(nèi)的蛋白酶進一步消化,吸收蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì),且絲氨酸蛋白酶的活性占其唾液腺內(nèi)總蛋白酶活性的80%。以上研究結(jié)果說明,在半翅目昆蟲消化系統(tǒng)內(nèi)絲氨酸蛋白酶是較重要的消化酶。

        中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)為半翅目盲蝽科昆蟲,是中國一種重要的盲蝽類害蟲,廣泛分布于長江流域和黃河流域[14]。中黑盲蝽的寄主植物種類眾多,已報道有100余種,包括棉花等多種作物[15]。20世紀90年代末,由于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及Bt棉花廣泛種植減少化學農(nóng)藥的使用等原因,中黑盲蝽種群數(shù)量上升、為害加重,成為中國棉花等作物的主要害蟲[16-19]。由于其食性雜、天敵控制作用弱、寄主廣泛及行動敏捷等特點,在作物大面積生產(chǎn)時增加了一定的防控測報難度。雖然,在一些半翅目盲蝽科植食性昆蟲種類上,針對絲氨酸蛋白酶類消化酶已進行了分子生物學方面的研究,如豆莢盲蝽Lygus hesperus及美國牧草盲蝽,但是目前關(guān)于中黑盲蝽的研究國內(nèi)鮮見報道。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù),克隆中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因的cDNA序列ASJSP,并對其進行初步分析,以期為中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶的分子消化機制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        供試蟲源:中黑盲蝽成蟲采自河南省新鄉(xiāng)縣,采回后在實驗室用新鮮四季豆人工飼養(yǎng),室內(nèi)溫度條件(26±0.5) ℃,相對濕度60%~70%,光周期16∶8 h(L∶D)。飼養(yǎng)密度為40~60頭/盒,供試所用昆蟲為羽化后的中黑盲蝽成蟲。

        1.2 試劑和儀器

        主要試劑:RNA提取試劑盒(REeasy Mini Kit)購自QIAGEN公司。cDNA第一鏈合成試劑盒(PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自寶生物工程有限公司。膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)購自O(shè)MEGA公司。Marker Ⅱ、Marker Ⅲ購自TIANGEN公司。DEPC購自上海索萊寶科技有限公司。50×TAE緩沖液購自上海雙螺旋生物科技有限公司。其他所用化學試劑為國產(chǎn)分析純。

        儀器:Neofuge 13R型高速臺式冷凍離心機;Tgradient型梯度PCR儀;JY600C型君儀電泳儀和JY-SP-BT型電泳槽;Tanon3500型Tanon凝膠成像系統(tǒng);SkanIt RE for Multiskan GO 3.2型全波長酶標儀;Eppendorf移液槍;PYX-300Q-A型智能光照培養(yǎng)箱;JJ-CJ-1FD型超凈工作臺。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 中黑盲蝽總RNA的提取 將實驗室飼養(yǎng)的中黑盲蝽成蟲置于1.5 mL預(yù)冷的離心管中,加適量液氮研磨至粉末,按照RNA提取試劑盒(REeasy Mini Kit)的具體方法提取中黑盲蝽總RNA。

        1.3.2 中間片段的獲取 cDNA的第一鏈合成按試劑盒(PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)說明書進行。PCR反應(yīng)體系包括DEPC-treat water 34.75 μL,10×PCR Buffer 5 μL,10 mmol/L dNTPs 4 μL,正向引物2 μL,反向引物2 μL,cDNA 2 μL,Taq酶0.25 μL。PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù):預(yù)變性94 ℃ 3 min;94 ℃變性 30 s,54 ℃退火40 s,72 ℃延伸10 min,34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。正向引物序列:5′-TCGTCCAAGCCGACTCAT-3′。反向引物序列:5′-ACGCAGATAGCAGCACA-3′。

        1.3.3 全長cDNA的獲取 3′端cDNA擴增:反應(yīng)采用3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)推薦的方法進行, 以總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,用引物5′-GCCTCTTCCATCAACTTCAAC-3′與通用引物UAP配對擴增3′端。PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板,用上游引物5′-AGAACTCTGACTGTTTGTCCG-3′與下游引物UAP進行第二次PCR,擴增產(chǎn)物回收、測序。

        5′端cDNA 擴增:按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Version 2.0)推薦方法進行,以總RNA為模板,用引物5′-CAAGGGTGTATCTGTTG-3′,在反轉(zhuǎn)錄酶催化下合成cDNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)S.N.A.P純化后進行TdT 加尾。最后,以加尾產(chǎn)物為模板,用引物5′-GGTGGTGTCAAGTTTC

        TTTGG-3′與通用引物AAP進行5′端擴增。

        1.3.4 PCR產(chǎn)物的回收與序列測定 PCR擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并保存結(jié)果,切割目的條帶按照凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)的方法回收PCR產(chǎn)物,并于-20 ℃保存回收目的產(chǎn)物。最后,將純化后的PCR產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進行測序。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        采用Blast獲得的全長cDNA序列,使用Clustalx1.8 軟件對這些序列進行比對。采用軟件MEGA4.0進行Kimura雙參數(shù)遺傳距離分析,構(gòu)建NJ進化樹,Bootstrap估算重復(fù)1 000次,檢驗分子系統(tǒng)樹各處的置信度。利用TMPRED軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu);采用ExPASy生物信息學資源網(wǎng)站的ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析基本理化性質(zhì)及Protscale工具(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)分析疏水性;使用SignalP工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 總RNA的提取及測序結(jié)果

        通過檢測,提取的中黑盲蝽成蟲RNA的OD260 nm/OD280 nm值為1.926,當OD260 nm/OD280 nm>1.8時,說明樣品純度較高,可以滿足后續(xù)試驗的要求。

        經(jīng)測序,得到中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶cDNA基因,命名為ASJSP,長度為958 bp,推測其開放閱讀框為885 bp,編碼295個氨基酸,以ATG為起始密碼子,以TAG為終止密碼,結(jié)果如圖1所示。

        2.2 序列同源性分析

        由圖2可知,中黑盲蝽ASJSP與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的蛋白序列的一致性為55.70%。ASJSP與Creontiades dilutus(登錄號:AAL15154.1)的一致性為84.41%;與綠盲蝽Apolygus lucorum(登錄號:AFX73399.1)的一致性為32.93%;與其他盲蝽科的絲氨酸蛋白酶蛋白序列的一致性均大于31.64%。

        2.3 不同目絲氨酸蛋白酶的系統(tǒng)發(fā)育樹

        應(yīng)用MEGA4.0軟件Neighbor Joining(NJ)法對包括ASJSP在內(nèi)的10種不同種類昆蟲的絲氨酸蛋白酶進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建(圖3)。結(jié)果顯示,膜翅目、鞘翅目、半翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶較為分化,位于不同的分支上,可能與該目昆蟲食性的不同及繁多的種有一定關(guān)系。中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶ASJSP先與Creontiades dilutus聚在一起,又跟綠盲蝽Apolygus lucorum聚在一起,說明中黑盲蝽與Creontiades dilutus(登錄號:AAL15154.1)進化關(guān)系最近,與綠盲蝽Apolygus lucorum(登錄號:JQ609682.1)進化關(guān)系次之,與其他7種昆蟲的進化關(guān)系較遠。

        2.4 中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基本理化性質(zhì)預(yù)測分析

        通過ExPASy生物信息學資源網(wǎng)站的ProtParam工具推測中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶的基本理化性質(zhì),發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)共包含295個氨基酸,預(yù)測分子式為C1 374H2 222N390O407S15,理論分子量為31.20 kDa,等電點pI為9.38,不穩(wěn)定系數(shù)為31.94,摩爾消光系數(shù)為33 055,總平均親水性系數(shù)為0.114,故推測此蛋白質(zhì)為穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)。使用TMPRED軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其有3個跨膜區(qū),分別位于第1~20,59~76和198~215位,故推測該蛋白質(zhì)為跨膜蛋白質(zhì)。使用SignalP工具對信號肽進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因ASJSP所編碼的蛋白質(zhì)具有信號肽結(jié)構(gòu),該信號肽位于1~20位氨基酸殘基處。

        3 討論

        通過RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了絲氨酸蛋白酶基因的全長cDNA序列ASJSP。通過對比氨基酸序列的同源性,ASJSP與其他盲蝽科昆蟲已知絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的一致性為55.70%,與Creontiades dilutus(登錄號:AAL15154.1)的一致性最高,推測獲得的克隆蛋白序列是絲氨酸蛋白酶家族中的一員。經(jīng)過生物信息學分析,推測中黑盲蝽絲氨酸蛋白酶基因ASJSP所編碼的蛋白質(zhì)是一個疏水蛋白質(zhì),信號肽的切割位點可能是前20位氨基酸。

        研究表明,絲氨酸蛋白酶是昆蟲消化系統(tǒng)中較為重要的蛋白酶。如華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)的絲氨酸蛋白酶HoSP1、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的絲氨酸蛋白酶Ha-TLP及桔小實蠅(Bactroceran)的絲氨酸蛋白酶BdorSer,這些酶在消化系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用[20-22]。綠盲蝽(Apolygus lucorum)取食不同的寄主植物后,其絲氨酸蛋白酶基因AlSP3和AlSP4在不同性別成蟲的體內(nèi)表達量均有明顯差異[23,24]。為深入地探究中黑盲蝽的消化系統(tǒng)中絲氨酸蛋白酶的作用,本研究獲得中黑盲蝽的絲氨酸蛋白酶基因,同時為以后研究中黑盲蝽體內(nèi)的消化代謝提供理論基礎(chǔ)。

        參考文獻:

        [1] RYAN C A. Protease inhibitors in plants:Genes for improving defenses against insects and pathogens[J].Annual Review of Phytopathology,1990,28(1):425-449.

        [2] WOLFSON J L,MURDOCK L L.Diversity in digestive proteinase activity among insects[J].Journal of Chemical Ecology, 1990,16(4):1089-1102.

        [3] JOHNSTON K A,LEE M J,GATEHOUSE J A,et al. The partial purification and characterisation of serine protease activity in midgut of larval Helicoverpa armigera[J].Insect Biochemistry,1991,21(4):389-397.

        [4] CHRISTELLER J T,LAING W A,MARKWICK N P,et al. Midgut protease activities in 12 phytophagous lepidopteran larvae:Dietary and protease inhibitor interactions[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,1992,22(7):735-746.

        [5] COLEBATCH G,COOPER P,EAST P.cDNA cloning of a salivary chymotrypsin-like protease and the identification of six additional cDNAs encoding putative digestive proteases from the green mirid,Creontiades dilutus(Hemiptera:Miridae)[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology,2002,32(9):1065-1075.

        [6] GOODCHILD A J P.A study of the digestive system of the West African cacao capsid bugs (Hemiptera, Miridae)[C].Proc Zool Soc Lond,1952,122:543-572.

        [7] HORI K. Some variations in the activities of salivary amylase and protease of lygus disponsi LINNAVUORI:Hemiptera:Miridae[J].Applied Entomology and Zoology,1970,5(2):51-61.

        [8] COHEN A C. Organization of digestion and preliminary characterization of salivary trypsin-like enzymes in a predaceous heteropteran,Zelus renardii[J].Journal of Insect Physiology,1993, 39(10):823-829.

        [9] COLEBATCH G,EAST P,COOPER P.Preliminary characterisation of digestive proteases of the green mirid,Creontiades dilutus(Hemiptera:Miridae)[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2001,31(4):415-423.

        [10] AGUSTI N,COHEN A C. Lygus hesperus and L. lineolaris (Hemiptera:Miridae),phytophages,zoophages,or omnivores:Evidence of feeding adaptations suggested by the salivary and midgut digestive enzymes[J].Journal of Entomological Science, 2000,35(2):176-186.

        [11] ZENG F,ZHU Y,COHEN A.Partial characterization of trypsin-like protease and molecular cloning of a trypsin-like precursor cDNA in salivary glands of Lygus lineolaris[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2002,131(3):453-463.

        [12] ZENG F,ZHU Y C,COHEN A C.Molecular cloning and partial characterization of a trypsin-like protein in salivary glands of Lygus hesperus(Hemiptera:Miridae)[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2002,32(4):455-464.

        [13] ZHU Y C,ZENG F,OPPERT B. Molecular cloning of trypsin-like cDNAs and comparison of proteinase activities in the salivary glands and gut of the tarnished plant bug Lygus lineolaris(Heteroptera:Miridae)[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2003,33(9):889-899.

        [14] LU Y,WU K,JIANG Y,et al. Mirid bug outbreaks in multiple crops correlated with wide-scale adoption of Bt cotton in China[J]. Science,2010,328(5982):1151-1154.

        [15] 陸宴輝,吳孔明.棉花盲椿象及其防治[M].北京:金盾出版社,2008.

        [16] 吳孔明.我國Bt棉花商業(yè)化的環(huán)境影響與風險管理策略[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2007,15(1):1-4.

        [17] WU K,LI W,F(xiàn)ENG H,et al. Seasonal abundance of the mirids,Lygus lucorum and Adelphocoris spp.(Hemiptera:Miridae) on Bt cotton in northern China[J].Crop Protection,2002, 21(10):997-1002.

        [18] LU Y H,QIU F,F(xiàn)ENG H Q,et al. Species composition and seasonal abundance of pestiferous plant bugs(Hemiptera:Miridae) on Bt cotton in China[J].Crop Protection,2008,27(3):465-472.

        [19] 陸宴輝,梁革梅,吳孔明.棉盲蝽綜合治理研究進展[J].植物保護,2008,33(6):10-15.

        [20] 劉海明,鄭桂玲,李長友,等.華北大黑鰓金龜中腸絲氨酸蛋白酶cDNA克隆,序列分析及表達[J].昆蟲學報,2012,55(2):147-155.

        [21] SUI Y P,WANG J X,ZHAO X F.The impacts of classical insect hormones on the expression profiles of a new digestive trypsin-like protease(TLP) from the cotton bollworm,Helicoverpa armigera[J].Insect Molecular Biology,2009,18(4):443-452.

        [22] 胡黎明,曾 玲,申建梅,等.桔小實蠅絲氨酸蛋白酶基因(BdorSer)的克隆與表達分析[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2012,40(7):70-76.

        [23] 孫 洋,柏立新,張永軍,等.綠盲蝽絲氨酸蛋白酶基因AlSP3 的鑒定及表達譜分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2012,28(5):991-998.

        [24] 孫 洋,柏立新,張永軍,等.綠盲蝽絲氨酸蛋白酶基因AlSP4的克隆及取食不同寄主植物后的表達譜分析[J].昆蟲學報,2012,55(6):641-650.

        猜你喜歡
        絲氨酸蛋白酶昆蟲
        D-絲氨酸與學習記憶關(guān)系的研究進展
        RFID昆蟲閱讀放大鏡
        玩具世界(2022年3期)2022-09-20 01:48:20
        D-絲氨酸在抑郁癥中的作用研究進展
        富硒酵母對長期缺硒和正常大鼠體內(nèi)D-絲氨酸和L-絲氨酸水平的影響
        借昆蟲上課
        甘肅教育(2020年2期)2020-09-11 08:01:48
        思鄉(xiāng)與蛋白酶
        文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
        我最喜歡的昆蟲——知了
        昆蟲的冬天
        多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
        IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價值
        在线a亚洲视频播放在线播放| 97中文字幕一区二区| 美丽的熟妇中文字幕| 亚洲国产精品久久亚洲精品| 久久久久亚洲精品天堂| 久久久久久久99精品国产片| 日本污视频| 国产伦精品一区二区三区四区| 亚洲一区区| 亚洲青青草视频在线播放| 风韵丰满妇啪啪区老老熟女杏吧| 国产女人精品一区二区三区| 亚洲综合中文字幕日韩| 亚洲悠悠色综合中文字幕 | 国产极品视觉盛宴| 久久精品国产亚洲av影院| 免费国产黄网站在线观看可以下载 | 亚洲综合精品一区二区三区| 中文乱码字幕人妻熟女人妻| 亚洲av熟女少妇一区二区三区 | 国产综合无码一区二区辣椒 | 大地资源网更新免费播放视频| 国产aⅴ天堂亚洲国产av| 久久夜色精品国产九色| 人妻久久一区二区三区| 无码av天天av天天爽| 艳妇臀荡乳欲伦69调教视频| 国产办公室沙发系列高清| 特黄a级毛片免费视频| 亚州AV成人无码久久精品| 天堂av在线免费播放| 风间由美中文字幕在线| 青青草狠吊色在线视频| 国产精品极品美女自在线观看免费 | 特级无码毛片免费视频尤物| 中国一 片免费观看| 超碰日韩AV在线| 亚洲最新中文字幕一区| 麻豆国产精品伦理视频| 中国少妇久久一区二区三区| 亚洲欧美乱日韩乱国产|