陳孝權++于星++吳曉剛++肖海軍++劉彬球++徐乙銀++凌登猛++桑守強++梁俊濤

摘要：建立了一種超聲波輔助提取-氣相色譜法測定茶葉中9種有機磷農藥殘留的檢測方法。茶葉磨碎，丙酮-正己烷（體積比為1∶1）超聲波提取，活性炭小柱凈化，丙酮定容，氣相色譜-火焰光度法（GC-FPD）進行檢測，外標法定量。以9種有機磷農藥（敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、樂果、毒死蜱、殺螟硫磷、喹硫磷、三唑磷、水胺硫磷）為分析物，考察并優(yōu)化了色譜條件、提取溶劑、凈化條件和基質效應，確定了最佳試驗條件。在最優(yōu)試驗條件下，回歸方程線性范圍為0.020～0.120 μg/mL，R2>0.99，方法檢出限為0.004 0～0.010 0 mg/kg；9種有機磷農藥殘留混標于0.025、0.040和0.080 μg/mL 3個加標水平的回收率范圍為80.88%～125.46%，相對標準偏差（RSD，n=6）為1.36%～10.75%。該方法準確、穩(wěn)定，可滿足茶葉中9種有機磷農藥殘留的檢測要求。

關鍵詞：超聲波輔助提??；氣相色譜法；茶葉；有機磷農藥殘留

中圖分類號：O657.6；S482 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5623-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.048

Determination of 9 Organophosphorus Pesticide Residues from Tea by Ultrasonic-assisted Extraction and Gas Chromatography

CHEN Xiao-quan， YU Xing， WU Xiao-gang， XIAO Hai-jun， LIU Bin-qiu，

XU Yi-yin， LING Deng-meng， SANG Shou-qiang， LIANG Jun-tao

（Lab of Technology Center， Menghai Tea Industry Co.， Ltd in TAETEA Group， Menghai 666200， Yunnan， China）

Abstract：A gas chromatographic method for the simultaneous determination of 9 organophosphorus pesticides residues in tea was established. Samples were ground，extracted with acetone-hexane（1∶1，V/V），then was cleaned-up with a activated carbon cartridge，dissolved in acetone，analyzed by GC-FPD and quantified by external standard method. With 9 organophosphorus pesticides including dichlorovos，methamidophos，acephate，dimethoate，chlorpyrifos，fenitrothion，quinalphos，triazophos and isocarbophos as analytes，the chromatographic conditions，extraction solvents，purification conditions and matrix effect were investigated and optimized to determine the optimal experimental conditions. Under the optimal experimental conditions，the method showed a good linearity（R2>0.99） in the range of 0.020～0.120 μg/mL，the limit of detections were 0.004 0～0.01 mg/kg. At the spiked levels of 0.025，0.040 and 0.080 μg/mL，the recoveries of 9 analytes were in the range of 80.88%～125.46%，and the relative standard deviations（RSDs，n=6） were 1.36%～10.75%. The method was accurate，stable，and could meet requirements for the detection of 9 organophosphorus pesticides from tea.

Key words：ultrasonic-assisted extraction；gas chromatography（GC）；tea；organophosphorus pesticide residues

茶葉是世界各國人們喜愛的飲品，也是中國主要的出口經濟作物產品之一，其農藥殘留問題一直受到廣泛關注[1]。茶葉種植中，有機磷農藥因可用于防治蟲害而成為最常噴施的農藥種類，其半衰期相對較長[2]，對飲茶者的健康造成潛在危害。茶葉進口囯歐盟、日本等地對進口茶葉中的有機磷農藥殘留制定了苛刻的限量標準，中國相關部門也發(fā)布多個茶葉有機磷農藥殘留限量標準[3，4]。

國內外關于對有機磷農藥殘留的檢測已有大量報道，常用的檢測方法有氣相色譜法[5-7]、氣相色譜質譜聯(lián)用法[8，9]、液相色譜串聯(lián)質譜法[10-13]、固相微萃取-離子遷移率譜法[14]等。茶葉中的有機磷含量較低且茶葉內含物質成分豐富、基質復雜，干擾組分多，現(xiàn)階段多數(shù)實驗室對茶葉中有機磷農藥殘留的檢測較為困難。探索茶葉中有機磷農藥殘留檢測方法具有重大意義。

本研究針對現(xiàn)階段茶葉中有機磷農藥殘留檢測過程中的難點，考察和優(yōu)化了色譜條件、提取溶劑和凈化條件、茶葉基質效應等，探索一種超聲波輔助提取-氣相色譜法測定茶葉中9種有機磷農藥殘留的方法。該檢測方法穩(wěn)定、可靠及簡單實用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 7890A氣相色譜儀（美國，Agilent公司），配火焰光度檢測器（FPD）、Agilent 7863自動進樣器和Agilent色譜工作站（B.04.01）；BSA224S-CW電子分析天平（德國Sartorius公司，精度0.1 mg）；SC-3612低速離心機（中科中佳公司）；GL-88B漩渦混合器（海門其林貝爾公司）；HY-5回旋振蕩器（國華電器有限公司）；SE812型氮吹儀（北京帥恩科技有限公司）；高效粉碎機（上海嘉定糧油儀器有限公司）；臺式超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；超純水系統(tǒng)（成都康寧實驗專用純水設備廠）等。

1.1.2 藥品 敵敵畏（Dichlorovos）、甲胺磷（Methamidophos）、乙酰甲胺磷（Acephate）、樂果（Dimethoate）、毒死蜱（Chlorpyrifos）、殺螟硫磷（Fenitrothion）、水胺硫磷（Isocarbophos）、喹硫磷（Quinalphos）、三唑磷（Triazophos）標準品，購自農業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所；乙酸乙酯、丙酮、正己烷為色譜純，均購自Fisher公司；乙醇、無水硫酸鈉、氯化鈉為分析純，購自天津化學試劑廠；活性炭固相萃取小柱（500 mg/6 mL、1 000 mg/6 mL）、Carbon/NH2固相萃取柱，天津迪馬科技；Florisil固相萃取小柱（1 000 mg/6 mL）、TPT茶葉專用固相萃取小柱，天津博納艾杰爾；0.45 μm有機過濾器。

1.1.3 茶樣 試驗茶樣來自于勐海茶業(yè)有限責任公司。

1.2 色譜條件

色譜柱為DB-17，30 m×0.32 mm×0.25 μm；載氣為氮氣，流量3 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；無分流進樣，1 μL；檢測器溫度250 ℃；燃氣為氫氣，流量75 mL/min；助燃氣為空氣，流量100 mL/min；尾吹氣為氮氣，流量30 mL/min；升溫程序見表1。柱溫箱平衡時間為3 min；后運行250 ℃，后運行10 psi，后運行時間1 min1.3 標準儲備工作液的制備

準確移取9種有機磷農藥標準品0.010 mL（濃度為1 000 μg/mL）或0.100 mL（濃度為100 μg/mL）于棕色標準儲液瓶中，用丙酮定容，配制成濃度為1 μg/mL的農藥標準儲備液，于0～4 ℃避光保存。

根據(jù)各有機磷農藥殘留在氣相色譜FPD檢測器上的響應靈敏度及茶葉中農藥殘留的大致范圍，配制不同濃度范圍的標準工作液，配制混合標準工作原液，通過逐級稀釋配制有機磷農藥標準工作液。

1.4 樣品處理

1.4.1 茶樣制取 按照GB/T 8303，先低溫去除茶葉水分，采用高效粉碎機磨碎，過1 mm孔徑的篩網，制得待測茶葉樣品。

1.4.2 樣品提取 稱取茶葉樣品1.00 g于15 mL的具塞塑料離心管中，加入8 mL丙酮-正己烷（體積比為1∶1），旋緊蓋子充分渦旋混勻，超聲波快速提取20 min，4 500 r/min離心5 min，倒出上清液。用6 mL丙酮-正己烷（體積比為1∶1）重復上述操作，合并上清液，于40 ℃恒溫水浴氮吹至1 mL。

1.4.3 樣品凈化 在活性炭固相萃取柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用5 mL丙酮-正己烷（體積比為1∶1）預洗活性炭固相萃取柱，棄去流出液。將提取液轉移至活性炭固相萃取柱（1 000 mg/6 mL）中，用約2 mL丙酮-正己烷（體積比為1∶1）洗滌，重復1次，并轉移至固相萃取柱中，再用丙酮-正己烷（體積比為1∶1）洗脫固相萃取柱，收集洗脫液至12 mL以上。

1.4.4 濃縮與定容 將凈化洗脫液置于40 ℃恒溫水浴氮吹至近干，用丙酮定容至1 mL，過0.45 μm有機過濾器，供GC-FPD進樣分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

有機磷農藥殘留的檢測采用氣相色譜法，一般情況下檢測分析系統(tǒng)的色譜條件載氣均采用恒流、恒壓模式。針對茶葉中多種有機磷農藥殘留的同時檢測，載氣采用恒流或恒壓模式，會造成部分有機磷農殘殘留的色譜峰較差、嚴重拖尾。通過對檢測分析系統(tǒng)中載氣的控制參數(shù)進行調節(jié)優(yōu)化，階段控壓程序模式可大幅改善有機磷農藥殘留色譜峰的峰型，并提高了檢測靈敏度。階段控壓程序見表葉中有機磷農藥殘留的檢測，常見的定容溶劑有正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮、苯、二氯甲烷、石油醚等，其極性大小依次為乙腈>甲醇>丙酮>乙酸乙酯>二氯甲烷>苯>正己烷>石油醚。有機磷農藥屬于極性農藥，因此定容溶劑需選用極性較大的試劑。通過對丙酮和正己烷進行試驗比較，最終選用丙酮作為定容溶劑，增加了色譜峰的響應強度。同時，丙酮作為茶樣有機磷農藥殘留檢測的提取溶劑之一，選用丙酮作為定容溶劑可有效消除溶劑混雜對有機磷農藥殘留定量檢測的影響。優(yōu)化色譜條件后，獲得9種有機磷農藥標準色譜，見圖1。

2.2 提取溶劑和凈化條件考察

2.2.1 提取溶劑考察 茶葉內含物質豐富，是一種復雜的樣品，在農藥殘留檢測時，提取液的基質復雜且色素較多，針對一類農藥品種的檢測，通常選用一定比例的混合溶劑作為提取劑[14]，極性和非極性的混合溶劑提取樣品，具有更強的穿透效力，提取效果更加完全，從而在保證回收率的前提下減少提取基質干擾物。在茶葉空白樣品中添加0.04 mg/kg的9種有機磷混合標準工作溶液，分別考察了丙酮-正己烷（體積比為1∶1）、乙酸乙酯-正己烷（體積比為1∶1）兩種混合提取溶劑對提取率的影響。結果顯示，除毒死蜱外，其他8種有機磷農藥殘留的回收率基本一致。采用丙酮-正己烷（體積比為1∶1）提取有機磷農藥的同時也將茶樣中的油脂、色素等雜質提取出來，增加了凈化過程的難度，需要使用更大規(guī)格或填料更多的固相萃取小柱。而用乙酸乙酯-正己烷（體積比為1∶1）提取有機磷農藥，相當于在樣品前處理過程中需要增加溶劑交換處理步驟，以減弱溶劑混雜對有機磷定量測定的影響。為了操作簡便，選用丙酮-正己烷（體積比為1∶1）提取有機磷農藥。針對茶葉中毒死蜱農藥殘留因樣品色譜峰與雜質峰不能分離，通過對茶葉加水浸泡過夜后采用氯化鈉、丙酮-正己烷（體積比為1∶1）超聲波提取，收集的有機相經過無水Na2SO4處理后，完全去除水分，確保雜質峰與毒死蜱目標色譜峰完全分離，樣品加標回收率也滿足農殘分析要求（圖2）。

2.2.2 凈化條件考察 比較Florisil固相萃取柱、活性炭固相萃取柱、Carbon/NH2固相萃取柱和TPT茶葉專用萃取柱對樣品提取液凈化效果。結果表明，F(xiàn)lorisil固相萃取柱不能去除色素，凈化后造成儀器分析系統(tǒng)污染；Carbon/NH2固相萃取柱和TPT茶葉專用萃取柱雖能去除色素及雜質，但加標回收率低，準確度不高；而規(guī)格為1 000 mg/6 mL活性炭固相萃取柱能有效去除色素及雜質，也獲得了較好的加標回收率且穩(wěn)定性較好。通過不同洗脫溶劑體積（6、9、12、15、18 mL）對9種樣品加標回收率試驗得出，當洗脫溶劑體積達12 mL后，加標回收率趨于穩(wěn)定，且滿足農殘分析測試要求。洗脫溶劑體積對有機磷農殘回收率的影響見圖3。

2.3 基質效應和方法檢出限分析

基質效應（Matrix effect，ME）是指樣品中檢測目標化合物之外的其他成分對目標化合物儀器響應豐度的影響，基質增強或減弱效應都會影響檢測方法的準確性[15]。氣相色譜法檢測茶葉中有機磷農藥殘留的基質效應，主要來源于色譜分離過程中與目標物性質相似的干擾物質對檢測器FPD的影響，其中干擾物質可分為內源性成分與外源性成分。內源性成分指茶樣在提取過程中被提取溶劑同時提取出的干擾物，如有機酸、酚類、色素、多糖、生物堿等。茶葉提取物中的內源性基質因茶葉種類的不同而有所區(qū)別 [16]。而外源性成分主要指前處理過程引入的干擾物。

為了減弱基質效應對檢測的影響，提高檢測結果的準確性。采用空白基質匹配標準溶液校正方法對基質效應實施補償，設計如下：Ⅰ用丙酮逐級稀釋為濃度0.120、0.090、0.070、0.050、0.020 μg/mL的混標；Ⅱ用空白基質液逐級稀釋為濃度0.120、0.090、0.070、0.050、0.020 μg/mL的混標。進樣分析，以濃度（x，μg/mL）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標建立標準校正工作曲線，見表3。各標準曲線相關系數(shù)（R2）均接近1，相關性良好。以3倍信噪比（RSN）計算方法檢出限（LOD），10倍信噪比（RSN）計算方法定量限（LOQ），計算兩項指標可知該方法可用于檢測。

若基質效應用ME=Ⅱ/Ⅰ×100%計算，式中Ⅱ表示空白基質曲線斜率，Ⅰ標準曲線斜率?？瞻谆|曲線斜率與標準曲線斜率的比值為80%～120%時認為不存在明顯的基質效應?？梢酝茢啵瑱z測方法對茶葉中毒死蜱基質效應顯著，而對其他8種有機磷農藥殘留基質效應不顯著。

2.4 方法的回收率及精密度確定

準確度和精密度可通過加標回收試驗來評價與確定。分別向空白樣中添加低濃度0.025 μg/mL、中濃度0.040 μg/mL、高濃度0.080 μg/mL 3個水平的有機磷農藥混標，進行樣品前處理后進樣檢測。每個添加水平設定6次重復，計算和統(tǒng)計分析樣品加標回收率和精密度結果見表4。從表4可知，加標回收率為80.88%～125.46%，相對標準偏差RSD（n=6）為1.36%～10.75%。

2.5 實際樣品測定

采用試驗方法，檢測來自云南省曬青原料主產區(qū)的85份茶葉樣品和勐海茶廠36份成品茶樣品，結果所有茶樣均未檢出9種有機磷農藥殘留。

3 結論

針對茶葉中有機磷農藥殘留分析的難點，考察色譜條件優(yōu)化、提取溶劑和凈化條件以及茶葉基質效應，建立了一種超聲波輔助提取-氣相色譜法測定方法，用以測定茶葉中9種有機磷農藥殘留，檢測方法有效，可用于茶葉中9種有機磷農藥殘留的定性與定量分析。

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