鄭堅強(qiáng)++田數(shù)++帖金鑫++許春平

摘要：采用響應(yīng)面試驗研究了西方許旺酵母菌（Schwanniomyces occidentalis）及其雙加氧酶在煙草增香中的應(yīng)用情況。結(jié)果表明，西方許旺酵母發(fā)酵煙葉生成香氣物質(zhì)的最優(yōu)條件為溫度27.8 ℃，水分含量52%，發(fā)酵時間7 d，此時煙葉中β-紫羅蘭酮含量為2.03 μg/g。生物轉(zhuǎn)化類胡蘿卜素生成香氣物質(zhì)的雙加氧酶添加量為2.0%，35 ℃條件下，酶解15 h，煙葉中β-紫羅蘭酮含量增加31.5%。處理后的煙葉香氣質(zhì)和香氣量均有所增加，感官質(zhì)量明顯改善。

關(guān)鍵詞：西方許旺酵母菌（Schwanniomyces occidentalis）；雙加氧酶；煙草；增香

中圖分類號：TS41+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5612-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.045

Experiments on Enhancement of the Aroma of Tobacco from Schwanniomyces occidentalis and Dioxygenase

ZHENG Jian-qiang，TIAN Shu，TIE Jin-xin，XU Chun-ping

（School of Food and Bioengineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract：The enhancing the aroma of tobacco from Schwanniomyces occidentalis and dioxygenase were studied by response surface test. The results showed that the optimal conditions of flavor components from fermented tobacco with Schwanniomyces occidentalis after culturing 7 days at 27.8 ℃，moisture content 52%. The content of β-ionone was 2.03 μg/g. In addition of purified dioxygenase 2.0%，at 35 ℃ for 15 h，β-ionone content of tobacco was increased 31.5%. The aroma quality had increased after the fermentation，and the sensory quality of tobacco were improved significantly.

Key words：Schwanniomyces occidentalis；dioxygenase；tobacco；enhancement

煙葉中類胡蘿卜素含量與煙葉品質(zhì)、外觀質(zhì)量密切相關(guān)，是煙草香氣成分的重要前提物質(zhì)。煙葉在成熟、調(diào)制和醇化過程中，95.0%的類胡蘿卜素被降解[1]。類胡蘿卜素在氧化降解時，因雙鍵斷裂位置不同，可產(chǎn)生不同碳原子數(shù)的化合物，進(jìn)一步形成許多重要的香氣物質(zhì)[2]。降解產(chǎn)生的香味物質(zhì)閾值相對較低，刺激性小，香氣質(zhì)較好，對煙葉香氣貢獻(xiàn)率大，如β-大馬酮和巨豆三烯酮，這些化合物都是煙葉香氣中的典型組成部分，是影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分[3]。煙葉中類胡蘿卜素含量與煙葉的香味呈反比，類胡蘿卜素在調(diào)制、陳化過程中不降解或降解不充分，則煙草產(chǎn)生刺激性強(qiáng)的煙味，導(dǎo)致煙葉的香味不足，煙草制品品質(zhì)下降。煙葉類胡蘿卜素的含量與各項評吸總分呈正相關(guān)，在一定的范圍內(nèi)，煙葉中類胡蘿卜含量的增加，有利于評吸結(jié)果的提高[4]。

高質(zhì)量煙葉中類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物的含量也高。繆明明等[5]采用化學(xué)方法降解類胡蘿卜素，對煙草品質(zhì)進(jìn)行研究。在煙葉總揮發(fā)性香氣成分中，含有8%～12%的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物[6]，有利于增加煙葉的香氣質(zhì)量，評吸結(jié)果評分有所提高[7]。類胡蘿卜素化學(xué)降解產(chǎn)物適合烤煙型卷煙加香，能夠增濃煙香、豐滿煙氣以及改善卷煙醇和性[8]。

目前，在國內(nèi)鮮見采用生物技術(shù)的方法降解煙葉中類胡蘿卜素產(chǎn)生香味物質(zhì)，增加卷煙香氣的報道。因此，采用生物技術(shù)的手段在煙葉陳化期間，降解煙葉中的類胡蘿卜素有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究在不改變原來煙葉加工工藝的條件下，僅對局部工序加以調(diào)整來完成煙葉的微生物和酶處理的方法，在煙葉醇化工序中進(jìn)行微生物和酶處理，適當(dāng)改變陳化后期的溫度和煙草中的水分，達(dá)到煙葉發(fā)酵條件，以期提高降解煙葉中類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：西方許旺酵母菌種（Schwanniomyces occidentalis），鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗室分離鑒定菌株。

烤煙品種：紅花大金元，級別B2F；產(chǎn)地為云南玉溪。

1.2 主要試劑和設(shè)備

β-胡蘿卜素（分析純）、β-紫羅蘭酮（分析純）（美國Sigma公司）；無水乙醇、石油醚（60～90 ℃）、丙酮（均為分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

安捷倫6890GC-5973MS型氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國 Agilent公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計（日本島津制作所）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 降解β-胡蘿卜素雙加氧酶的提取 將活化好的菌液按接種量5%接于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在初始pH 7.2，28 ℃和160 r/min條件下發(fā)酵72 h。通過搖瓶發(fā)酵，將粗酶液進(jìn)行硫酸銨梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose離子交換和Sephadax G-100凝膠過濾處理，得到電泳純級別酶。

1.3.2 雙加氧酶酶活的測定 取5 mL酶液（37 ℃水浴中保溫）加入500 μL β-胡蘿卜素儲備液，加入光程1 cm的玻璃比色皿中，以未加β-胡蘿卜素儲備液的粗酶液作對照，立刻在450 nm處測定其吸光度，測完后立即在37 ℃避光水浴，每隔1 min測定1次吸光度。酶活力單位定義：在37 ℃，pH 6.5，每分鐘降解1 μmol β-胡蘿卜素所需的酶量為1個單位。

降解率=

酶活力=（C0-Ct）×（5.0+0.5）/5.0×t

式中，C0為初始β-胡蘿卜素含量（μmol/L），Ct為規(guī)定時間后β-胡蘿卜素含量（μmol/L），t為時間（min）。

1.3.3 GC-MS分析條件 色譜條件：毛細(xì)管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度240 ℃；升溫程序，50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升溫到160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升溫到260 ℃，保持15 min；載氣（He）恒流模式，流量1 mL/min；進(jìn)樣量2 μL，分流進(jìn)樣，分流比25∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度160 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～455 m/z[9]。

1.3.4 煙葉的處理 選擇紅花大金元B2F（2012）將發(fā)酵液均勻噴灑到成品煙絲面上，每100 g煙絲噴加30.0 mL的發(fā)酵液（V/W，109 CUF/mL），通過添加去離子水，控制煙葉水分的含量；酶液按照0.5%～2.0%添加。

添加發(fā)酵液或酶液處理工序：煙葉回潮→噴加發(fā)酵液（酶液）→發(fā)酵（酶催化）→干燥→切絲→卷制→平衡→評吸。

取100 g煙葉在優(yōu)化溫度和水分條件下，把煙葉平鋪在不銹鋼盤子上，厚度3 cm，放在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，避光發(fā)酵或者酶催化處理。

卷制的煙支在相對濕度60%±2%條件下，溫度（22±1） ℃，平衡水分48 h后，進(jìn)行香味成分分析和感官評吸。對照樣品用去離子水代替發(fā)酵液或者酶液，相同條件處理。

1.3.5 微生物降解煙葉中類胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮 通過單因素試驗研究不同的水分含量（35%、40%、45%、50%、55%、60%）、發(fā)酵溫度（26、27、28、29、30、31 ℃）和發(fā)酵時間（4、5、6、7、8、9、10、11 d）條件下，西方許旺酵母菌株降解煙葉增香效果的情況，以β-紫羅蘭酮的含量作為降解類胡蘿卜素的產(chǎn)物評價指標(biāo)，可以間接反映西方許旺酵母酶對煙葉中β-胡蘿卜素的影響。采用響應(yīng)面設(shè)計（表1）確定最佳發(fā)酵條件，并進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗。

1.3.6 雙加氧酶降解煙葉中類胡蘿卜素增香效果分析 研究酶的添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對降解煙葉中類胡蘿卜素而產(chǎn)生增香效果的影響。在25、30、35 ℃下分別加入0.5%、1.0%、2.0%酶液 （V/m，酶濃度1.0 mg/mL），作用不同時間（0、5、10、15、20、25、30 h）后，測定β-紫羅蘭酮的生成量。通過分析比較，確定實(shí)驗室條件下最佳的雙加氧酶作用條件，取3次試驗的平均值。

1.3.7 β-紫羅蘭酮含量的提取 采用同蒸法提取β-紫羅蘭酮。在同時蒸餾萃取裝置的兩端分別加入350 mL蒸餾水和60 mL CH2Cl2，同時蒸餾2 h，以清洗同時蒸餾萃取裝置，保證儀器潔凈。稱取30 g（精確至0.1 mg）煙末樣品放入同時蒸餾萃取裝置一端的1 000 mL圓底燒瓶中，加入適量的氯化鈉和蒸餾水，用控溫電熱套加熱，裝置的另一端是盛有CH2Cl2的100 mL濃縮瓶，水浴加熱，同時蒸餾萃取2.5 h。萃取液濃縮至1 mL，加入濃度為0.600 8 mg/L的乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)。

1.3.8 感官評吸方法 發(fā)酵或酶催化處理后，制卷煙20支，對照濾嘴卷煙20支采用隨機(jī)盲法分配法，分別請10位以上專家進(jìn)行評吸，并根據(jù)評吸結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和評分。判定發(fā)酵或酶催化處理前后，卷煙在評吸品質(zhì)上的改變。卷煙產(chǎn)品的感官質(zhì)量通常包括光澤、香氣、諧調(diào)、雜氣、刺激性和余味。評吸標(biāo)準(zhǔn)為GB 5606.4-2005。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物對煙葉增香的效果

2.1.1 不同發(fā)酵溫度對β-紫羅蘭酮含量的影響 在煙葉中加入30%的菌液，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度，研究不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵液降解煙葉中類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的影響，測定β-紫羅蘭酮含量，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在一定發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，β-紫羅蘭酮含量呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度在28 ℃時，在酶的催化作用下，β-紫羅蘭酮的生成量達(dá)到最大值，當(dāng)溫度高于28 ℃時，β-紫羅蘭酮含量迅速下降。

2.1.2 不同水分含量對β-紫羅蘭酮含量的影響 在煙葉中加入30%的菌液，在28 ℃下調(diào)節(jié)水分含量，研究煙葉中不同水分含量對發(fā)酵液降解煙葉中類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵的水分含量在50%時，β-紫羅蘭酮含量最高。水分含量為35%～50%，β-紫羅蘭酮含量不斷增加，當(dāng)水分含量達(dá)到50%后，由于水分含量的增加，導(dǎo)致酶的活性有所下降，β-紫羅蘭酮含量下降。煙葉中水分增加，導(dǎo)致微生物的活動增加，有利于微生物產(chǎn)酶能力的增加；但由于西方許旺酵母是兼性好氧菌，在生長期間需要氧氣，隨著水分含量的繼續(xù)增加，煙葉表面顆粒呈團(tuán)狀，不利于氧氣的流通，在高水分含量的條件下，空氣流通量減少，導(dǎo)致微生物的繁殖速度減緩甚至停止，酶活下降，β-紫羅蘭酮含量降低。

2.1.3 不同發(fā)酵時間對β-紫羅蘭酮含量的影響 在煙葉中加入30%的菌液，在28 ℃下研究不同發(fā)酵時間對發(fā)酵液降解煙葉中類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在煙葉的發(fā)酵過程中，前6 d生長較為緩慢，菌體在新環(huán)境下適應(yīng)時間較長，第8天β-紫羅蘭酮含量達(dá)到最大值，說明第8天酶活性較高，與生長曲線規(guī)律基本吻合。

2.1.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果 菌株發(fā)酵煙葉條件響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，以β-紫羅蘭酮含量為檢測目標(biāo)，方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，模型顯著，失擬項不顯著，建模成功。模型的決定系數(shù)R2=0.959 0，說明模型能解釋西方許旺酵母菌降解煙葉中類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的響應(yīng)值變化情況。該模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于分析和預(yù)測西方許旺酵母菌降解β-胡蘿卜素的實(shí)際情況。在水平范圍內(nèi)發(fā)酵溫度對類胡蘿卜素降解的影響顯著，菌種重復(fù)穩(wěn)定性試驗結(jié)果較好，說明西方許旺酵母菌穩(wěn)定性和傳代效果較好，不容易變異，對于今后將西方許旺酵母菌運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)和作為出發(fā)菌株的研究具有一定的意義。

對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合：β-紫羅蘭酮含量=2.012-0.023 8×A+0.062 5×B+0.006 25×C+0.01×A×B-0.007 5×A×C-0.005×B×C-0.054 8×A2-0.077 3×B2-0.049 8×C2。

通過Design Expert軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線（圖4、圖5、圖6）。從等高線圖可以直觀反映出2個變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示2個因素交互作用不顯著，而橢圓形表示2個因素交互作用顯著。由圖4、圖5、圖6可知，發(fā)酵溫度和水分含量的交互作用對西方許旺酵母菌株降解煙葉β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮的生成量影響顯著，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間、煙葉水分含量和發(fā)酵時間的交互作用不顯著。

由圖4（a）可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，β-紫羅蘭酮含量先增加后減少，變化幅度不大；隨著水分含量的增加，β-紫羅蘭酮含量先增加后逐漸減少，而且減少的幅度較大。主要是發(fā)酵溫度的升高，使西方許旺酵母菌生長速度加快，迅速達(dá)到細(xì)胞分裂期，達(dá)到對數(shù)生長期，使菌種產(chǎn)酶能力增加。酵母菌屬于兼性好氧菌，適度的水分含量，適量的氧氣含量，對真菌生長有利。水分含量增加，也有利于菌種生長，產(chǎn)酶能力提高；當(dāng)水分含量過高時，煙葉表面顆粒較小，此時培養(yǎng)基質(zhì)過度黏結(jié)，不利于空氣流通，不利于兼性好氧菌菌絲體的生長，水分含量過大，造成培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲體數(shù)量大大減少，導(dǎo)致菌種產(chǎn)酶能力降低。

由圖5可知，在發(fā)酵期間，β-紫羅蘭酮的含量隨著發(fā)酵溫度的變化先增加后減少。

由圖6可知，在所考察范圍內(nèi)，發(fā)酵時間和水分含量對β-紫羅蘭酮的生成量影響不顯著。

由響應(yīng)面曲線可知，響應(yīng)值存在最大值。通過軟件分析計算得出理論最佳優(yōu)化條件：發(fā)酵溫度27.8 ℃，水分含量52%；發(fā)酵時間7 d，此時β-紫羅蘭酮含量為2.03 μg/g。在此發(fā)酵條件下，重復(fù)試驗3次，西方許旺酵母發(fā)酵煙葉生成β-紫羅蘭酮的含量為1.98 μg/g，與預(yù)測值相差0.05 μg/g，說明該方程與實(shí)際情況的擬合性良好，能夠反映發(fā)酵溫度，水分含量和發(fā)酵時間對β-紫羅蘭酮生成量的情況。

2.1.5 降解前后β-紫羅蘭酮含量及煙葉香味成分分析 對發(fā)酵前和發(fā)酵后煙葉中的香味物質(zhì)進(jìn)行提取，并進(jìn)行GC-MS分析，研究香味成分變化情況。經(jīng)GC-MS數(shù)據(jù)分析，發(fā)酵前后主要相關(guān)香味物質(zhì)含量見表4。

從表4可以看出，經(jīng)西方許旺酵母發(fā)酵液處理后的煙葉中，β-紫羅蘭酮含量增加了0.52 μg/g，增幅為35.62%，二氫獼猴桃內(nèi)酯增加了0.17 μg/g，增幅為21.52%。異佛爾酮、β-二氫大馬酮等香味成分含量增加。表明西方許旺酵母菌能夠降解煙葉中的β-類胡蘿卜素生產(chǎn)β-紫羅蘭酮等香味物質(zhì)，同時煙葉中除了β-胡蘿卜素，還有葉黃素、新黃素和紫黃質(zhì)等香味物質(zhì)前體成分。通過化學(xué)氧化方法，葉黃素可降解產(chǎn)生異佛爾酮、巨豆三烯酮等香味成分。葉黃素在含氧氛圍中，C9=C10雙鍵發(fā)生斷裂，可以生成3-羥基-α-紫羅蘭酮（3-hydroxy-α-ionone），經(jīng)氧化還原生成3-氧代-α-紫羅蘭醇（3-oxo-α-ionol），再經(jīng)脫水形成巨豆三烯酮。C6=C7雙鍵發(fā)生斷裂，可生成至關(guān)重要的香味物質(zhì)氧化異佛爾酮[10]。因此，異佛爾酮、巨豆三烯酮含量的增加，可能是由西方許旺酵母生成的雙加氧酶氧化葉黃素產(chǎn)生的。金合歡基丙酮、β-二氫大馬酮和β-大馬酮可能是該酵母菌種產(chǎn)生的雙加氧酶降解其他類胡蘿卜素生成的香味物質(zhì)。

2.2 雙加氧酶對煙葉的增香效果

2.2.1 添加酶液降解煙葉中類胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮 從圖7、圖8和圖9中可以看出，煙葉中β-紫羅蘭酮含量隨著酶作用時間的延長而增加，開始10 h內(nèi)，β-紫羅蘭酮含量快速增加，隨后β-紫羅蘭酮含量增加速度變慢，15 h以后，β-紫羅蘭酮含量變化很小。隨著酶量的增加，煙葉中β-紫羅蘭酮的增加量也快速增加，但是加入過多的酶液會使煙葉中蛋白質(zhì)含量增加，影響煙葉評吸感官質(zhì)量。

溫度對雙加氧酶降解煙葉中類胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮含量也有很大影響，25 ℃時，在煙葉中加入2.0%的酶液反應(yīng)15 h后，β-紫羅蘭酮含量增加了15.7%；30 ℃時，在煙葉中加入2.0%的酶液反應(yīng)15 h后，β-紫羅蘭酮含量增加了28.1%；35 ℃時，在煙葉中加入2%的酶液反應(yīng)15 h后，β-紫羅蘭酮含量增加了31.5%。可見在35 ℃時酶液的降解情況較好，溫度過高還會引起降解產(chǎn)物中香味物質(zhì)揮發(fā)，造成香味成分的改變，所以選用35 ℃作為酶液的作用溫度。

2.2.2 發(fā)酵前后感官評析比較 發(fā)酵煙葉前后評吸結(jié)果見表5。發(fā)酵后，卷煙香氣清雅、尚豐富，稍有刺激性，協(xié)調(diào)性較好，稍有雜氣，余味基本舒適；對照卷煙香氣飽滿、稍粗糙，略有刺激性，基本協(xié)調(diào)，略有雜氣，余味欠舒適。由表5可知，評吸效果的提高，主要是發(fā)酵后的煙葉中β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味成分含量的增加，有利于提升感官評吸效果。發(fā)酵后的卷煙制品香氣量增加，煙氣給人清爽感，并在吸味上減少煙氣的干燥性，提高卷煙吸食品質(zhì)的效果，使煙香變得細(xì)膩柔和，提高卷煙吸食品質(zhì)的效果。

3 小結(jié)

通過響應(yīng)面試驗得到發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和水分含量對β-胡蘿卜素降解生成β-紫羅蘭酮的二次多項回歸方程模型，方差分析說明該方程能夠很好地解釋香味物質(zhì)隨各參數(shù)變化的規(guī)律。最佳優(yōu)化條件為溫度27.8 ℃，水分含量52%，發(fā)酵時間7 d，此時β-紫羅蘭酮含量為2.03 μg/g，結(jié)果穩(wěn)定可靠。表明發(fā)酵后的煙葉香味物質(zhì)含量明顯增加，通過感官評吸試驗證明，發(fā)酵后的煙葉感官質(zhì)量明顯改善。

酶解類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)的適宜條件是雙加氧酶添加量2.0%，35 ℃酶解時間15 h，可增加煙葉中β-紫羅蘭酮31.5%，有效地改善卷煙的香氣質(zhì)量。

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