陳飛++何先元++周卯勤++程鵬++黃英如

摘要：通過研究料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲時(shí)間對筋骨草[Schnabelia tetradonta （Sun） C. Y. Wu et C. Chen]中生物堿得率的影響，優(yōu)選出超聲最佳工藝，并以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)對照測定野生和家種筋骨草生物堿的得率。結(jié)果表明，生物堿的最佳提取工藝為藥材加25倍的60%乙醇溶液（pH=1），50 ℃水浴1 h后超聲30 min，得到野生筋骨草生物堿得率為0.072%，家種筋骨草生物堿得率為0.099%。該提取工藝合理，生物堿得率較高，為筋骨草生物堿的提取提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：筋骨草[Schnabelia tetradonta （Sun） C. Y. Wu et C. Chen]；生物堿；提取工藝；超聲輔助提取

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5591-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.039

Optimization of the Extraction Technology of Alkaloids from Schnabelia tetradonta （Sun） C. Y. Wu et C. Chen by Ultrasound-Assisted Method

CHEN Fei1，HE Xian-yuan1，2，ZHOU Mao-qin2，CHENG Peng1，HUANG Ying-ru1

（1.College of Traditional Chinese Medicine/Experimental Management Center，Chongqing Medical University，Chongqing 401331，China；

2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation，Chongqing 408435，China）

Abstract：The optimal extraction condition with ultrasonic was selected by studying the effect of solid-liquid ratio，ethanol concentration，extracting temperature and ultrasonic time on alkaloids yield of Schnabelia tetradonta（Sun） C. Y. Wu et C. Chen. Calculating alkaloids yield in wild and non-wild Schnabelia tetradonta（Sun） C. Y. Wu et C. Chen by using berberine hydrochloride as the standard control. The results showed the best process condition of alkaloids were adding 25 times amount of 60% ethanol solution（pH=1），1 h of extraction time with water bath and 30 min with ultrasonic at 50 ℃. Alkaloids yield could reached 0.072% in wild Schnabelia tetradonta（Sun） C. Y. Wu et C. Chen and 0.099% in non-wild Schnabelia tetradonta（Sun） C. Y. Wu et C. Chen. The extraction technology is feasible and alkaloids yield is higher，which can provide reference for the extraction of alkaloids from Schnabelia tetradonta （Sun） C. Y. Wu et C. Chen.

Key words：Schnabelia tetradonta （Sun） C. Y. Wu et C. Chen；alkaloids；extraction technology；ultrasonic-assisted extraction

筋骨草[Schnabelia tetradonta （Sun） C. Y. Wu et C. Chen]是唇形科四棱草屬植物，為中國所特有，也是重慶市國家級自然保護(hù)區(qū)金佛山8大特有藥材之一，也稱為四齒四棱草、四棱筋骨草。以全草入藥，具有祛風(fēng)除濕、行血通絡(luò)、清熱解毒和下火的功效[1]。民間還用來燉豬蹄豬腳、泡酒，用于治療風(fēng)濕骨痛、四肢麻木、跌打腫痛、胸脅脹悶、閉經(jīng)等病癥。由于療效顯著，民間應(yīng)用廣泛，野生資源供不應(yīng)求。研究者從筋骨草根部和地上部分的乙醇提取物中分離純化出5個(gè)環(huán)肽化合物和2個(gè)新二萜化合物，并且鑒定了其結(jié)構(gòu)[2-4]。李幫經(jīng)等[5]從筋骨草地上部分水煮提取物中分離得到了11個(gè)化合物。程鵬等[6]對筋骨草的抗運(yùn)動疲勞作用進(jìn)行了對比研究，發(fā)現(xiàn)筋骨草有抗運(yùn)動疲勞的作用。生物堿大多數(shù)具有明顯的生物活性，有抗腫瘤作用和抗菌作用[7-9]，是多種藥用植物的有效成分。但是有關(guān)筋骨草中生物堿等成分的研究報(bào)道較少，因此，本研究采用超聲輔助提取筋骨草中生物堿，并對野生和家種筋骨草生物堿含量進(jìn)行對比，為筋骨草的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

家種筋骨草（生長年限為半年）和野生筋骨草采自重慶市南川區(qū)金佛山自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定為唇形科筋骨草。

1.2 儀器

FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DGG-9240B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海亞榮生化儀器廠）；藥典篩（浙江上虞市五四儀器廠）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用電器有限責(zé)任公司）；UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，200 W）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試劑

鹽酸、無水乙醇、冰醋酸、濃氨水、三氯甲烷[AR，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司]；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（BR，UV≥98%，批號130412，北京德威鈉生物技術(shù)有限公司）；溴甲酚綠（AR，上海試劑三廠）。

1.4 方法

1.4.1 筋骨草中生物堿成分的定性測定 稱取10 g野生筋骨草粉末，加蒸餾水加熱煮沸3次，合并濾液。濾液用70%的乙醇進(jìn)行醇沉，過濾后濃縮成膏狀，浸膏加5%鹽酸溶解后過濾，濾液用于生物堿成分的定性測定。分別用碘化鉍鉀、苦味酸和碘-碘化鉀試驗(yàn)[10]檢驗(yàn)是否含有生物堿。

1.4.2 溶液的配制 對照溶液：精密稱取105 ℃烘干至恒重的鹽酸小檗堿對照8 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇適量，超聲使其溶解，放冷后加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.16 mg/mL的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液。

筋骨草樣品溶液：精密稱取野生筋骨草粉末2 g（過3號藥典篩），置于具塞錐形瓶中，精密加入70%的酸性乙醇[11，12]（pH=1）40 mL，50 ℃水浴1 h后超聲（200 W，40 kHz）提取20 min，抽濾，濾液濃縮至糖漿狀，加入5%鹽酸溶解后用濃氨水調(diào)節(jié)pH為10。用氯仿萃取2次，共50 mL，合并萃取液并用氯仿定容至50 mL棕色容量瓶中，即得到野生筋骨草樣品溶液，備用。

1.4.3 測定方法的建立

1）溶液的顯色：精密量取2 mL筋骨草樣品溶液，依次加入pH為4.0的緩沖液4 mL，溴甲酚綠溶液2 mL，三氯甲烷5 mL，劇烈振搖后用分液漏斗靜置40 min分層，分別取三氯甲烷層溶液進(jìn)行比色。

2）測定波長的選擇：精密量取筋骨草樣品溶液和鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液各2 mL，以70%乙醇溶液做空白，顯色完成后，在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描。以二者共同的最大吸收波長為檢測波長。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分別置于具塞試管中，加無水乙醇補(bǔ)充至1 mL，顯色完成后，用0 mL的試管做空白對照，立即在最大吸收波長下測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)（mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4）筋骨草生物堿得率的計(jì)算：精密吸取筋骨草樣品溶液2 mL，按顯色完成后立即測定吸光度，由回歸方程計(jì)算出供試樣品中生物堿得率。生物堿得率=提取液中生物堿質(zhì)量/筋骨草質(zhì)量×100%。

1.4.4 筋骨草生物堿提取的優(yōu)化 單因素試驗(yàn)：研究不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對筋骨草生物堿得率的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲時(shí)間4個(gè)對筋骨草生物堿提取影響比較顯著的因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表1），研究其對筋骨草生物堿得率的影響，確定最佳提取工藝條件。

1.4.5 多糖提取的方法學(xué)考查

1）驗(yàn)證試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取野生筋骨草粉末3份，每份2 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即測定吸光度，計(jì)算野生筋骨草生物堿平均得率和含量。以相同方法計(jì)算家種筋骨草生物堿平均得率和含量。

2）精密度試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取野生筋骨草粉末2 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即連續(xù)7次測定溶液的吸光度，計(jì)算其RSD值。

3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取野生筋骨草粉末2 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即測定吸光度，之后每隔30 min測一次吸光度，考察4 h內(nèi)生物堿的穩(wěn)定性。家種筋骨草生物堿測定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

鹽酸小檗堿和筋骨草樣品溶液在415 nm處均有最大吸收波長，故選擇415 nm為檢測波長。將不同濃度的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液在最大吸收波長415 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性回歸方程Y=8.093 8x-0.054 2，R2=0.987 5。線性范圍0.016～0.096 mg/mL。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同料液比對筋骨草生物堿得率的影響 如圖1所示，隨著料液比的增大，筋骨草生物堿得率先升高后下降，料液比為1∶25時(shí)，生物堿得率最高。料液比過低，溶劑量太少，導(dǎo)致提取過程中提取物含量過高，不利于未提取出的目標(biāo)成分的擴(kuò)散。但料液比過高不僅造成溶劑浪費(fèi)，提取的雜質(zhì)含量相應(yīng)增加，而且造成后續(xù)生物堿提取液溶劑濃縮工藝?yán)щy加大，影響分離純化效果。因此，確定適宜的料液比為1∶25。

2.2.2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對筋骨草生物堿得率的影響 如圖2所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，筋骨草生物堿的得率增加，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%后，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，生物堿得率反而下降。這是因?yàn)橐掖紝χ参锛?xì)胞的穿透能力較好[13]，因此一定程度上，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高生物堿提取效率增大。但是乙醇體積分?jǐn)?shù)太高，會造成原料浪費(fèi)，增加成本，同時(shí)脂溶性雜質(zhì)相應(yīng)增加。因此，選擇60%乙醇提取較好。

2.2.3 不同提取溫度對筋骨草生物堿得率的影響 試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，隨著提取溫度的升高，筋骨草生物堿得率逐漸增高，但提取溫度超過50 ℃后，生物堿得率下降，可能是隨著提取溫度的升高，細(xì)胞壁溶脹破碎的程度增加，生物堿溶出增加。但提取溫度達(dá)到一定程度后，提取出的脂溶性雜質(zhì)也增多，生物堿類物質(zhì)與雜質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生物堿結(jié)構(gòu)被破壞，生物堿得率有所下降。因此，選擇50 ℃為最佳提取溫度。

2.2.4 不同超聲時(shí)間對筋骨草生物堿得率的影響 由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長，筋骨草生物堿得率增加，但超聲時(shí)間超過40 min后，生物堿得率反而下降，可能是隨著超聲時(shí)間延長，生物堿受熱時(shí)間過長，造成生物堿分解或與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使生物堿得率降低。另外提取時(shí)間延長，所提取的雜質(zhì)含量增加，會加重后續(xù)分離純化工序的工作量。因此，超聲時(shí)間選擇40 min為佳。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對筋骨草中生物堿得率的影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>料液比>提取溫度。生物堿最佳提取工藝組合是A2B2C2D1，即藥材加25倍的60%乙醇溶液（pH=1），50 ℃水浴1 h后超聲30 min，此時(shí)筋骨草的生物堿得率最高，高于其他試驗(yàn)組合的結(jié)果。

2.4 筋骨草生物堿最佳提取工藝的方法學(xué)考查

驗(yàn)證試驗(yàn)：野生筋骨草生物堿得率為0.072%，含量為0.72 mg/g，RSD=0.13%（n=3）。家種筋骨草生物堿得率為0.099%，含量為0.99 mg/g，RSD=0.20%（n=3）。

精密度試驗(yàn)：連續(xù)7次所測吸光度的RSD=0.02%（n=7），說明儀器精密度好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：野生筋骨草吸光度結(jié)果RSD=0.174%（n=9），家種筋骨草的RSD=0.102%（n=9），說明在4 h內(nèi)，野生和家種筋骨草生物堿采用本研究的提取方法和顯色方法都比較穩(wěn)定，尤其以家種筋骨草中生物堿更為穩(wěn)定。

3 小結(jié)

從筋骨草中提取生物堿的最佳工藝條件為藥材加25倍的60%乙醇溶液（pH=1），50 ℃水浴1 h后超聲30 min，此時(shí)筋骨草的生物堿得率最高。野生筋骨草的生物堿得率為0.072%，生物堿含量為0.72 mg/g，家種筋骨草的生物堿得率為0.099%，含量為0.99 mg/g。

本試驗(yàn)采用超聲提取技術(shù)，超聲提取是一種節(jié)能、高效的現(xiàn)代高新技術(shù)，超聲提取利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈的振動作用、空化效應(yīng)和粉碎作用來提高生物堿類物質(zhì)的提取效率。與傳統(tǒng)方法比較，具有提取效率高、時(shí)間短、提取溫度低等優(yōu)點(diǎn)，適合于筋骨草生物堿的提取。此外，該方法提取液雜質(zhì)少，有利于后續(xù)分離純化，且成本低、環(huán)保、操作簡單，是一種良好的提取生物堿的方法[14]。

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