王萬(wàn)賓，陳 瑞，張星梓，胡玉洪，陳異暉

(1.云南省環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境規(guī)劃研究中心，云南 昆明 650034；2.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境土壤科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

不同水化學(xué)特征下銅對(duì)小球藻的急性毒性研究

王萬(wàn)賓1,2，陳 瑞2，張星梓1，胡玉洪1，陳異暉1

(1.云南省環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境規(guī)劃研究中心，云南 昆明 650034；2.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境土壤科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

配制不同單因子Ca、Mg、Na、K、pH、DOC濃度，進(jìn)行銅對(duì)小球藻的48h急性毒性試驗(yàn)，旨在全面考察每個(gè)水質(zhì)指標(biāo)對(duì)其毒性值的影響權(quán)重。結(jié)果顯示，金屬(Ca、Mg、Na、K)在銅對(duì)小球藻的毒性中影響不顯著，并沒(méi)有在銅對(duì)小球藻的毒性效應(yīng)中起到競(jìng)爭(zhēng)作用；pH在5.5～8.0變化導(dǎo)致IC50(半抑制濃度)值有所變化，其存在關(guān)系式：IC50=-3.41*pH+27.18(R2=0.66)；DOC(溶解有機(jī)碳)濃度變化(0～3.65mg/L)對(duì)IC50值的影響最為顯著，IC50值增大62倍，其關(guān)系式為：IC50=30.52*DOC+1.10(R2=0.95)，銅與DOC的絡(luò)合大大降低了銅的生物有效性。

水化學(xué)特征；銅；小球藻；急性毒性

普通小球藻(Chlorellavulgaris)為綠藻門小球藻屬普生性球形單細(xì)胞淡水藻類，在地表水體中廣泛存在。普通小球藻不僅是一種優(yōu)質(zhì)的綠色營(yíng)養(yǎng)源食品[1-3]，其作為能源開(kāi)發(fā)材料應(yīng)用前景也較為廣泛。小球藻處于食物鏈的較低端，起到傳遞一些化學(xué)物質(zhì)或元素的作用。若其受到重金屬污染，那么其更容易在高層動(dòng)植物體內(nèi)累積。銅為自然界中分布廣泛的重金屬，當(dāng)過(guò)量時(shí)將會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，對(duì)水生生物等產(chǎn)生毒性，最終危害到人類的身體健康。在我國(guó)，銅對(duì)淡水環(huán)境及土壤環(huán)境的危害已頻發(fā)，比如采礦業(yè)中含銅酸性廢水造成的魚(yú)蝦死亡事件。另外，銅污染在河口與近岸環(huán)境也時(shí)有發(fā)生[4]。所以，保護(hù)普通小球藻以免受到重金屬銅的侵入至關(guān)重要。不同水環(huán)境中水質(zhì)參數(shù)會(huì)有較大差距，比如DOC、pH、硬度等，而不同的水質(zhì)參數(shù)對(duì)毒性的影響程度也有所不同，所以研究不同水化學(xué)特征下銅對(duì)普通小球藻的毒性具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本研究著重于不同水化學(xué)特征(Ca、Mg、Na、K、pH、DOC)下，銅對(duì)普通小球藻的急性抑制毒性實(shí)驗(yàn)，將為河流及湖泊等不同水化學(xué)特征中的銅的生態(tài)基準(zhǔn)建立及毒性評(píng)價(jià)提供理論支持，也為保護(hù)我國(guó)淡水綠藻的生態(tài)安全提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)材料

普通小球藻(Chlorellavulgaris)購(gòu)買于中科院藻種庫(kù)，在人工氣候箱里(可以控制溫度、光照強(qiáng)度、濕度等)擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)基為BG11(Blue-Green)，此培養(yǎng)基為小球藻培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)媒介。利用生物緩沖液(MOPS)和NaOH調(diào)節(jié)和控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的pH。藻液密度測(cè)試儀器為紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)及血球計(jì)數(shù)板。其中，血球計(jì)數(shù)板采用的為26×15型，在顯微鏡下可清晰進(jìn)行計(jì)數(shù)。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津UV-2600，250～800nm)可通過(guò)吸光度大小(Abs值)定量反映小球藻細(xì)胞濃度的高低。實(shí)驗(yàn)選用CuSO4為毒性物質(zhì)。由于小球藻的毒性試驗(yàn)中銅含量均較低，此時(shí)銅含量測(cè)定方法為原子吸收石墨爐法(日立原子吸收光譜儀Z-2000系列火焰/石墨爐一體機(jī)原子吸收光譜儀，石墨爐法的測(cè)定范圍為0～40μg/L)。DOC采用滇池底泥制備的高純胡敏酸代替[5]，實(shí)驗(yàn)測(cè)定DOC濃度儀器為TOC分析儀(Vario TOC APSA-370,Elementar)。水質(zhì)參數(shù)配置所需的CaCl2、KCl、MgSO4、NaHCO3等均為實(shí)驗(yàn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。48h急性毒性實(shí)驗(yàn)器材為300mL的錐形瓶。

1.2 急性毒性試驗(yàn)條件

為了確定小球藻毒性實(shí)驗(yàn)初始密度，特在吸光度與細(xì)胞密度之間做線性關(guān)系[3,6]，此有利于批量毒性實(shí)驗(yàn)中的小球藻初始密度的確定及測(cè)定。通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)和血球計(jì)數(shù)板可建立吸光度及細(xì)胞濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。關(guān)系建立后只需測(cè)定其吸光度，即可知其細(xì)胞含量，這樣將大大減少實(shí)驗(yàn)的工作量(因?yàn)榇嗽囼?yàn)過(guò)程中樣本量大，均用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)不可行)。48h急性毒性實(shí)驗(yàn)的初始藻密度確定為20000cell/mL左右，此密度位于能影響IC50的小球藻密度(34000cells/ml[7])以下。利用吸光光度值指示小球藻細(xì)胞量的前提是找到合適的波長(zhǎng)[6]。采用了不同濃度梯度的小球藻進(jìn)行450～750nm波長(zhǎng)范圍掃描，可知691.5nm為適合波長(zhǎng)。毒性實(shí)驗(yàn)小球藻0、4、48h生長(zhǎng)情況的測(cè)定均是基于691.5nm的吸光度。毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種，相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和OECD標(biāo)準(zhǔn)。本研究總共進(jìn)行了36組銅對(duì)小球藻的48h時(shí)急性毒性實(shí)驗(yàn)(每組6個(gè)銅濃度水平，銅梯度范圍均覆蓋半抑制生長(zhǎng)的銅濃度值)，分別執(zhí)行不同單因子(Ca、Mg、Na、K、pH、DOC)的變化，旨在定量得出不同水化學(xué)特征下銅對(duì)小球藻的急性毒性效果。36組水質(zhì)參數(shù)列表如表1。

表1 小球藻毒性試驗(yàn)水質(zhì)參數(shù)

注：a)單位為℃，b)單位為mg/L，DIC代表溶解無(wú)機(jī)碳。

1.3 相關(guān)計(jì)算方法

金屬離子(Ca2+、Mg2+、Na+、K+)及H+的濃度計(jì)算均在Biotic Ligand Model Windows Interface,Version 2.2.3的銅形態(tài)分布平臺(tái)下完成[8]。生物配體模型(biotic ligand model)主要分為兩個(gè)部分(有機(jī)配體部分及生物配體部分[9,10])，其能準(zhǔn)確分析不同水化學(xué)特征下各水質(zhì)指標(biāo)的存在形式。IC50(半抑制生長(zhǎng)濃度)的計(jì)算模型為logistic模型[11]：

其中：ɑ=1n(IC50)；s是斜率參數(shù)；x是溶液中溶解銅濃度；y是幸存比例，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Ca、Mg、Na、K濃度下銅對(duì)小球藻的急性毒性試驗(yàn)

目前，不同Ca、Mg、Na、K濃度下銅對(duì)小球藻的毒性影響仍不是太清晰，所以本研究執(zhí)行了單因子變化(Ca、Mg、Na、K)下銅對(duì)小球藻的48h毒性抑制生長(zhǎng)試驗(yàn)，旨在了解不同金屬離子對(duì)銅毒性的影響程度，具體見(jiàn)圖1。

圖1顯示了不同重金屬濃度(Ca、Mg、Na、K)對(duì)IC50(dissloved Cu)的影響，可看出其影響均不顯著(顯著性p值標(biāo)注在圖中，均>0.05)。更為重要的是，在無(wú)溶解有機(jī)質(zhì)參與的偏中性水質(zhì)條件下，可知銅對(duì)小球藻的IC50值均較小，均在1.5～4μg/L。所以在一般地表水中，若溶解有機(jī)質(zhì)(DOC)濃度較低，小球藻對(duì)銅是相當(dāng)敏感的。為了解Ca2+、Mg2+、Na+、K+與Cu2+之間是否存在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)上的競(jìng)爭(zhēng)，作圖2顯示它們之間的關(guān)系(利用生物配體模型的銅形態(tài)分布功能計(jì)算得到)。

由圖2可看出，隨著Ca2+、Mg2+、Na+、K+的變化，IC50(Cu2+)變化不明顯(不顯著，顯著性p>0.5)，表明4種金屬離子與銅離子之間并未存在競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)關(guān)系(或競(jìng)爭(zhēng)力相當(dāng)小)，即4種金屬離子并不參與銅對(duì)小球藻的致毒機(jī)理過(guò)程。Markich et al.[12]也簡(jiǎn)要證實(shí)了硬度(Ca、Mg)對(duì)銅在小球藻的毒性中影響顯著性不大，與本研究結(jié)論一致，由此得出在環(huán)境基準(zhǔn)建立中，硬度校正公式應(yīng)用在小球藻物種上是不恰當(dāng)?shù)摹Ｔ孱惣?xì)胞壁上含有大量的氨基、羧基等(當(dāng)然，小球藻細(xì)胞表面也存在這些基團(tuán))，前人研究結(jié)果顯示離子交換強(qiáng)度大小順序?yàn)椋篊u2+>Zn2+>Mg2+>Na+[13-15]。另外，銅與細(xì)胞表面基團(tuán)主要為共價(jià)鍵結(jié)合，而Mg2+、Na2+等主要為靜電結(jié)合?？傊?，金屬離子和藻細(xì)胞壁的作用力主要表現(xiàn)為：靜電結(jié)合(堿金屬Na、K，堿土金屬Ca、Mg)，配位結(jié)合(過(guò)渡金屬Cu)。Cu與細(xì)胞壁上氨基、羧基結(jié)合表達(dá)式為：

A1g-(NH3)22++Cu2+→[A1g-(NH2)2Cu]2++2H+

A1g-(CO2H)2+Cu2+→[A1g-(CO2)2Cu]+2H+

結(jié)合理論分析可簡(jiǎn)要解釋本研究的結(jié)論：金屬離子(Ca、Mg、Na、K)對(duì)毒性值IC50無(wú)顯著性影響的主要原因?yàn)殂~與小球藻細(xì)胞壁的結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這4種金屬離子。銅對(duì)小球藻的致毒原因可歸納為：Cu進(jìn)入細(xì)胞首先必須與細(xì)胞壁相結(jié)合，然后到達(dá)細(xì)胞膜上，通過(guò)某些蛋白質(zhì)(還有氨基)或離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[16]，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)氧化環(huán)境。輕微的活性氧環(huán)境下細(xì)胞可通過(guò)一些抗氧化劑(脯氨酸、脂質(zhì)過(guò)氧化劑、類胡蘿卜素、超氧化物歧化酶等)的產(chǎn)生而進(jìn)行防御[17-20]，當(dāng)過(guò)量時(shí)，細(xì)胞光合作用、呼吸作用等功能會(huì)受阻，最后影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂。

2.2 不同pH下銅對(duì)小球藻的毒性試驗(yàn)

在保證其余水質(zhì)參數(shù)變化不大的情況下，探討了pH對(duì)銅的IC50的影響，如圖3。

圖3左圖顯示了pH變化對(duì)毒性值IC50的影響，右圖顯示了氫離子與IC50(Cu2+)之間的相關(guān)關(guān)系(由生物配體模型形態(tài)分布得知)，可看出pH在6左右IC50較大，而在6.5～8.0都差不多。在較強(qiáng)酸性條件下[21]，小球藻藻細(xì)胞表面官能團(tuán)(羧基、羥基等)總體來(lái)講主要被氫離子結(jié)合，阻礙了銅離子與藻細(xì)胞的絡(luò)合，最終導(dǎo)致銅絡(luò)合量較少，即毒性值IC50較大。而當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，被結(jié)合的自由銅離子量也隨著增大，最后導(dǎo)致IC50減小。右圖顯示了H+與Cu2+之間仍存在競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)關(guān)系，此與其他研究者結(jié)論一致。De Schamphelaere et al.[22]在不同pH下執(zhí)行了銅對(duì)小球藻等的毒性試驗(yàn)，并同時(shí)檢測(cè)了小球藻的細(xì)胞內(nèi)及表面的銅含量，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)銅含量是更好的預(yù)測(cè)指標(biāo)(pH變化導(dǎo)致毒性值IC50的變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)銅濃度不一)。Wilde et al.著重強(qiáng)調(diào)了pH在銅對(duì)小球藻毒性中的影響，表明H+與Cu2+在細(xì)胞位點(diǎn)存在競(jìng)爭(zhēng)作用[23]。

2.3 不同DOC濃度下銅對(duì)小球藻的急性毒性試驗(yàn)

眾所周知，較金屬濃度及pH影響而言，DOC的影響權(quán)重可能最大。本研究進(jìn)行了DOC濃度范圍約為0～4mg/L下銅對(duì)小球藻的毒性試驗(yàn)，毒性值變化如圖4。

由圖4可知，較pH而言，DOC對(duì)IC50的影響相當(dāng)大。很顯然，銅與DOC之間的絡(luò)合為減少其對(duì)小球藻的毒性提供了一道屏障。當(dāng)DOC存在時(shí)，甚至DOC濃度為1mg/L左右，IC50就上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)。溶解有機(jī)質(zhì)能較強(qiáng)減小銅對(duì)小球藻的毒性，主要是因?yàn)槠鋵?duì)銅的絡(luò)合能力大于小球藻對(duì)銅的絡(luò)合能力，溶解有機(jī)質(zhì)與小球藻之間存在競(jìng)爭(zhēng)銅離子的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致絡(luò)合在小球藻的銅離子量很少。另外一種解釋為：溶解有機(jī)質(zhì)能吸附于小球藻細(xì)胞表面，占了小球藻細(xì)胞表面的部分絡(luò)合位點(diǎn)，這也可能導(dǎo)致小球藻對(duì)銅離子的吸附量減小。Lamelas et al.[24]的試驗(yàn)表明，小球藻的細(xì)胞壁銅形態(tài)分析中，Cu-DOC占有較大一部分。圖5簡(jiǎn)要列出銅、DOC與小球藻細(xì)胞表面的三者作用關(guān)系，此圖較好地闡述了DOC值對(duì)IC50值影響較大的原因。

3 結(jié)論

(1)金屬Ca、Mg、Na、K在銅對(duì)小球藻的毒性中影響作用不顯著，pH為7.4左右及無(wú)DOC參與的情況下，小球藻對(duì)銅非常敏感，IC50值在1.5～4μg/L。

(2)pH變化在銅對(duì)小球藻的毒性中有一定影響作用，其回歸關(guān)系為：IC50=-3.41*pH+27.18(R2=0.66)。這表明銅對(duì)小球藻的毒性過(guò)程中，H+與Cu2+之間發(fā)生一定的競(jìng)爭(zhēng)作用。

(3)DOC在銅對(duì)小球藻的毒性中影響最為顯著，其回歸關(guān)系為：IC50=30.52*DOC+1.10(R2=0.95)。溶解有機(jī)質(zhì)的存在將大大減小銅的生物有效性。

致謝：國(guó)際銅業(yè)協(xié)會(huì)Benny Lu 提供了有益的建議和鼎力的支持，特別感謝。

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The Effect of Hydro-chemical Characteristics on the Toxicity of Copper toChlorellavulgaris

WANG Wan-bin1,2, CHEN Rui2, ZHANG Xin-zi1, HU Yu-hong1, CHEN Yi-hui1

(1. Yunnan Institute of Environmental Science, KunmingYunnan 650034，China)

A series of 48-h copper acute toxicity experiments withChlorellavulgariswere conducted under different concentrations of Ca, Mg, Na, K, H, and DOC in order to comprehensively study the effect of the water quality parameters on IC50(half-inhibitory concentration) values. The results showed that no significant change in the 48h-IC50(expressed as dissolved concentrations) was found when the concentrations of Ca, Mg, Na, and K were varied. But an increase of pH from 5.5 to 8.0 caused the observable changes of dissolved copper toxicity, and it was found that IC50=-3.41*pH+27.18 (R2=0.66). More importantly, an increase of the DOC concentration from 0 to 3.65 mg/L obviously raised dissolved copper toxicity with a factor of 62, and their regression relationship is IC50=30.52*DOC+1.10 (R2=0.95). The metal ions did not play a competitive role in the toxicity of copper toChlorellavulgaris, and complexation of DOC with copper greatly reduced the bioavailability of copper. This study would provide the theoretical support to the calibration of toxicity values or the establishment of ecological water quality criteria on the surface water.

hydro-chemical characteristics; copper;chlorellavulgaris; toxicity

2016-10-12

王萬(wàn)賓(1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)锽LM在地表水中的應(yīng)用。

X13

A

1673-9655(2017)02-0001-06