紀(jì)明開(kāi),陳麗紅,程 波,師 儀,林 旭,林建銀

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，福建 福州 350004；2.福建省腫瘤醫(yī)院病理科，福建 福州 350014；3.福建醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350004)

蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白抗腫瘤血管生成作用及其機(jī)制

紀(jì)明開(kāi)1,3,陳麗紅1,程 波1,師 儀2,林 旭3,林建銀3

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，福建 福州 350004；2.福建省腫瘤醫(yī)院病理科，福建 福州 350014；3.福建醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350004)

目的 研究蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白(recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor，rSVMPI)對(duì)血管生成的影響及其分子機(jī)制。方法 應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)血管生成模型觀察SVMPI重組蛋白對(duì)血管生成的影響；采用Alamar Blue分析方法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)增殖能力、Annexin V-FITC雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、劃痕標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞體外遷移能力、Boyden小室分析方法檢測(cè)細(xì)胞體外趨化能力及管腔形成法檢測(cè)體外血管新生能力；通過(guò)real-time PCR及Western blot檢測(cè)重組蛋白處理后的HUVECs KDR、FGFR-1表達(dá)。結(jié)果 rSVMPI減少雞胚尿囊膜新生血管密度指數(shù)，減弱由VEGF誘導(dǎo)的HUVECs趨化能力，抑制HUVECs體外新生小管的形成，降低HUVECs細(xì)胞KDR和FGFR-1的表達(dá)水平。結(jié)論 rSVMPI可能通過(guò)阻斷VEGF-KDR或bFGF-FGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮抑制血管生成的作用。

蛇毒；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；重組蛋白；表達(dá)純化；血管生成； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，也是腫瘤靶向治療的主要研究領(lǐng)域之一，抑制腫瘤血管生成已被公認(rèn)為一種較為有效的抗癌策略[1]。近年來(lái)許多研究表明，作為基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)抑制物的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)，除了抑制MMP的活性外，還具有抑制血管生成的作用[2]。

蛇毒金屬蛋白酶抑制劑SVMPI是來(lái)自美洲矛頭蝮(Bothrops jararaca)血清的一類(lèi)金屬蛋白酶抑制劑，屬cystatin超家族的胎球蛋白(fetuin)家族成員，具有抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用的潛能。實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-SVMPI，獲得GS115-SVMPI轉(zhuǎn)化子，建立穩(wěn)定的蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白(recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor，rSVMPI)制備工藝，獲得高純度、高活性的rSVMPI。我們前期研究結(jié)果表明，rSVMPI可抑制腫瘤細(xì)胞MMP-2/MMP-9的活性，我們推斷rSVMPI可能具有抑制血管生成的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)室的前期工作亦表明rSVMPI具有抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10 和人肝癌細(xì)胞MHCC97H腫瘤血管生成作用的潛能[3]。為此，本研究應(yīng)用雞胚尿囊膜血管生成模型及分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步觀察和評(píng)價(jià)rSVMPI對(duì)血管生成的影響及其分子機(jī)制，為將rSVMPI開(kāi)發(fā)為抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新藥提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株、細(xì)胞與種蛋 GS115-SVMPI菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)取自健康剖腹產(chǎn)孕婦的臍靜脈。種蛋購(gòu)自福州農(nóng)工商種禽公司。

1.2 試劑與儀器 酵母培養(yǎng)基YNB(yeast nitrogen base )和EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白胨(peptone)購(gòu)自Sigma公司；酵母提取物購(gòu)自Difco公司；Prestained protein ladder(P7709)購(gòu)自New England BioLab公司； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；Ni Sepharose 6 Fast Flow(Cat#:17-0921-07)為GE Healthcare產(chǎn)品；M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶/EDTA、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司； vWF(Cat#: sc-21784)、FGFR-1(Cat#: sc-121)、KDR (Cat#: sc-48161) 一抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品；SP超敏試劑盒、DAB顯色系統(tǒng)購(gòu)自福州邁新公司，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)；大容量搖床(Thermo Electron公司)；大容量冷凍離心機(jī)(Beckman公司)；垂直蛋白電泳儀(Pharmacia Biotech公司)；電穿孔儀(Gene Pulser II BioRad 公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)；熒光分光光度計(jì)[Spectrofluorophotometer, RF-5301(PC)S, Shimadzu corporation, Japan]； AKTATMprime protein purification system(GE通用公司)；Rotor-Gene 3000 real-time PCR system(Corbett Research,UK)；Model 550 酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)。

2 方法

2.1 SVMPI在巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)、純化、鑒定及保存 根據(jù)文獻(xiàn)[4]，將GS115-SVMPI菌接種于含25 mL BMGY培養(yǎng)液的搖瓶中，添加純甲醇誘導(dǎo)，離心，收集上清，加入ProBondTM樹(shù)脂純化柱純化，收集純化蛋白進(jìn)行11%Tris-Tricine電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)印膜(Amersham)，進(jìn)行免疫印跡分析。一抗為鼠抗c-myc單克隆抗體(購(gòu)自Invitrogen公司，以封閉液1 ∶1 000稀釋后使用)，二抗、封閉液、洗液及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)均WesternBreeze Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit(Cat#: WB7105, Invitrogen)組分，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。將上述純化后的重組蛋白進(jìn)行Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析(4%濃縮膠、11%分離膠)，R-250染色過(guò)夜。質(zhì)譜測(cè)定：分離目的蛋白，送復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院測(cè)定。

2.2 rSVMPI對(duì)雞胚尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)血管生成的影響[5]7 d雞胚蛋酒精擦拭消毒后，放37℃培養(yǎng)箱孵育，鈍端(大頭端)氣室向上，呈45°傾斜放置。將胚蛋置檢卵燈下尋找氣室位置，在距胚頭前1 cm，兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位或正對(duì)雞胚的位置，標(biāo)記1.0 cm×1.5 cm的開(kāi)窗位置，75%酒精消毒后，用牙科鉆鉆約1.0～2.0 mm小孔，并穿透氣室殼膜，眼科鑷去除長(zhǎng)方形區(qū)域內(nèi)卵殼及卵殼膜。用1 mL注射器往卵殼膜與尿囊膜交接處血管較少的卵殼膜處輕輕插入并注射100 μL的無(wú)菌PBS(注射時(shí)針頭往上挑，避免刺破下方的尿囊膜)，輕輕晃動(dòng)胚蛋，置于培養(yǎng)箱中幾分鐘后，用眼科鑷輕輕撕掉這層卵殼膜。

選擇定性濾紙，用打孔器制成直徑5 mm的圓片，雙蒸水潤(rùn)濕，濕熱高壓滅菌，烘干備用。將制備好的直徑5 mm定性濾紙圓片置于CAM和卵黃囊膜外2/3血管相對(duì)較少的部位(肉眼觀)，然后用微量進(jìn)樣器向?yàn)V紙分別加入終濃度為100、200、400 mg·L-1的rSVMPI(20 μL)，對(duì)照組加入等量PBS，每個(gè)濃度12個(gè)胚蛋。無(wú)菌透明膠帶封住卵窗，標(biāo)記后，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育72 h。揭去封窗的透明膜，數(shù)碼相機(jī)拍照記錄結(jié)果，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0處理圖像，計(jì)數(shù)測(cè)量區(qū)(以加藥部位為中心，直徑為1 cm的圓)血管數(shù)目，計(jì)算單位面積的血管密度指數(shù)(vascular density index)，并且根據(jù)下列公式計(jì)算血管抑制率(inhibition rate,IR)。

2.3 rSVMPI對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veins endothelial cells, HUVECs)生物學(xué)特性的影響

2.3.1 HUVECs原代培養(yǎng)及鑒定[6]HUVECs來(lái)自健康剖腹產(chǎn)孕婦的臍靜脈。具體方法如下：臍帶剪下后，立即浸泡在4 ℃含雙抗滅菌的PBS溶液中，用含雙抗滅菌PBS溶液沖洗臍靜脈腔至液體變清亮。將37 ℃預(yù)溫的1% Ⅱ型膠原酶約12 mL注入臍靜脈腔，37 ℃孵育15 min。用約4 mL胎牛血清中止膠原酶消化作用后，再用約45 mL含雙抗滅菌的PBS溶液反復(fù)沖洗臍靜脈腔，洗液經(jīng)1 200 r·min-1離心10 min，收集沉淀的HUVECs，懸浮于含20%胎牛血清、20 000 U·L-1青霉素、20 000 U·L-1鏈霉素和0.3 g·L-1谷氨酰胺的M199培養(yǎng)基，接種于0.2%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞融合后，取部分細(xì)胞爬片，用vWF抗體直接免疫標(biāo)記法鑒定HUVECs細(xì)胞。細(xì)胞至80%～90%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的M199常規(guī)傳代培養(yǎng)，取第3～4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 rSVMPI對(duì)HUVECs體外生長(zhǎng)增殖能力的影響 采用改良的AlamarBlue分析方法[7]進(jìn)行檢測(cè)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs用0.25%胰酶消化后，分別懸浮于10% FBS-RPMI 1640和10% FBS-DMEM培養(yǎng)液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將其配制為1×106·L-1濃度的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為(25、50、100、200、400 mg·L-1)的rSVMPI培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別在 24、48、72、96、120 h終止培養(yǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在550 nm、595 nm兩波長(zhǎng)OD值，計(jì)算細(xì)胞還原率，比較3組細(xì)胞增殖情況。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.3.3 rSVMPI對(duì)HUVECs體外凋亡的影響 采用Annexin V-FITC雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rSVMPI誘導(dǎo)HUVECs早期凋亡。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每孔3×105濃度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，待貼壁后，分別加入終濃度為25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI，設(shè)立PBS對(duì)照組，作用24 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌離心2次，順序加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×) 和5 μL Annexin V-FITC，輕輕重懸細(xì)胞，輕輕混勻。室溫(20～25℃)避光孵育10 min。1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.4 rSVMPI對(duì)HUVECs體外趨化能力的影響 根據(jù)文獻(xiàn)采用Boyden小室分析方法[8]進(jìn)行檢測(cè)。Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取-80°C凍存的Matrigel(8.6 g·L-1)與無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)液于冷EP管中以1 ∶3稀釋?zhuān)靹蚝?，?0 μL滴加在小室聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)。取-80℃凍存的Fibronectin(1 g·L-1)與無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液于冷EP管中以1 ∶1稀釋?zhuān)靹蚝?，?0 μL滴加在小室聚碳酸酯膜外側(cè)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，PBS洗滌，重懸于分別含有終濃度為25、50、100、200、400 mg·L-1rSVMPI的1%FBS培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2溫育2 h后，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞加入小室上室，下室加700 μL含10%FBS 及VEGF(終濃度為20 mg· L-1)的細(xì)胞培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，取出小室，棄除上室液體，PBS洗滌，用棉簽擦盡上室膜面未穿膜的細(xì)胞及Matrigel，室溫下結(jié)晶紫染色10 min，PBS小心沖洗，200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取其平均值，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

侵襲抑制率/%=

2.3.5 劃痕標(biāo)記法檢測(cè)HUVECs體外運(yùn)動(dòng)能力 每孔用250 μL的FN(10 mg·L-1)包被24孔培養(yǎng)板，每孔加入250 μL含0.1% BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃孵育1 h。將常規(guī)傳代的細(xì)胞消化洗滌后，以每孔 2×105個(gè)/500 μL的密度接種入包被好的24 孔板，細(xì)胞融合后，換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步化。用移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字型1 mm劃痕，鏡下記錄劃痕區(qū)相對(duì)距離，PBS輕輕洗滌2次以去除細(xì)胞碎片，無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌后，更換含2%血清的培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組分別為含25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察劃痕區(qū)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

2.3.6 rSVMPI對(duì)HUVECs體外血管新生能力的影響 采用管腔形成法[9](tube formation)進(jìn)行檢測(cè)。在96孔培養(yǎng)板中每孔分別加入20 μL Matrigel(5 g·L-1)進(jìn)行包被，置37℃、5%CO2孵育1 h，PBS輕輕沖洗2次，HUVECs細(xì)胞收集后以PBS洗2次，以每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞加到已包被好的96孔培養(yǎng)板，融合30 min后，待細(xì)胞融合后分別加入終濃度為25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI，設(shè)立PBS對(duì)照組。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞12、24、36 h后，分別取出96孔板，顯微鏡下觀察，200倍光鏡下每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野并照相，計(jì)算HUVECs形成的小管樣結(jié)構(gòu)(tubule-like structure, TLS)數(shù)量，采用Image Tools 3.00分析軟件進(jìn)行分析。

2.3.7 rSVMPI對(duì)HUVECs細(xì)胞KDR、FGFR-1表達(dá)的影響

2.3.7.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)分析目的基因表達(dá) rSVMPI(100 mg·L-1)作用于HUVECs細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。TRIzol一步法提取不同濃度處理的各組HUVECs細(xì)胞總RNA，按照常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green法實(shí)時(shí)定量分析各組目的基因mRNA表達(dá)，以GAPDH為管家基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化。各目的基因引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 The primer senquence of real time PCR

2.3.7.2 免疫印跡(Western blot)驗(yàn)證目的基因表達(dá) 不同組別的細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解后離心，并保留上清液，測(cè)定上清液蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品；將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，進(jìn)行Western blot分析，一抗及工作濃度分別是：KDR(1 ∶500)，bFGFR(1 ∶800)，以β-tubulin(1 ∶1 000)作為內(nèi)參照，計(jì)算蛋白表達(dá)的相對(duì)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 SVMPI在pichia pastoris系統(tǒng)中的表達(dá)、純化及鑒定 純化的rSVMPI經(jīng)Tris-Tricine電泳及ImageQuant TLv2003.03軟件分析，純度高達(dá)98.06%，產(chǎn)量為10.15 mg·L-1，分子質(zhì)量約為57.9 ku，考慮所表達(dá)的目的蛋白因?yàn)樘腔?，用EndoH糖苷酶酶切后分子質(zhì)量為38 ku。而通過(guò)Vector NT I軟件計(jì)算分子質(zhì)量約為36.867 2 ku，由于酵母表達(dá)載體含His和c-myc標(biāo)簽(約2.5 ku)，故rSVMPI的分子質(zhì)量應(yīng)為二者相加，測(cè)得實(shí)際分子質(zhì)量為38.754 ku，理論和實(shí)際相符合。采用免疫印跡技術(shù)鑒定GS115-SVMPI表達(dá)上清及純化的重組蛋白，結(jié)果顯示，表達(dá)上清及純化后產(chǎn)物均在57.9 ku處有一明顯的免疫印跡條帶，而GS115-pPICZαA培養(yǎng)上清泳道未出現(xiàn)此條帶，表明表達(dá)產(chǎn)物為rSVMPI。純化后的重組蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，挖膠送質(zhì)譜分析，測(cè)序結(jié)果與理論序列一致，表明經(jīng)過(guò)表達(dá)、分離純化所獲得的產(chǎn)物為rSVMPI，EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit檢測(cè)rSVMPI，選擇有活性的重組蛋白保存在-20℃冰箱，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的材料。

3.2 rSVMPI對(duì)CAM血管生成的影響 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)rSVMPI對(duì)腫瘤血管生成的影響，我們選用CAM模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如Fig 1所示，對(duì)照組CAM血管生長(zhǎng)良好，呈葉脈樣、放射狀分布，結(jié)構(gòu)清晰，主血管粗狀，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。rSVMPI處理組新生毛細(xì)血管生成受到明顯抑制，血管密度降低，管徑變細(xì)，結(jié)構(gòu)被破壞，呈透明或模糊樣結(jié)構(gòu)，顏色變淺，血管分支多處斷開(kāi)，分布零亂，而且產(chǎn)生視覺(jué)可見(jiàn)的無(wú)血管區(qū)域，未見(jiàn)周?chē)艹史派錉畛驗(yàn)V紙生長(zhǎng)的“血管輻輳現(xiàn)象”，也未發(fā)現(xiàn)主干血管向載體彎曲或靠近的“血管吸引現(xiàn)象”；rSVMPI各處理組的血管密度指數(shù)分別為(68.51±5.3)、(56.34±5.8)和(52.56±2.6)，抑制率分別為14.2%、29.4%和34.2%, 呈劑量依賴(lài)性， 與對(duì)照組(79.83±6.2)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 rSVMPI對(duì)HUVECs生物學(xué)功能的影響

3.3.1 HUVECs原代培養(yǎng)及鑒定 分離HUVECs后進(jìn)行原代培養(yǎng)，應(yīng)用形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)來(lái)鑒定，鏡下觀察到培養(yǎng)的原代細(xì)胞呈菱形或多角形，貼壁生長(zhǎng)，匯合成片后呈鋪路石樣排列。體積大，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞排列均勻，偶見(jiàn)雙核。采用消化的第2代細(xì)胞，應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞特異性vWF標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，胞質(zhì)染色呈棕黃色，陽(yáng)性率≥97%，證實(shí)這些細(xì)胞為HUVECs，選擇陽(yáng)性的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Effect of rSVMPI on CAM vasculargenesis(n=12)

A: CAM vasculargenesis. a: control; b: 100 mg·L-1rSVMPI; c: 200 mg·L-1rSVMPI; d: 400 mg·L-1rSVMPI. B: The vascular density index of CAM by rSVMPI treatment.*P<0.05vscontrol

3.3.2 rSVMPI對(duì)HUVECs體外生長(zhǎng)增殖能力的影響 HUVECs分別用25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理不同時(shí)間后，AlamarBlue法測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5種不同濃度的rSVMPI處理后的HUVECs體外生長(zhǎng)速度未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)，表明rSVMPI對(duì)HUVECs細(xì)胞的體外生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

3.3.3 rSVMPI對(duì)HUVECs體外凋亡的影響 HUVECs用25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理24 h后，采用Annexin V-FITC雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs細(xì)胞早期凋亡。結(jié)果顯示，各組經(jīng)rSVMPI作用后見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，但與對(duì)照組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明rSVMPI不能誘導(dǎo)HUVECs凋亡。

3.3.4 rSVMPI對(duì)HUVECs體外遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕后24 h處理組細(xì)胞遷移能力有所減弱，但與對(duì)照組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,n=5)。

3.3.5 rSVMPI對(duì)HUVECs體外趨化能力的影響 應(yīng)用改良的Boyden小室檢測(cè)25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理24 h后，HUVECs穿越重建基底膜的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如Fig 2所示，5種不同濃度的rSVMPI處理后穿越重建基底膜的HUVECs細(xì)胞數(shù)目分別是(40.4±2.7)、(36.8±1.5)、(27.8±1.3)、(23.6±2.3)和(19.7±1.9)，與對(duì)照組(60.8±2.9)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，趨化抑制率分別是33.55%、39.47%、54.28%、61.18%和 67.6%。

Fig 2 Effect of rSVMPI on HUVECs chemotaxis (×200)

A:HUVECs migrated to the bottom face of the membrane. a:control; b:25 mg·L-1rSVMPI;c:50 mg·L-1rSVMPI; d:100 mg·L-1rSVMPI; e:200 mg·L-1rSVMPI; f:400 mg·L-1rSVMPI. B:The number of cell chemotaxis by rSVMPI treatment.**P<0.01vscontrol

3.3.6 rSVMPI對(duì)HUVECs新生小管生成能力的影響 HUVECs用25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理不同時(shí)間后，觀察小管樣結(jié)構(gòu)(TLS) 的形成情況。結(jié)果如Fig 3A所示，在包被Matrigel的培養(yǎng)板中，HUVECs細(xì)胞會(huì)自發(fā)生首尾相連，胞體細(xì)長(zhǎng)，或幾個(gè)胞體環(huán)抱，末端回折形成管樣結(jié)構(gòu)，或幾個(gè)細(xì)胞胞體相互連接形成管樣結(jié)構(gòu)，這種類(lèi)似條索樣管腔形成現(xiàn)象，稱(chēng)為小管樣結(jié)構(gòu)。 HUVECs用5種不同濃度的rSVMPI處理后，分別在12、24、36 h觀察小管樣結(jié)構(gòu)的形成，可見(jiàn)其數(shù)量均明顯減少，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 3B)。

Fig 3 Effect of rSVMPI on TLS of HUVECs

A: TLS of HUVEC after 24 h(×200). a:control; b:25 mg·L-1rSVMPI; c：50 mg·L-1rSVMPI; d：100 mg·L-1rSVMPI; e：200 mg·L-1rSVMPI; f： 400 mg·L-1rSVMPI; B: The number of TLS after 12 h, 24 h, 36 h.*P<0.05vscontrol

3.3.7 rSVMPI對(duì)HUVECs細(xì)胞 KDR、FGFR-1表達(dá)水平的影響 鑒于KDR與FGFR-1所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤血管生成過(guò)程中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡技術(shù)分析rSVMPI對(duì)HUVECs細(xì)胞KDR、FGFR-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果如Fig 4、5所示，rSVMPI處理組中的KDR和FGFR-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是0.605和0.804，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比較，rSVMPI處理組中的KDR和FGFR-1的蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性。這些資料表明rSVMPI可抑制HUVECs細(xì)胞KDR和FGFR-1的表達(dá)。

4 討論

腫瘤血管生成是多因素參與，多步驟的復(fù)雜過(guò)程，主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，管狀結(jié)構(gòu)形成等多個(gè)環(huán)節(jié)。其中最重要的一環(huán)就是血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。原代培養(yǎng)的HUVECs是體外研究血管生成最理想的工具，HUVECs新生小管生成能力已成為判斷血管生成的重要指標(biāo)[9]。本研究結(jié)果表明，5種濃度的rSVMPI均能明顯抑制HUVECs的趨化能力和HUVECs的小管形成能力，而對(duì)HUVECs增殖和凋亡沒(méi)有影響。CAM是高度血管化的、附著于蛋殼內(nèi)面、薄而透明的膜結(jié)構(gòu)，在剔除其他干擾因素情況下，通過(guò)探討藥物對(duì)CAM血管生成的抑制作用，可直接證明藥物的抗血管生成功效。該方法最初由Lewis等于1931年建立，用來(lái)研究胚胎組織移植物發(fā)育的潛能。1975年，F(xiàn)olkman等將CAM法首先應(yīng)用于腫瘤血管生成的研究，具有簡(jiǎn)單、方便、價(jià)格便宜、觀察指標(biāo)明了等優(yōu)勢(shì)，是研究抗血管生成藥物經(jīng)典且理想的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CAM法探討了 rSVMPI 的抗血管生成活性，結(jié)果顯示，隨著rSVMPI劑量的不斷增加，尿囊膜新生毛細(xì)血管也相應(yīng)減少，體內(nèi)抗血管生成方面具有很大的潛力。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，SVMPI基因轉(zhuǎn)染具有抑制B16F10血管生成擬態(tài)的能力[10]。綜上所述，這些資料證明rSVMPI具有較強(qiáng)的抑制腫瘤血管生成作用。

Fig 4 Effect of rSVMPI on expression levels of KDR and FGFR-1 in HUVECs by real-time PCR

A. The amplification plots and dissociation curve of real time PCR. a,b:GAPDH; c,d:KDR; e,f:FGFR-1. B:Relative expression levels of KDR and FGFR-1 in HUVECs by rSVMPI treatment.*P<0.05vscontrol

Fig 5 Immunoblot analysis of KDR and FGFR-1 in HUVECs by rSVMPI treatment

A: Immunoblot analysis of KDR and FGFR-1; B: The ratio of KDR and FGFR-1vsβ-tubulin respectively.*P<0.05vscontrol

rSVMPI抑制腫瘤血管生成的機(jī)制尚不清楚。腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周?chē)h(huán)境共同作用的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞所分泌的VEGF和bFGF是2種重要的血管生成促進(jìn)因子，它們同內(nèi)皮細(xì)胞上的受體KDR和FGFR結(jié)合，激活內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，釋放MMPs，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、降解細(xì)胞外基質(zhì)、侵襲基底膜，最終形成新的血管[11-13]。鑒于KDR與FGFR-1所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤血管生成過(guò)程中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡技術(shù)分析rSVMPI對(duì)HUVECs細(xì)胞KDR、FGFR-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示rSVMPI可明顯降低HUVECs細(xì)胞KDR和FGFR-1的表達(dá)水平。這些資料證明rSVMPI可能通過(guò)阻斷VEGF-KDR或bFGF-FGFR/MMPs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，本研究初步證明rSVMPI可能通過(guò)阻斷VEGF-KDR或bFGF-FGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮抑制血管生成的作用，為將rSVMPI開(kāi)發(fā)為抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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The inhibition effects and mechanism of recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor on tumor angiogenesis

JI Ming-kai1,3,CHEN Li-hong1, CHENG Bo1,SHI Yi2,LIN Xu3, LIN Jian-yin3

(1.DeptofDermatology,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China;2.DeptofMolecularPathology,FujianProvincialTumorHospital,Fuzhou350014,China; 3.ResearchCenterofMolecularMedicine,KeyLaboratoryofEducationforGastrointestinalCancer,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China)

Aim To investigate the effect of recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor (rSVMPI) on neovascularization and its molecular mechanism. Methods Chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay was used to examine the antiangiogenic effect of rSVMPI. Alamar blue analysis was used to detect cell proliferation. Annexin V-FITC double labeling flow cytometry was used to assay cell apoptosis. Scratch marker was used to assay cell migration. Boyden chamber analysis method was used to detect cells chemotaxisinvitro. Tube like structure(TLS) of HUVECs was used to detect the ability of neovascularizationinvitro. Real-time PCR and Western blot were used to assay the expressions of KDR and FGFR-1 in HUVECs. Results The vascular density index (VDI) of CAM was drastically decreased after rSVMPI treatment, chemotaxis of HUVECs in response of VEGF was inhibited in the presence of rSVMPI, TLS of HUVECs was less than control group. The expressions of KDR and FGFR-1 were down-regulated by real-time PCR and Western blot assay. Conclusion rSVMPI may inhibit neovascularization by blocking the VEGF-KDR or bFGF-FGFR signal transduction pathway.

snake venom; matrix metalloproteinase; recombinant protein; expression and purification; neovascularization; signal transduction

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.040.html

2016-10-14,

2016-12-17

福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No 2014-ZQN-JC-17)

紀(jì)明開(kāi)(1974-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)、生物工程，E-mail:mingkai_ji@163.com； 林建銀(1945-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，通訊作者，Tel：0591-83569132，E-mail:jylin@mail.fjmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.020

A

1001-1978(2017)03-0394-07

R-332；R322.123；R329.24；R364.3；R977.6；R996.3