張 軍，谷 翔，黃問(wèn)銀，張普華，于 歡，殷嫦嫦，王麗麗，毛衛(wèi)未

(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部,江西 南昌 330006;2.九江學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,江西 九江 332000；3. 九江學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,江西 九江 332000)

胰高血糖素樣肽-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞自噬的影響

張 軍1，2，谷 翔1，2，黃問(wèn)銀2，張普華2，于 歡3，殷嫦嫦3，王麗麗3，毛衛(wèi)未2

(1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部,江西 南昌 330006;2.九江學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,江西 九江 332000；3. 九江學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,江西 九江 332000)

目的 觀察胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞自噬(Autophagy)的影響，初步探討GLP-1心肌細(xì)胞保護(hù)作用與自噬活性關(guān)系。方法 將傳代培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分4組：① Control組：加入0.9%生理鹽水；② AGEs組：加入100 mg·L-1AGEs；③ AGEs+GLP-1組：同時(shí)加入100 mg·L-1AGEs和10 nmol·L-1GLP-1；④ AGEs+GLP-1+Rapamycin組：同時(shí)加入100 mg·L-1AGEs、10 nmol·L-1GLP-1及5 μmol·L-1Rapamycin(自噬誘導(dǎo)劑)。各組在經(jīng)上述預(yù)處理24 h后，分別用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率Hoechst 33258試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬溶酶體形成，Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ, Beclin-1)表達(dá)。結(jié)果 ① 與Control組相比，AGEs組細(xì)胞生存率明顯減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高，細(xì)胞自噬溶酶體水平及自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ、 Beclin-1)表達(dá)均明顯增加；② 與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組細(xì)胞生存率明顯增高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞自噬溶酶體水平及自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1)表達(dá)均明顯下降；③ 與AGEs組相比，AGEs+GLP-1+rapamycin組中細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，而細(xì)胞生存率、細(xì)胞自噬溶酶體水平及自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ、 Beclin-1)表達(dá)未見(jiàn)差異。結(jié)論 ① AGEs可導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS升高，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷并激活細(xì)胞自噬；② GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與抑制細(xì)胞自噬活性有關(guān)。

胰高血糖素樣肽素-1;糖基化終產(chǎn)物; H9C2心肌細(xì)胞;自噬;活性氧;細(xì)胞保護(hù)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是過(guò)量糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸之間經(jīng)非酶糖基化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，可通過(guò)誘導(dǎo)活性氧(ROS)、細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)等導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡，在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，自噬作為糖尿病心肌病的新穎發(fā)病機(jī)制，在調(diào)節(jié)AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、ROS誘導(dǎo)的糖尿病心肌損傷等方面的作用引起關(guān)注[2-3]，有望成為糖尿病心肌病治療的潛在靶向機(jī)制。

胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是機(jī)體中一種具有“腸促胰素效應(yīng)”的腸源性激素，在發(fā)揮綜合降糖作用外，還可影響糖尿病心肌病的多種發(fā)病機(jī)制，其中包括緩解糖尿病心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡等[4-5]。此外，GLP-1還可通過(guò)抑制自噬保護(hù)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞損傷[6]，通過(guò)減少氧化應(yīng)激改善冠脈血管內(nèi)皮損傷[7]，以及減少急性心肌梗死面積及心梗后心肌重構(gòu)等[8]，這些研究結(jié)果提示GLP-1在糖尿病心肌病中的作用及機(jī)制值得進(jìn)一步探究。本研究通過(guò)觀察GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞ROS及自噬影響，初步探討自噬在GLP-1糖尿病心肌損傷中的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 H9C2大鼠心肌細(xì)胞株由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)惠贈(zèng)。AGEs (121800，Calbiochem公司，美國(guó))，DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(BI公司，以色列)，GLP-1(Sigma公司，美國(guó))，活性氧檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK- 8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))，兔抗老鼠GAPDH(10494-1-AP)多克隆抗體(Peprotech公司，美國(guó))，LC-3B(#3868) 、Beclin1(#3495)(CST公司，美國(guó))，吖啶橙(索萊寶公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于15% 胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞貼壁80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并接種于6孔板中，分別加入0.9%生理鹽水、100 mg·L-1AGEs、100 mg·L-1+10 nmol·L-1GLP-1、100 mg·L-1+10 nmol·L-1GLP-1+5 μmol·L-1rapamycin，并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞成活率 按照CCK- 8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×107·L-1細(xì)胞濃度接種于96孔板中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀(Elx800，BioTek，美國(guó))記錄450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。取4孔光密度(optical density，OD)的平均值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：生存率/%=(OD處理組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst 33258核染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)不同因素處理后,小心棄去培養(yǎng)基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L-1Hoechst 33258試劑，室溫輕搖30 min。在熒光顯微鏡(BX50-FLA,Olympus,Japan)下攝片,染色質(zhì)均勻分布,核被染成均勻藍(lán)色的細(xì)胞認(rèn)為是正常細(xì)胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍(lán)色細(xì)胞認(rèn)為是凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.2.4 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 根據(jù)活性氧試劑盒操作流程，標(biāo)本用10 μmol·L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育20 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，用 Image J 1.410軟件分析4個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)自噬溶酶體水平 收集H9C2 細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗1次，1 000 r·min-1離心5 min后，加入已配制好的等體積吖啶橙(Acridine orange,AO)染色液，冰上染色10～15 min，樣品在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞自噬溶酶體水平(激發(fā)光488 nm)。

1.2.6 Western blot測(cè)定自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 收集H9C2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，RIPA全細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每孔蛋白上樣量30 μg在0.1聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳70 V，電泳15～20 min，待指示劑到濃縮膠與分離膠交界處后，改為120 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)完全到凝膠底部停止電泳。置于電轉(zhuǎn)液中，在250 mA恒定電流下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h，LC3B、Beclin1一抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色。用ECL 檢測(cè)液發(fā)光顯影定影后，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 GLP-1減少AGEs誘導(dǎo) H9C2心肌細(xì)胞損傷

2.1.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 在倒置顯微鏡下，各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為：Control組細(xì)胞呈梭形，排列規(guī)整，大小均一，胞核、胞質(zhì)境界清楚；AGEs組細(xì)胞大小不規(guī)則，一些胞體變圓、皺縮，胞核增大，胞質(zhì)有空泡出現(xiàn)；AGEs+GLP-1組細(xì)胞大小較為均一，形態(tài)趨向正常，細(xì)胞皺縮變形和胞質(zhì)空泡化減少；與AGEs+GLP-1組相比，AGEs+GLP-1+rapamycin組細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷較為嚴(yán)重(Fig 1)。

Fig 1 Cellular morphology observation(×400)

A：Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin

2.1.2 各組細(xì)胞生存率檢測(cè)結(jié)果 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，與Control組相比，AGEs 組細(xì)胞生存率明顯減低(70.16±1.98vs93.37±3.66，P<0.01)；AGEs+GLP-1組較AGEs組明顯提高細(xì)胞生存率(80.66±1.78vs70.16±1.98，P<0.05)。見(jiàn)Tab 1。

GroupCellviability%ofcontrol(x±sdeviations)Normalcontrol93.37±3.73100mg·L-1AGEs70.16±1.98##100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP-180.66±1.78*100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP-1+5μmol·L-1rapamy-cin71.58±3.36

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group.

2.1.3 各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果 Hoechst 33258核染色檢測(cè)結(jié)果顯示,與Control比較，100 mg·L-1AGEs處理H9C2心肌細(xì)胞24 h能使H9C2細(xì)胞凋亡率明顯增加；與100 mg·L-1AGEs組損傷相比100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP+5 μmol·L-1Rapamycin與100 mg·L-1AGEs組對(duì)比，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)Fig 2。

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs group.

2.2 GLP-1降低AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)物 運(yùn)用熒光探針DCFH-DA對(duì)各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行標(biāo)記，用Image J 1.410軟件分析熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示(Fig 3)，AGEs組熒光強(qiáng)度明顯高于Control組(P<0.01)；與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.05)；以上結(jié)果提示，AGEs可導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS升高，GLP-1干預(yù)后可明顯降低AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)物。

Fig 3 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.##P<0.0 1vscontrol;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group.

2.3 GLP-1抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞自噬

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬溶酶體水平結(jié)果 A為正常Control組；B為AGEs組；C為AGEs+GLP-1組，D為AGEs+GLP-1+Rapamycin組。運(yùn)用吖啶橙(Acridine orange, AO)對(duì)細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡細(xì)胞器(包括自噬溶酶體)進(jìn)行染色標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)AO熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示(Fig 4)，AGEs組平均熒光強(qiáng)度明顯高于Control組(3 302.03±9.84vs162.05±3.20，P<0.01)；在經(jīng)GLP-1干預(yù)后顯示，AGEs+GLP-1組平均熒光強(qiáng)度較AGEs組明顯減低(2 756.67±3.84vs3 302.03±9.84，P<0.05)；用Rapamycin進(jìn)一步干預(yù)后，AGEs+GLP-1+Rapamycin組平均熒光強(qiáng)度與AGEs組差異無(wú)顯著性(3 206±8.80vs3 302.03±9.84，P>0.05)。上述結(jié)果提示，GLP-1可明顯減少細(xì)胞自噬溶酶體水平，Rapamycin干預(yù)后可削弱GLP-1對(duì)細(xì)胞自噬溶酶體作用效果。

Fig 4 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.

2.3.2 Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果 運(yùn)用免疫印跡方法分別檢測(cè)50、100、200 mg·L-1濃度AGEs對(duì)H9C2心肌細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)影響。結(jié)果顯示，隨著AGEs濃度升高，LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)逐步增強(qiáng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用100 mg·L-1AGEs作為最適宜自噬激活濃度。與Control組相比，AGEs組中LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，表明AGEs可明顯激活自噬，該結(jié)果與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果基本一致；在經(jīng)GLP-1干預(yù)后，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)均明顯降低(AGEs+GLP-1組vsAGEs組，P<0.05)(Fig 5)，提示GLP-1可能具有抑制自噬作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證GLP-1通過(guò)抑制細(xì)胞自噬產(chǎn)生心肌損傷保護(hù)作用，本研究運(yùn)用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin對(duì)GLP-1作用進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，rapamycin可明顯削弱GLP-1對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(AGEs+GLP-1+Rapamycin組vsAGEs組，P>0.05)。因此，結(jié)合rapamycin對(duì)細(xì)胞損傷和細(xì)胞內(nèi)ROS影響(Fig 1、Tab 1、Fig 2、Fig 3)，本結(jié)果提示，GLP-1可通過(guò)抑制自噬保護(hù)AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷。

Fig 5 Effect of GLP-1 on the autophagy LC3BⅡ,

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsAGEs group

3 討論

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM )是一種由多重致病機(jī)制共同參與的心肌疾病，其中，AGEs在DCM發(fā)病進(jìn)程中的作用尤為關(guān)鍵[9-10]。AGEs可通過(guò)兩種途徑參與DCM致病過(guò)程：① 直接導(dǎo)致膠原蛋白分子交聯(lián)，抑制膠原蛋白降解，進(jìn)而增加心肌間質(zhì)纖維化；② 與其受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)ROS形成、炎性反應(yīng)，進(jìn)而激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[1,11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，AGEs還可通過(guò)與RAGE結(jié)合，抑制PI3K/AKT/mTOR途徑從而激活自噬引起心肌細(xì)胞損傷[12]。因此，自噬在AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用值得深入探討。

GLP-1是由腸道L型細(xì)胞分泌的一種腸促胰島素(incretin)，通過(guò)促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖、胰島素分泌，抑制胰島細(xì)胞凋亡、胰高血糖素分泌，發(fā)揮綜合降血糖的生物學(xué)功效。在內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞等研究中發(fā)現(xiàn)，GLP-1還可通過(guò)降低RAGE表達(dá)、減少ROS形成或抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用[13-15]。 最近研究也證實(shí)，AGEs可誘導(dǎo)RAGE受體表達(dá)，而GLP-1可抑制RAGE表達(dá)及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高心肌細(xì)胞存活率[16-17]。上述研究結(jié)果表明，GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制，可能與減少ROS形成、降低RAGE表達(dá)及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，AGEs可明顯誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷，主要表現(xiàn)為：與Control組相比，AGEs組出現(xiàn)胞體變形、胞核增大、胞質(zhì)見(jiàn)空泡等細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷；細(xì)胞生存率檢測(cè)結(jié)果也顯現(xiàn)較低水平。結(jié)合ROS檢測(cè)結(jié)果分析，AGEs 組中細(xì)胞內(nèi)ROS升高可能與AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有關(guān)，且其損傷程度隨AGEs濃度升高而增加。在經(jīng)GLP-1干預(yù)后顯示，GLP-1可明顯降低由AGE誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS形成，并有效改善細(xì)胞損傷。以上結(jié)果表明，GLP-1可能通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)ROS形成而發(fā)揮抗AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷作用。

AGEs是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高的重要原因之一[18]，ROS異常升高除直接通過(guò)氧化反應(yīng)造成細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)損傷外，還可作為信號(hào)分子激活細(xì)胞內(nèi)多種應(yīng)激敏感信號(hào)通路，包括自噬信號(hào)通路。研究表明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS升高可通過(guò)多種分子信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，而自噬激活后也可通過(guò)線粒體自噬、分子伴侶自噬(CMA)等途徑來(lái)降低ROS水平[19]。目前認(rèn)為，ROS與自噬之間這種負(fù)向反饋機(jī)制一般發(fā)生在ROS輕微升高情況下，是機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的一種代償調(diào)節(jié)機(jī)制；而當(dāng)ROS過(guò)多增高時(shí)，自噬會(huì)被過(guò)度激活，ROS與自噬之間將形成正向反饋調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入自噬型細(xì)胞死亡[20-22]。從本研究結(jié)果分析，AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、ROS升高及自噬活性上調(diào)，在經(jīng)GLP-1干預(yù)后出現(xiàn)明顯緩解或下降，推測(cè)GLP-1可能通過(guò)減少ROS形成，將ROS與自噬之間正向反饋關(guān)系轉(zhuǎn)變成負(fù)向反饋，從而減少由正向反饋帶來(lái)的不良后果。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證GLP-1心肌保護(hù)作用與自噬活性關(guān)系，本研究運(yùn)用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin干預(yù)發(fā)現(xiàn)，rapamycin在不影響ROS水平情況下，可明顯削弱GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用，并有效地干擾了GLP-1對(duì)自噬溶酶體形成及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響。上述結(jié)果提示，在AGEs環(huán)境下，GLP-1心肌保護(hù)作用與自噬抑制存在一定關(guān)聯(lián)，其保護(hù)機(jī)制除了涉及ROS介導(dǎo)的自噬外，可能還存在其他自噬調(diào)節(jié)途徑。因此，從本研究結(jié)果分析，GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能部分通過(guò)抑制ROS介導(dǎo)的自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。本實(shí)驗(yàn)主要參與人谷翔、殷嫦嫦、李衛(wèi)東老師給予課題設(shè)計(jì)及修改；黃問(wèn)銀、王麗麗老師給予實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)；張普華、管高鵬、陳文杰同學(xué)給予具體實(shí)驗(yàn)上的幫助。)

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The protective effect of glucogon like peptide-1 on H9C2 cardimyocytes against AGEs-induced injury by inhibiting excessive autophagy

ZHANG Jun1，2,GU Xiang1,HUANG Wen-yin1,ZHANG Pu-hua1,YU Huan3,YIN Chang-chang3,WANG Li-li3,MAO Wei-wei1

(1.DeptofCardiology,AffiliatedHospitalofJiujiangUniversity,JiujangJiangxi332000,China; 2.MedicineGraduateSchool,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;3.BasicMedicalCollegeofJiujangUniversity,JiujangJiangxi332000,China)

Aim To investigate the effect of glucogon like peptide-1 on H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced injury and potential protective mechanisms of autophagy.Methods Cultured H9C2 cardiomyocytes were respectively incubated with 0.9% NaCl,100 mg·L-1AGEs,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1+5 μmol·L-1rapamycinfor 24 h. Intracellular ROS production was measured by DCFH-DA fluorescent probe.Cell viability was quantified by CCK-8 assay. Nucleus morphology was observed under fluorescence microscope after being incubated with Honchest 33258.The formations of autolysosomes were detected by flow cytometry using the PH-sensitive fluorescent dye acridine orange(OA). Western blot was applied to assess the expression of autophagy-associated protein including LC3Ⅱ, Beclin-1.Results AGEs impaired cell viability, increased intracellular ROS production, enhanced formation of autolysosomes and up-regulated expression of LC3Ⅱand Beclin-1; however, the effect were reversed remarkably by GLP-1. Furthermore, effect of GLP-1 was inhibited by rapamycin(autophagy agonist) in cell viability, amount of autolysosomes, and expression of autophagy-associated protein but not in intracellular ROS production.Conclusion GLP-1 may protect H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced injury partly by inhibiting excessive autophagy.

GLP-1;AGEs;H9C2 cardiomyocytes;Autophagy;ROS;myocardial preservation

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.024.html

2016-10-24,

2016-12-05

國(guó)家自然科學(xué)(地區(qū))基金項(xiàng)目(No 81660152);江西省教育廳科技項(xiàng)目(No GJJ09350)

張 軍(1989-)，男，碩士，醫(yī)師，研究方向：糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制，E-mail：15079265586@163.com； 谷 翔(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病心肌病、心肌缺血/再灌注的發(fā)病機(jī)制,通訊作者,E-mail：eagle0094@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.012

A

1001-1978(2017)03-0348-06

R329.24；R329.25；R329.411；R587.2；R977.6