陳春艷，謝映平，周西貝，王 旭，王 云

(山西大學生命科學學院，太原030006)

三株球孢白僵菌對栗實象甲幼蟲的感染和致病力研究

陳春艷，謝映平*，周西貝，王 旭，王 云

(山西大學生命科學學院，太原030006)

為了明確球孢白僵菌Beauveriabassiana3菌株TST05、FDB01、 SYN01對栗實象甲老熟幼蟲的感染、致死率、致死中時、以及胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶的活性與毒力的關系，本研究采用3個菌株的孢子懸浮液(1.0×108孢子/mL)，浸蟲法感染栗實象甲幼蟲，統(tǒng)計連續(xù)8 d的校正死亡率；以栗實象甲幼蟲的蟲體作為菌株的唯一碳源制備液體培養(yǎng)基，測定培養(yǎng)過程中各菌株的脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、類枯草桿菌蛋白酶(Pr1酶)連續(xù)8 d的酶活性變化。結(jié)果表明，球孢白僵菌3個菌株TST05、FDB01、SYN01感染栗實象甲幼蟲后，1-4 d內(nèi)表現(xiàn)出染病和死亡的癥狀，連續(xù)8 d累積校正死亡率分別為40%、44.4%、62.22%，菌株SYN01對栗實象甲的致死率最高，與其他兩菌株的差異顯著；菌株TST05、FDB01、SYN01的Pr1酶活性最大峰值分別為(175.56±0.7)U/mL、(172.74±2.32)U/mL、(195.71±5.41)U/mL。幾丁質(zhì)酶活性最大峰值分別為(12.58±0.58)U/mL、(13.06±1.16)U/mL、(15.12±0.32)U/mL。都是菌株SYN01的酶活性最大，而TST05和FDB01之間差異不顯著；球孢白僵菌3 個菌株的Pr1酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶在8 d內(nèi)的酶活性平均值與染菌幼蟲8 d累積校正死亡率的線性回歸方程分別為y=0.4641x+122.45(R2=0.8854)、y=0.034x+10.473(R2=0.9328)、y=0.0354x+2.4586(R2=0.1201)，說明菌株的Pr1酶和幾丁質(zhì)酶活性與幼蟲死亡率之間呈顯著的線性相關，而菌株的脂肪酶活性與菌株對幼蟲的致死率不具有線性關系。綜合分析，菌株SYN01可以作為生物防治栗實象甲的病原菌種；Pr1酶與幾丁質(zhì)酶的活性可作為菌株的毒力因子。

板栗；栗實象甲；球孢白僵菌；毒力；胞外酶

板栗CastaneamollissimaBlume原產(chǎn)我國，栽培歷史悠久，2015年我國板栗總面積達到180萬ha,年產(chǎn)量195萬t,占世界板栗總產(chǎn)量的84%。板栗作為重要的生態(tài)經(jīng)濟林樹種，分布于全國26個省(區(qū)、市)，在山區(qū)脫貧致富和出口貿(mào)易中具有重要作用。但是板栗果實受栗實象甲CurculiodavidiFairmaire(屬鞘翅目Coleoptera，象甲科Curculionidae)的危害十分嚴重(魏敏宣和劉瑞江，2014)。栗實象甲在我國主要的板栗種植區(qū)均有發(fā)生，每年約有20%-45%的板栗果實受害，嚴重地區(qū)可達80%以上，造成經(jīng)濟損失巨大(袁少杰等，2010；李春野和孔凡濤，2012；黃莉?qū)帲?014)。

栗實象甲在我國大部分地區(qū)兩年一代。成蟲在板栗的嫩葉、新芽、幼果上取食，交配后產(chǎn)卵，卵產(chǎn)于板栗果實內(nèi)，待幼蟲孵化后，在板栗果實內(nèi)蛀食。蛀食后的板栗果實內(nèi)部蛀空，充滿蟲糞，無法食用，失去商品價值(遇文婧等，2015)。由于栗實象甲幼蟲鉆蛀在果實內(nèi)危害，防治十分困難。目前，國內(nèi)外針對栗實象甲為害所采取的防治措施主要包括林業(yè)防治、人工防治、化學防治(屈頂柱等，2009；Speranzaetal.，2010)。其中林業(yè)防治和人工防治的措施具有費時、費力、見效慢等缺點?；瘜W防治的樹冠噴藥對蛀入果實內(nèi)的幼蟲和入土的老熟幼蟲起不到防治效果，在山區(qū)不易操作并造成污染。最近幾年，國外試驗利用線蟲、白僵菌、綠僵菌作為致病因子對栗實象甲進行生物防治，有一定的效果(Kepenekcietal.，2004；Iharaetal.，2009)。我國目前有利用粉擬青霉菌防治栗實象甲取得一定的效果(孫紹芳等，2004)。

前期在山西省昔陽縣的觀察發(fā)現(xiàn)，栗實象甲幼蟲脫果后，隱藏在林冠下土壤內(nèi)約20 cm深的土層中，滯育時間長達8個月，才能化蛹，羽化為成蟲出土，這為利用昆蟲病原真菌作為生物制劑在土壤中進行生物防治提供了可能。因此，本文選擇本實驗室擁有的球孢白僵菌3個菌株SYN01、TST05、FDB01作為材料，研究了這3個菌株對栗實象甲的毒力，及與菌種的胞外酶(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶)活性的關系，為生物防治提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 栗實象甲

本研究以山西省晉中市昔陽縣洪川村的板栗林為試驗園，觀察和采集栗實象甲。該地為山區(qū)環(huán)境，板栗面積133 ha，主要種植品種為大板紅，屬于多年生結(jié)果大樹。連續(xù)多年栗實象甲發(fā)生嚴重，果實受害率40%。根據(jù)生物學特性的觀察，在板栗收獲前期，于2015年9月下旬在試驗園采回板栗蟲果300 kg，帶回實驗室。

在實驗室解剖蟲果，鏡檢觀察栗實象甲幼蟲在果實內(nèi)的蟲口密度和取食情況。統(tǒng)計板栗果實上的蟲孔數(shù)量、果內(nèi)幼蟲數(shù)量、幼蟲在果內(nèi)鉆蛀形成的孔和坑道、排泄的蟲糞、以及幼蟲的體長等幾項指標，分析幼蟲在果內(nèi)危害的時間長短和發(fā)育進度。并觀察栗實象甲幼蟲的自然脫果情況，收集脫果的老熟幼蟲，置于一定濕度的土中，作為染菌試驗的幼蟲材料。

1.2 菌種

試驗用的菌種材料是本實驗室保存的3個球孢白僵菌菌株SYN01、TST05、FDB0，其中TST05菌株是本實驗室2009年從山西省襄汾縣桃小食心蟲CarposinaniponensisWalsingham越冬幼蟲的自然染病蟲體上分離獲得，該菌株已保藏于北京中國科學院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4526。FDB01菌株是本實驗室2001年從東北吉林省伊通縣紅松林帕克阿扁松葉蜂Acantholydaparki幼蟲染病蟲體上分離獲得。SYN01菌株，購買于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC3.4428，原寄主為松毛蟲DendrolimuskikuchiiMatsumura。

孢子懸浮液的制備：用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL)制備平板，接種后置于人工氣候箱中(溫度25℃±1℃、相對濕度70%±10%、光照周期L ∶D=14 ∶10)培養(yǎng)8 d，然后將孢子刮于含有0.1% Tween-80的無菌水中，配置成濃度為1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液。孢子濃度用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

1.3 菌株對栗實象甲幼蟲的感染及致死率測定

從收集到的栗實象甲老熟幼蟲中挑選出形態(tài)大小相似的健康幼蟲，進行染菌試驗，每組30頭，設定 3重復。采用浸蟲法將幼蟲分別在菌株的孢子懸浮液(1.0×108孢子/mL)中浸濕 2 s，放于濾紙上，將多余的液體吸干。置于人工氣候箱進行培養(yǎng)(溫度25℃±1℃、相對濕度70%±10%、光照周期L ∶D=14 ∶10)，每天觀察幼蟲發(fā)病情況，并記錄拍照死亡情況，計算校正死亡率和致死中時。

1.4 菌株3種胞外酶活性的測定

1.4.1 專用培養(yǎng)基的制備

為了考察球孢白僵菌3菌株在感染栗實象幼蟲過程中，菌種分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶的活性，試驗中制備了以栗實象甲幼蟲的蟲體作為培養(yǎng)球孢白僵菌唯一碳源的專用培養(yǎng)基。具體方法：將收集到的栗實象甲幼蟲反復沖洗后，在80℃的烘箱中烘干至恒重，將烘干的蟲體研磨成粉末，保存。準確稱取0.1 g蟲體粉末，加入到30 mL基本培養(yǎng)液中(基本培養(yǎng)液組成：每1000 mL 蒸餾水水中含有1.5 g KH2PO4，0.6 g MgSO4，0.5 g KCL，1 mg FeSO4·7H2O，1 mg ZnSO4·7H2O)，于高壓滅菌鍋(LDZX-75KB)中121℃滅菌30 min，制備成以栗實象甲蟲體作為球孢白僵菌唯一碳源的專用培養(yǎng)基。

1.4.2 粗酶液的提取

3菌株分別進行。 取3 mL 濃度為1.0×108孢子/mL孢子懸浮液接種到上述液體培養(yǎng)基中，每菌株設3個重復。置于25℃，125 r/min低溫搖床(MAXQ5000)中培養(yǎng)，每24 h取1 mL的培養(yǎng)液于1.5 mL的EP管，連取8 d， 4℃ 12000 g/min的冷凍離心機中離心20 min (Eppendorf-5804R)，取上清液即為粗酶液，準確標號，-80℃超低溫冰箱(DW-HL668)中保存。

1.4.3 類枯草桿菌蛋白酶(Pr1酶)活性的測定

參照St Leger等(1987)的方法并略作改動：吸取30 μL粗酶液，30 μL底物(1.5×10-3mol/L 以Sul-Ala-Ala-pro-phe-PNA為反應底物)，30 μL Tris-HCL(0.05 mol/L PH 8.0)分別加入到1.5 mL EP管中，標號，充分混勻?？瞻讓φ眨簩⑸鲜龅孜镉?0 μL二甲基亞砜代替。28℃水浴鍋反應20 min，加入110 μL預冷的冰乙酸終止反應。吸出200 μL加入酶標板中，于多功能酶標儀(型號M5)410 nm處測定OD值。以硝基苯胺含量標準曲線計算酶活。每個酶活單位定義為每分鐘催化分解(Sul-Ala- Ala-pro-phe-PNA)生成1 μg硝基苯胺的酶量。

1.4.4 幾丁質(zhì)酶活性測定

參照曹廣春(2007)的方法略做改動。依次將制備好的0.1 mL膠體幾丁質(zhì)，0.1 mL酶液加入1.5 mL EP管中，標號，充分混勻。37℃水浴鍋中加熱4 h。用離心機8000 r/min離心5 min，取出上清液，往里加入20 μL四硼酸鉀溶液，充分混勻，沸水浴加熱5 min，自來水冷卻至室溫，加入300 μL 10%二甲氨基苯甲醛試劑，37℃水浴鍋中保溫20 min，自來水冷卻至室溫。依次吸出200 μL 加入酶標板中，于多功能酶標儀585 nm處測定OD值。以N-乙酰氨基葡萄糖含量標準曲線計算酶活性。每個酶活性單位定義為每分鐘催化分解幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量。

1.4.5 脂肪酶活性測定

參照Silva等(2005)的方法。將制備好的200 μL的基質(zhì)液(由A液與B液組成，A液為10 mL 含有30 mg對硝基棕擱酸的異丙醇；B液為90 mL 0.05 mol/L Tris-HCL緩沖液(PH=8.0)，含有100 mg阿拉伯膠和207 mg脫氧膽酸鈉)加入到1.5 mL EP管中，37℃水浴鍋中預熱10 min，加入20 μL的酶液，充分混勻，37℃水浴鍋中加熱20 min，加入300 μL三氯乙酸(0.05 mol/L)，混勻，室溫反應5 min終止反應，加入320 μL NaOH(0.05 mol/L)；對照組先加入三氯乙酸再加入酶液。吸取200 μL反應液加到酶標板中，410 nm處測OD值。以對硝基苯酚含量標準曲線計算酶活。每個活性單位定義為每分鐘催化分解脂肪生成1 μg硝基苯酚酶量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用 IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗結(jié)果采用單一變量方差分析(ANOVA)，Duncan法對不同數(shù)據(jù)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 栗實象甲在板栗果實內(nèi)為害的3個階段

2015年9月20日將采集的有栗實象甲鉆蛀的板栗蟲果(圖1A)帶回實驗室，在室內(nèi)經(jīng)過一個月的解剖和觀察。結(jié)果顯示，山西省晉中市昔陽縣洪川村的板栗蟲果率達到40%，單個果實內(nèi)象甲幼蟲平均數(shù)量6.8頭，多為3-5頭，最多可達14頭。蟲口口徑一般以2.5 mm為主。栗實象甲在板栗內(nèi)的蟲體大小和為害可劃分為3個階段，即為害初期、中期、末期。為害初期(圖1B)的特點是，幼蟲還處于剛孵化后不久，蟲體小，透明，可隱約看到，伴隨一些白色粉末狀的蟲糞顆粒。為害中期(圖1C)，幼蟲發(fā)育較大，體長8.5-12 mm，乳白色，無足，呈鐮刀形彎曲，頭部為黃褐色，口器黑褐色。一顆板栗果實內(nèi)有1到數(shù)頭幼蟲蛀食的隧道，隧道分布在果實的表面，直徑約3 mm，充滿白色蟲糞。為害末期(圖1D)，幼蟲發(fā)育到老熟階段，開始咬破板栗果殼，陸續(xù)脫果入土。此時果肉已經(jīng)被幼蟲取食，果實內(nèi)充滿顆粒狀蟲糞，果殼外表有幼蟲鉆出時留下的蟲孔(圖1E)。

圖1 受害板栗與栗實象甲幼蟲Fig.1 The infested Castanea mollissima and Curculio davidi larvae注：A, 板栗果實；f, 蟲果; B, 危害初期； 顯示l, 幼蟲; c, 糞道; C, 危害中期； c,坑道和蟲糞; D, 危害末期，板栗蟲果徹底失去價值; E, 老熟幼蟲鉆出果實后留下的蟲孔； wh,蟲孔; F, 收集到的老熟幼蟲。Note：A, C.mollissima fruit； f, the fruit infested by the Curculio davidi; B, the fruit in the early damage； l, larva; c, coprodaeum; C, fruit damaged in the medium term； showing c, coprodaeum; D, the damaged fruit without value; E, damaged fruit with holes caused by the C.davidi emerge； wh, wormhole; F, the mature larvae.

在9月20日剛采集回來的板栗蟲果中，栗實象甲的幼蟲和為害大部分還處于初期階段，少數(shù)處于中期和后期，經(jīng)過5 d時間，處于為害初期的幼蟲比例占60%-70%，處于中期的幼蟲占20%-30%，有個別的幼蟲老熟，開始脫果。25 d后，約80%-85%幼蟲發(fā)育為為第3階段，出現(xiàn)大量老熟幼蟲脫果，還有約10%-15%的幼蟲處于為害中期。大約一個月時間，絕大部分幼蟲完成脫果和入土，此時收集老熟幼蟲(圖1F)，進行后續(xù)染菌試驗。

2.2 染菌后栗實象甲幼蟲的外觀癥狀

用3個菌株TST05、SYN01、FDB01(孢子懸浮液濃度：1×108孢子/mL)對栗實象甲老熟幼蟲進行染菌試驗，連續(xù)觀察幼蟲的感染癥狀。結(jié)果顯示，從第2天開始，染菌幼蟲體表光澤度減弱，活動力下降，蟲體表面相繼出現(xiàn)不同程度的褐色斑塊(如圖2B、2F、2J)；從第3天開始，蟲體顏色加深，個別幼蟲開始死亡(如圖2C、2G、2K)；從第4天開始，幼蟲相繼死亡，蟲體表面也相繼被覆白色的菌絲(如圖2D、2H、2L)。

圖2 栗實象甲幼蟲染菌后的癥狀Fig. 2 The symptoms of the diseased larvae of Curculio davidi infected with the three strains注：A-D, 幼蟲被TST05菌株感染后的第1-4天的外觀癥狀; E-H,幼蟲被SYN01菌株感染后的第1-4天的外觀癥狀;I-L, 幼蟲被FDB01菌株感染后的第1-4 天的外觀癥狀。Note: A-D, infected larvae with the strain of TST05 appeared symptoms in 1-4 d; E-H, infected larvae with the strain of SYN01 appeared symptoms in 1-4 d; I-L, infected larvae with the strain of FDB01 appeared symptoms in 1-4 d.

2.3 菌株對栗實象甲的致死效果

染菌后經(jīng)過連續(xù)8 d觀察并統(tǒng)計死亡率，結(jié)果顯示，3個菌株SYN01、FDB01、TST05的 1×108孢子/mL孢子懸浮液對栗實象甲幼蟲的感染均表現(xiàn)出較高致死率(圖3)。在1-3 d時，感染菌株TST05、FDB01和SYN01的幼蟲累計校正死亡率分別是5.55%、5.55%、10.00%； 第3-6天，3個菌株對幼蟲的的校正致死率分別為18%、31.11%、52.22%；第6-8天，3個菌株對幼蟲的累積校正死亡率分別為40%、44.4%、62.22%；由此可見，菌株SYN01對幼蟲的累計致死率在第3天就高于另外兩個菌株，第3天后其致死率急劇上升，在第6天就達到50%以上，一直到第8天，其致死率都顯著高于另外兩個菌株。菌株TST05與FDB01對幼蟲的致死率在前4 d都相近，4 d之后對幼蟲的致死率開始明顯增加，一直到第8天都處于快速增長階段，其中，菌株FDB01對幼蟲的致死率在第5-8天期間都明顯高于TST05。通過計算3個菌株TST05、FDB01和SYN01對幼蟲的致死中時，分別為11.6 d 、8.77 d、6.22 d(表1)。說明菌株SYN01對幼蟲的累積致死率最高，致死速度最快，菌株FDB01次之，TST05的致死率最低，致死速度也最慢，它們之間具有差異顯著性(P< 0.05)。

表1 3個菌株對栗實象甲幼蟲的校正死亡率回歸分析與致死中時

圖3 3個菌株對栗實象甲幼蟲校正死亡率Fig.3 The corrected lethallty rate of Curculio davidi larvae by the three strains

2.4 菌株胞外酶的活性及其與毒力的相關性

2.4.1 3菌株Pr1酶的活性與毒力的相關性

3個菌株TST05、FDB01、 SYN01分別以栗實象甲幼蟲的蟲體作為唯一碳源的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，逐日測定各菌株的類枯草桿菌蛋白酶的酶活變化。結(jié)果顯示(圖4)，菌株TST05、FDB01、 SYN01的蛋白酶活性在前6 d都呈現(xiàn)波動性上升趨勢，到第6天出現(xiàn)最大峰值，分別為(175.56±0.7)U/mL、(172.74±2.32)U/mL、(195.71±5.41)U/mL。從酶活性的最大值與平均值看，菌株TST05與菌株FDB01的Pr1酶活性差異不顯著(P>0.05)，而菌株SYN01的Pr1酶活性最大值則明顯高于與其他兩株菌(P< 0.05)。用菌株的Pr1酶活性平均值與栗實象甲幼蟲染菌后連續(xù)8 d的累積死亡率之間作回歸分析，得到回歸方程式y(tǒng)=0.4641x+122.45 (R2=0.8854)，說明菌株類枯草桿菌蛋白酶的活性與幼蟲染菌死亡率之間的線性相關性顯著。

圖4 3個菌株在栗實象甲蟲體培養(yǎng)基上的Pr1酶活性Fig.4 Pr1 activity of three strains cultured on the baked dry larvae media of Curculio davidi larvae

2.4.2 3菌株幾丁質(zhì)酶的活性與毒力的相關性

同樣，以栗實象甲幼蟲的蟲體作為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)3個菌株，測定各菌株幾丁質(zhì)酶的活性變化。 結(jié)果所示(圖5)，菌株TST05與菌株FDB01的幾丁質(zhì)酶活性在第1天就具有較高值，分別為(12.58±0.58)U/mL和(13.06±1.16)U/mL，菌株TST05在1-4 d呈下降趨勢，4-8 d呈波浪式變動。菌株FDB01在第2-4天呈現(xiàn)低活性，4-7 d期間呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢。從酶活性最大值和平均值看，菌株FDB01與菌株TST05的差異不顯著(P> 0.05)；而菌株SYN01酶活性在第3天出現(xiàn)最大值(15.12±0.32)U/mL，并顯著高于另外兩個菌株(P< 0.05)。通過3個菌株幾丁質(zhì)酶活性平均值與栗實象甲幼蟲染菌后連續(xù)8 d 累計校正死亡率之間作線性回歸分析，得到回歸方程式為y=0.034x+10.473(R2=0.9328)，說明菌株幾丁質(zhì)酶活性與幼蟲染菌死亡率之間的線性相關性極顯著。

圖5 3個菌株在栗實象甲蟲體培養(yǎng)基上幾丁質(zhì)酶活性Fig. 5 Chitinase activity of the three strains cultured on the baked dry larvae media of Curculio davidi larvae

2.4.3 3菌株脂肪酶的活性與毒力的相關性

同樣，以栗實象甲幼蟲的蟲體作為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)3個菌株，測定各菌株的脂肪酶活變化。結(jié)果顯示(圖6)，3個菌株的脂肪酶活性隨時間均表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢。菌株TST05和FDB01的酶活性最大值出現(xiàn)在第2天，分別為(5.09±0.35)U/mL和(7.79±0.18)U/mL。第3-8天, 菌株TST05的脂肪酶活性呈現(xiàn)波動性變化，并極顯著地小于另外兩個菌株(P< 0.05)。菌株FDB01的脂肪酶活性在第3-8天處于相對高的活性范圍，并呈現(xiàn)非常小的下降趨勢； 而菌株SYN01的脂肪酶活性在第1-4天期間呈現(xiàn)上升趨勢，在第4天達到酶活高峰值(6.8±0.91)U/mL后開始下降，第5-8天波動比較平穩(wěn)，與菌株FDB01的酶活性比較接近，二者之間顯著差異(P>0.05)。從8 d脂肪酶平均值看，3個菌株之間差異性顯著(P< 0.05)。根據(jù)3個菌株脂肪酶活性平均值與染菌幼蟲連續(xù)8 d累積校正死亡率之間作線性回歸分析，得到回歸方程式為y=0.0354+2.4586，(R2=0.1201)，說明菌株致死幼蟲過程與菌株脂肪酶的作用之間不具有直接線性相關性。

圖6 3個菌株在栗實象甲蟲體培養(yǎng)基上的脂肪酶活性Fig. 6 Lipase activity of the three trains cultured on the baked dry larvae media of Curculio davidi larvae

3 結(jié)論與討論

栗實象甲是我國板栗種植業(yè)的重要害蟲，以往防治主要采用樹冠噴灑化學殺蟲劑，防治交配和產(chǎn)卵期的成蟲，而對于在果實內(nèi)鉆蛀危害的幼蟲起不到防治效果，反而會污染環(huán)境。近年來，國外已經(jīng)有個別研究顯示白僵菌和綠僵菌對栗實象甲有一定的防治效果(Iharaetal.，2009)，但是國內(nèi)還沒有相關的研究報道。

應用昆蟲病原真菌防治栗實象甲，是針對脫果后入土的老熟幼蟲在樹冠下土壤中棲息時間長達8 月的習性，以白僵菌和綠僵菌作為生物制劑施用在土壤中，使幼蟲感染病菌得病死亡，以起到減少蟲口和防治目的。本研究通過觀察，掌握了在9月中旬到10月下旬期間，栗實象甲幼蟲在板栗內(nèi)的為害分為初期、中期、末期3個不同的階段，總結(jié)了每個階段幼蟲的大小和形態(tài)特征，以及果實上幼蟲蛀食的坑道和蟲糞特點。觀察到在此期間幼蟲取食和發(fā)育特別快，在10月下旬絕大部分幼蟲都能發(fā)育到老熟，鉆出果殼，脫果入土。并且發(fā)現(xiàn)脫果入土的老熟幼蟲，對土壤濕度要求比較高，一般在40%左右。這為科學利用白僵菌和綠僵菌作為生物制劑，在土壤中施用提供了科學依據(jù)。

為篩選出可用于防治栗實象甲的白僵菌菌株，本研究以本實驗室擁有的3個球孢白僵菌菌株TST05、FDB01、SYN01對老熟幼蟲作感染試驗，觀察了幼蟲的染病癥狀，發(fā)現(xiàn)這3個菌株都可以使幼蟲染病死亡，幼蟲染菌后的癥狀包括：蟲體活動減弱、體色變淡、體表出現(xiàn)色斑、體色變褐、出現(xiàn)死亡、體表出現(xiàn)菌絲和大量菌絲覆蓋蟲體。

病原真菌對害蟲的致死率是其篩選菌株的重要指標。本研究結(jié)果顯示，菌株SYN01對栗實象甲老熟幼蟲的致死率最高，感染后8 d 累積校正死亡率達到62.22%，致死中時6.22 d。 而菌株TST05與FDB01的8 d累積校正死亡率分別為40%與44.4%，二者無顯著差異(P> 0.05)，致死中時分別為11.6 d 和8.77 d。說明SYN01對栗實象甲老熟幼蟲擁有更強的致死作用。

昆蟲病原真菌入侵昆蟲主要是通過體壁入侵，昆蟲體壁是昆蟲抵御外來微生物入侵的第一道屏障，昆蟲體壁主要成分是蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂肪(方衛(wèi)國，2003)。病原真菌要成功進入血腔，就需要克服這些障礙，一般認為這個過程是在真菌分泌胞外酶對體壁進行降解，破壞體壁結(jié)構(gòu)，與真菌的芽管和菌絲產(chǎn)生的機械壓力形成的穿刺共同作用下完成的(St Legeretal.，1987)。許多研究表明在昆蟲病原菌入侵昆蟲表皮的過程中，產(chǎn)生的胞外酶的活性與病菌對昆蟲致病力密切相關(林海萍等，2008；Svedeseetal.，2013)。本研究以栗實象甲老熟幼蟲的表皮作為唯一碳源，模擬病原真菌入侵栗實象甲老熟幼蟲表皮過程，對病原真菌感染過程中分泌的蛋白質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶和脂肪酶進行了測定。結(jié)果顯示在模擬病原真菌入侵板栗象甲老熟幼蟲表皮過程中，菌株FDB01、TST05、SYN01的類枯草桿菌蛋白酶，幾丁質(zhì)酶和脂肪酶均表現(xiàn)出了先上升后下降的規(guī)律，表明在分解栗實象甲老熟幼蟲體壁過程中這3種酶均發(fā)揮著一定的作用。同時，這3株白僵菌所分泌的這3種酶在最大酶活性值以及最大酶活性出現(xiàn)的時間上表現(xiàn)出一定的差異，在一定程度上反映出了這3株白僵菌對栗實象甲老熟幼蟲作用的時間和毒力上的差異。

昆蟲病原真菌的胞外蛋白酶主要可以分為兩大類，一類是絲氨酸彈性凝乳蛋白酶Pr1(即類枯草桿菌蛋白酶)，另一類是絲氨酸類胰蛋白酶(Pr2)(St Legeretal.，1987)。其中Pr1是一種堿性蛋白水解酶，對昆蟲表皮表現(xiàn)出很強的特異性，而Pr2是多酶復合體的同工酶，對酪蛋白的活性很高，但是對昆蟲表皮蛋白質(zhì)的活性很低。因此，本研究選取類枯草桿菌蛋白酶作為指標，進行測定。結(jié)果顯示，在3個菌株TST05、FDB01、SYN01降解栗實象甲表皮過程中，Pr1的活性均有明顯的升高，其中菌株SYN01的酶活性平均值為(150.9032±10.29)U/mL，比其他兩個菌株的都高。經(jīng)過將Pr1酶與連續(xù)8 d的累計死亡率作線性回歸分析，R2=0.8854，線性相關性顯著，說明病原菌在感染入侵昆蟲體壁過程中，菌種Pr1在降解昆蟲體壁的蛋白質(zhì)成分，對病菌入侵發(fā)揮了關鍵作用。Pr1的活性變化與幼蟲的染病死亡率之間的直線關系，說明Pr1可以作為篩選病原真菌的一個毒力指標，這與St Leger等(1987)和Mohanty等(2008)對其他昆蟲的研究結(jié)果是一致的。

病原真菌分泌的幾丁質(zhì)酶一般認為包括兩大類，一類是幾丁質(zhì)酶，另一類是N-乙酰葡萄糖胺酶，其中幾丁質(zhì)酶是一種誘導酶，受到本身降解產(chǎn)物N-乙酰葡萄糖胺的誘導與抑制作用(St Legeretal.，1987)。昆蟲體壁中含有大量的幾丁質(zhì)，與蛋白質(zhì)形成嵌合結(jié)構(gòu)，是抵御外來微生物侵襲的重要屏障。Bernier等(1989)用昆蟲幾丁質(zhì)合成的抑制素和綠僵菌處理煙草天蛾Mandncasexta幼蟲，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成抑制素處理過的表皮更有利于綠僵菌的入侵，也說明了幾丁質(zhì)酶對真菌入侵昆蟲起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，在降解栗實象甲幼蟲體壁過程中菌株的幾丁質(zhì)酶活性都有升高，其中菌株SYN01的幾丁質(zhì)酶活性最大值為(15.12±0.32)U/mL，明顯高于菌株TST05的(12.58±0.58)U/mL 和菌株FDB01的(13.06±1.16)U/mL(P< 0.05)。幾丁質(zhì)酶活性的平均值與染菌幼蟲連續(xù)8 d累計校正死亡率作線性回歸分析，線性相關性顯著，R2=0.9328。說明幾丁質(zhì)酶在白僵菌入侵栗實象甲老熟幼蟲過程中起著重要的作用，幾丁質(zhì)酶活性與菌株的毒力直接相關，可以作為篩選菌株的一個毒力指標。

在本研究中脂肪酶酶活性有所提高，顯示脂肪酶參與了栗實象甲體壁的降解過程。其中菌株FDB01的酶活最大值為(7.79±0.18)U/mL，明顯高于TST05的(5.09±0.35)U/mL，但與菌株SYN01的(6.8±0.91)U/mL相比，無明顯差異。將脂肪酶平均值與8 d的累積校正死亡率做線性回歸分析，線性相關系數(shù)R2=0.1201，說明無明顯線性相關。馮明光等(1998)在研究白僵菌脂肪酶與菌株毒力相關性時，認為脂肪酶不適宜作為菌株的一個毒力指標，與本研究的結(jié)果一致。但是，本研究發(fā)現(xiàn)菌株的脂肪酶在1-4 d內(nèi)活性較高，而后期活性較低，說明白僵菌的脂肪酶是在病菌感染的前期發(fā)揮作用，這與昆蟲表皮蠟質(zhì)處于昆蟲表皮的上層結(jié)構(gòu)特點是一致的，當病菌入侵昆蟲體壁時， 最先接觸的應該是蠟質(zhì)層，然后才是蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)層。

綜上所述，本研究采用的球孢白僵菌3個菌株中，原寄主為松毛蟲的菌株SYN01對栗實象甲幼蟲的致死率和致死中時都明顯優(yōu)于其他兩個株菌，在降解象甲老熟幼蟲體壁過程的試驗中，該菌株的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性的最大值也均高于其他兩個株菌。而蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的酶活性與幼蟲累積校正死亡率之間呈顯著的線性相關關系。由此可以認為，菌株SYN01是3個菌株中最佳的病原真菌菌株，可以考慮用于防治栗實象甲。

References)

Bernier L, Cooper RM, Charnley AK,etal. Transformation of the entomopathogenic fungusMetarhiziumanisopliaeto benomyl resistance [J].Fems.MicrobiologyLetters, 1989, 60(3)：261-265.

Cao GC. Studies on Resistance of Diamondback MothPlutellaxylostella(L.)to Tebufenozide and the Mechanisms [D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University, 2007. [曹廣春. 小菜蛾Plutellaxylostella(L.)對蟲酰肼的抗性及其機理研究 [D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學, 2007]

Fang WG. Cloning and Characterization of Cuticle Degrading Enzyme Genes from Entomopathogenic Fungi and Improvement ofBeauveriabassianaby Genetic Modification [D]. Chongqing：Southwest Agricultural University, 2003. [方衛(wèi)國. 昆蟲病原真菌降解寄主體壁酶基因的克隆及球孢白僵菌高毒力重組菌株的獲得 [D]. 重慶：西南農(nóng)業(yè)大學, 2003]

Feng MG. Reliability of extracellular protease and lipase activity ofBeauveriabassianaisolates used as their virulence indices [J].ActaMicrobiologicaSinica, 1998, 38(6)：461-467. [馮明光. 胞外蛋白酶和脂酶活性作為球孢白僵菌毒力指標的可靠性分析[J].微生物學報, 1998, 38(6)：461-467]

Huang LN. The occurrence rule damage characteristics and integrated control ofCurculiodavidiFairmaire [J].FriendsofFarmerstoGetRich, 2014, 22：81-81. [黃莉?qū)? 栗實象的發(fā)生規(guī)律、危害特點及綜合防治[J]. 農(nóng)民致富之友, 2014, 22：81-81]

Ihara F, Toyama M, Higaki M,etal. Comparison of pathogenicities ofBeauveriabassianaandMetarhiziumanisopliaeto chestnut pests [J].AppliedEntomology&Zoology, 2009, 44(1)：127-132.

Kepenekci I, Gokce A, Gaugler R. Virulence of three species of entomopathogenic nematodes to the chestnut weevil,Curculioelephas(Coleoptera：Curculionidae)[J].Nematropica, 2004, 34(2)：199-204.

Li CY, Kong FT. The damage characteristics and control strategy ofCurculiodavidiFairmaire [J].FruitGrowers'Friend, 2012, 2：43-43. [李春野, 孔凡濤. 栗實象鼻蟲的危害特點及防治對策[J]. 果農(nóng)之友, 2012, 2：43-43]

Lin HP, Wei JY, Mao SF,etal. Correlation between protease, chitinase and lipase activities and virulence ofBeauveriabassianaagainstMonochamusalternates[J].ChineseJournalofBiologicalControl, 2008, 24(3)：290-292. [林海萍, 魏錦瑜, 毛勝鳳, 等. 球孢白僵菌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶活性與其毒力相關性[J]. 中國生物防治, 2008, 24(3)：290-292]

Mohanty SS, Raghavendra K, Dash AP. Induction of chymoelastase (Pr1)ofMetarhiziumanisopliaeand its role in causing mortality to mosquito larvae [J].WorldJournalofMicrobiology&Riotechnology, 2008, 24(10)：2283-2288.

Qu DZ, Huang YC, Zhang YR. The biological property and integrated control ofCurculiodavidiFairmaire [J].ShaanxiForestScienceandTechnology, 2009, 1：71-73. [屈頂柱, 黃應成, 張宜仁. 栗實象甲生物學特性及綜合防治技術研究[J]. 陜西林業(yè)科技, 2009, 1：71-73]

Speranza S, Paparatti B, Bounous G,etal. Chemical control of chestnut weevils in central Italy [J].ActaHorticulturae, 2010, 866(3)：411-415.

Sun SF, uo YG, Tang YJ,etal. Observation on the life history ofCurculiobimaculatusFaust and its control withPaecilomycesfarinosus[J].ForestPestandDisease, 2004, 23(5)：21-24. [孫紹芳,郭亞鋼, 唐永軍, 等. 二斑栗實象甲生活史觀察及粉擬青霉菌防治試驗[J]. 中國森林病蟲, 2004, 23(5)：21-24]

St Leger RJ, Cooper RM, Charnley AK. Production of cuticle-degrading enzymes by the entomopathogenMetarhiziumanisopliaeduring infection of cuticles formCalliphoravomitoriaandManducasexta[J].JournalofGeneralMicrobiology, 1987, 133(5)：1371-1382.

Silva WOB, Mitidieri S, Schrank A,etal. Production and extracellular lipase from the entomopathogenic fungusMetarhiziumanisopliae[J].ProcessBiochemistry, 2005, 40(1)：321-326.

Svedese VM, Tiago PV, Bezerra JDP,etal. Pathogenicity ofBeauveriabassianaand production of cuticle-degrading enzymes in the presence ofDiatraeasaccharaliscuticle [J].AfricanJournalofBiotechnology, 2013, 12：6491-6497.

Wei MX, Liu RJ. The occurrence and control of the main pest of Jingdong Chestnut[J].BeijingAgriculture, 2014, 30：158-159. [魏敏宣, 劉瑞江. 京東板栗主要病蟲害的發(fā)生與防治[J]. 北京農(nóng)業(yè), 2014, 30：158-159]

Yuan SJ, Sun Y, Wang XD，etal. The biological property and control ofCurculiodavidiFairmaire [J].LiaoningAgriculturalSciences, 2010, 5：9-60. [袁少杰, 孫羽, 王曉東, 等. 栗實象鼻蟲生物學特性與防治[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學, 2010, 5：9-60]

Yu WJ, Song XS, Sun Y.Progress on the control ofCurculiodavidiFairmaire [J].JilinAgriculture, 2015, 9：94-95. [遇文婧, 宋小雙, 孫妍. 栗實象甲的防治研究進展[J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2015, 9：94-95]

Virulence of three strains ofBeauveriabassianainfectedCurculiodavidiFairmaire

CHEN Chun-Yan, XIE Ying-Ping*, ZHOU Xi-Bei, WANG Xu, WANG Yun

(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

This research is to explore the infection symptoms, lethallty rate, the median lethal time (LT50)of the larvae ofCurculiodavidiinfected with the three strains ofBeauveriabassiana(TST05, FDB01 and SYN01), and to explore the relationship between the activities of extracelluar enzymes and virulence of the three strains. The following methods were used. TheC.davidiwere infected by immersing the insects with conidial suspension (1.0 × 108conidia/mL)of the three strains. The corrected lethallty rates of the larvae were recorded every day. The baked dry larvae were used as the sole carbon source in the medium for fungal culturing, and the activities of threes extracellular enzymes, including lipase, protease (Pr1)and chintinase produced by the three strains were determined. The results showed the diseased symptoms and death of larvae started in 1-4 d after inoculation, and the cumulative mortality on 8 d of TST05, FDB01 and SYN01 were 40%， 44.4% and 62.22%, respectively. In which, the SYN01 strain caused the highest mortality rates of the larvae and showed significant difference compared to the strains TST05 and FDB01. The maximum peak values of Pr1 enzyme activities of the strains TST05, FDB01 and SYN01 were (175.56±0.7)U/mL, (172.74±2.32)U/mL and (195.71±5.41)U/mL, respectively. The maximum peak values of chitinase activity of the three strains were (12.58±0.58)U/mL, (13.06±1.16)U/mL and (15.12±0.32)U/mL, respectively. The Pr1 activities and chitinase activity of strain SYN01 were the highest in the three strains. And no difference existed between TST05 and FDB01. The relationships between the average values of Pr1 activity, chitinase activity and lipase activity of three strains in the period of 8 d and to the cumulative mortality of the infected larvae were analyzed, and the linear equations were y=0.4641+122.45 (R2=0.8854), y=0.034x+10.473 (R2=0.9328), y=0.0354x+2.4586 (R2=0.1201), respectively. It is indicated a significant linear relationship between Pr1 activity and chitinase activity of the strains and the larval mortality. Based on comprehensive analysis of the results, the strain SYN01 can be considered as a better pathogenic fungus for biological control ofCurculiodavidilarvae. Pr1 and chitinase activity can be used as virulence index for strain choice.

CastaneamollissimaBlume;CurculiodavidiFairmaire;Beauveriabassiana; virulence; extracellular enzymes

山西省科技攻關項目(20140311017-6)

陳春艷，女，1991年生，山西臨汾人，在讀研究生，研究方向為昆蟲病原真菌與生物防治，E-mail：873871578@qq.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail：xieyingping@eyou.com

Received：2016-07-01；接受日期Accepted：2016-08-22

Q963； S893.3

A

1674-0858(2017)01-0198-09

陳春艷，謝映平，周西貝，等.三株球孢白僵菌對栗實象甲幼蟲的感染和致病力研究[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(1):198-206.