徐 凱，牛慶生，劉玉玲，陳東海，楊 爽，趙慧婷，姜玉鎖

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108； 3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101; 4. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

中華蜜蜂HSC70-4基因表達(dá)特性的研究

徐 凱，牛慶生2*，劉玉玲2，陳東海2，楊 爽1，3，趙慧婷4，姜玉鎖1*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108； 3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101; 4. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

組成型熱休克蛋白70-4(heat shock protein 70 cognate 4，HSC70-4)是HSP70家族的重要成員，對(duì)蛋白質(zhì)的正確折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)有著重要意義。本研究以中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的HSC70-4基因序列為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)中華蜜蜂不同發(fā)育階段、不同組織以及不同低溫脅迫下的HSC70-4 mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，以期為揭示該基因在中華蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育和耐寒抗凍過(guò)程中的生理功能提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，中華蜜蜂HSC70-4基因包含1923 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼641個(gè)氨基酸，蛋白分子量為70.4 kDa。中華蜜蜂HSC70-4氨基酸序列中包含3個(gè)HSP70家族的標(biāo)簽序列，其N(xiāo)端含有HSC70家族的GGXP四肽結(jié)構(gòu)標(biāo)志，C端包含EEVD結(jié)構(gòu)。與膜翅目其它昆蟲(chóng)的氨基酸序列一致性在94%以上，具有較高的保守性。中華蜜蜂HSC70-4在成蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高于幼蟲(chóng)期和蛹期(P<0.01)，從幼蟲(chóng)期至10日齡成蟲(chóng)期呈逐漸上升趨勢(shì)，但在15日齡至30日齡間呈現(xiàn)波動(dòng)起伏。HSC70-4在中華蜜蜂不同組織中的表達(dá)存在顯著差異(P<0.01)，且在胸部高度表達(dá)，在足中中度表達(dá)，在其余組織中低度表達(dá)。中華蜜蜂HSC70-4的表達(dá)受低溫脅迫的誘導(dǎo)，在低溫脅迫2 h時(shí)其表達(dá)量最低，4 h時(shí)表達(dá)量最高。本研究結(jié)果表明中華蜜蜂HSC70-4在中華蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮生理功能。

中華蜜蜂；HSC70-4；發(fā)育表達(dá)；低溫脅迫

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是生物細(xì)胞在面臨極端溫度、氧化應(yīng)激、有毒物質(zhì)以及傳染性物質(zhì)等多種應(yīng)激條件下所產(chǎn)生的一類(lèi)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡的分子伴侶蛋白(Libereketal.，2008；Bashaetal.，2012)。HSPs是個(gè)蛋白質(zhì)超家族，根據(jù)分子量大小和序列同源性可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSPs(Garridoetal.，2012)。在眾多的HSPs中HSP70家族的蛋白保守性最高，并且與溫度脅迫應(yīng)激密切相關(guān)。HSP70蛋白參與真核生物蛋白質(zhì)的合成、跨膜、轉(zhuǎn)運(yùn)，降低蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性和錯(cuò)誤折疊機(jī)率，并且能夠清除變性的蛋白質(zhì)(Mayer and Bukau，2005；Daugarrdetal.，2007)。編碼HSP70蛋白的基因一般分為2類(lèi)，第一類(lèi)為誘導(dǎo)型HSP70，該基因在受到脅迫時(shí)可以迅速上調(diào)，當(dāng)脅迫消失的時(shí)候便回歸至正常的表達(dá)水平，一般認(rèn)為其與細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)相關(guān)。第二類(lèi)為高度保守的組成型HSC70(Heat Shock Cognate 70，HSC70)，該基因在正常情況下編碼組成型蛋白，當(dāng)面對(duì)環(huán)境應(yīng)激時(shí)，可被誘導(dǎo)表達(dá)成誘導(dǎo)型HSP70 (Lindquist and Craig，1988；Wangetal.，2004；Baharetal.，2013)。

作為HSP70家族的重要組成成員，目前HSC70的研究主要集中在該基因的表達(dá)與生物個(gè)體發(fā)育階段、溫度脅迫、殺蟲(chóng)劑和重金屬污染以及食物限飼等脅迫的相關(guān)性研究上，但由于試驗(yàn)動(dòng)物和處理方法的不同導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大的差異，HSC70基因的表達(dá)是否與環(huán)境脅迫相關(guān)依然存在較大爭(zhēng)議(Mahroofetal.，2005；Shimetal.，2006；Sonodaetal.，2006a,b；Wangetal.，2008；Yoshimietal.，2009；Wangetal.，2012；Sunetal.，2016)。中華蜜蜂作為重要的授粉昆蟲(chóng)，在維持我國(guó)生態(tài)環(huán)境平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Zhangetal.，2014)，其作為我國(guó)當(dāng)家品種，與引入品種西方蜜蜂相比，具有嗅覺(jué)靈敏、善于采集零星蜜源、抗逆性和抗螨能力強(qiáng)、產(chǎn)卵有節(jié)制等優(yōu)點(diǎn)。此外，對(duì)中華蜜蜂過(guò)冷卻點(diǎn)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂的過(guò)冷卻點(diǎn)顯著低于西方蜜蜂，證明中華蜜蜂具有較強(qiáng)的耐寒能力(牛慶生和李志勇，2013)。本研究以中華蜜蜂為試驗(yàn)材料，以前期構(gòu)建的中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出來(lái)的HSC70-4基因作為目的基因，通過(guò)對(duì)中華蜜蜂HSC70-4基因進(jìn)行序列分析并測(cè)定其在中華蜜蜂不同發(fā)育階段、不同組織以及不同低溫脅迫下的表達(dá)量，旨在揭示HSC70-4在中華蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)的生理功能，同時(shí)也為蜜蜂耐寒性的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

取樣蜂群來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)飼養(yǎng)的中華蜜蜂。選取3群健康無(wú)病、群勢(shì)6足框、無(wú)自然分蜂的正常蜂群作為試驗(yàn)蜂群。在每蜂群中各挑選1-2脾正在產(chǎn)卵的巢脾進(jìn)行標(biāo)記，從產(chǎn)卵的當(dāng)天進(jìn)行記錄，分別在產(chǎn)卵后的第8天(5齡期幼蟲(chóng))和第16天(8齡期蛹)進(jìn)行采集30頭幼蟲(chóng)和蜂蛹樣品，在第20天取出老熟的封蓋子脾，置于34℃的恒溫恒濕箱中，待其羽化出房后，用無(wú)毒、無(wú)味的油漆在其胸背部標(biāo)記工蜂200頭后，放回原蜂群中，隨后分別在1、5、10、15、20、25、30日齡采樣。蜜蜂的幼蟲(chóng)、蛹、各齡成蟲(chóng)在采集后迅速投入液氮速凍，隨后于-80℃保存?zhèn)溆?。采取剛羽化出房?日齡中華蜜蜂成蟲(chóng)80頭，在冰上分離蜜蜂個(gè)體的頭、胸、腹、足、翅膀和觸角，隨后迅速投入液氮中保存?zhèn)溆?。低溫脅迫處理的蜜蜂分別為20日齡的中蜂成蟲(chóng)(180頭)，0 h處理的蜜蜂直接采自蜂箱中，低溫處理時(shí)將采集的成蟲(chóng)均單獨(dú)放置于扎孔的15 mL離心管中迅速將其放入10℃或0℃的恒溫恒濕箱中，計(jì)時(shí)，分別于2 h、4 h、6 h和8 h后取出后迅速投入液氮中，隨后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

RNAisoTMPlus，PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBRPremixExTaqTMⅡ熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；三氯甲烷、無(wú)水乙醇以及DEPC等常規(guī)試劑均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，7500FAST 型熒光定量PCR儀(ABI)，AB-9902 型觸摸式PCR儀(AB)，Universal HoodⅡ核酸蛋白成像儀(BIO-RAD)，ND-1000 核酸蛋白測(cè)定儀(Nanodrop)。

1.3 RNA的提取和cDNA 第一鏈的合成

從-80℃冰箱內(nèi)取出樣品，經(jīng)液氮研磨后，按照Trizol試劑盒(TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)提取各組織總RNA，測(cè)定濃度和純度后，再根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

在本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組基因序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)Blast比對(duì)篩選出中華蜜蜂Hsc70-4基因，根據(jù)所得序列的CDS序列設(shè)計(jì)熒光定量引物，引物信息為HSC70-4 F：5′-GGCGATTGCTTATGGCTTAG-3′；HSC70-4 R：5′-CCGCTGTTGACTTCACTTCA-3′，內(nèi)參基因選用β-actin,引物信息為β-actinF:5′-ACTACGGCC GAACGTGAAAT-3′,β-actinR:5′-GGAAAAGAGCC TCGGGACAA-3′。引物由北京六合華大基因公司合成。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)

將反轉(zhuǎn)錄合成的各發(fā)育階段的中、意蜂全身組織cDNA 模板稀釋5倍后，根據(jù)TaKaRa 的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系總體積為20 μL，含cDNA模板2 μL，SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30 s, 95℃變性5 s，60℃退火及延伸34 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)組織樣本重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 序列分析

采用Blast進(jìn)行同源序列比對(duì)，利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找獲得序列的開(kāi)放閱讀框區(qū)域(ORF)，采用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc ture/cdd/wrpsb.cgi)來(lái)分析氨基酸序列中的功能結(jié)構(gòu)域，采用Mega 4.0進(jìn)行同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

熒光定量PCR中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線的Ct值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用SPSS 17.0軟件中的單因素ANOVA方法進(jìn)行方差分析，并選用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(孟嬌等，2015)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華蜜蜂HSC70-4序列分析

對(duì)從中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的中華蜜蜂HSC70-4基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，HSC70-4開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)1923 bp，編碼641個(gè)氨基酸，分子量為70.4 kDa，等電點(diǎn)為5.61，脂肪系數(shù)為80.33，平均親水力為-0.437，不穩(wěn)定系數(shù)為35.91，表明該蛋白為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HSC70-4氨基酸序列中包括IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVS和VLVGGSTRIPKIQ 3個(gè)HSP70家族的簽名序列和C端高度保守的EEVD序列，此外還包含AEAYLG(第131-136位氨基酸)和KRKYKKDLSSNKRALRRLRTACE RAKRTL(第246-274位氨基酸)2個(gè)HSP70家族的功能結(jié)合區(qū)域(圖1)，以上特有的序列均符合HSP70家族的的氨基酸序列特征，表明該蛋白屬于HSP70家族。在該氨基酸序列N端發(fā)現(xiàn)一個(gè)GGKP的四肽序列，可判定該蛋白屬于組成型HSC70家族。

圖1 中華蜜蜂HSC70-4 ORF區(qū)核苷酸及氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HSC70-4 from Apis cerana cerana

通過(guò)Blast對(duì)膜翅目昆蟲(chóng)HSC70-4氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)膜翅目昆蟲(chóng)間HSC70-4氨基酸序列一致性達(dá)到94%以上，對(duì)中華蜜蜂、東方蜜蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂以及小蜜蜂的HSC70-4氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，上述昆蟲(chóng)的HSC70-4氨基酸序列一致性達(dá)到99%以上，表明HSC70-4具較高度的保守性。利用MEGA 4.0軟件鄰位相連法(Neighbor-joining)進(jìn)行1000次重復(fù)計(jì)算后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)所用的昆蟲(chóng)分別聚類(lèi)為鱗翅目、鞘翅目、半翅目以及膜翅目4個(gè)大的分支，在膜翅目分支中除中華蜜蜂所在的蜜蜂科外還包括一些蟻科的昆蟲(chóng)。

圖2 不同昆蟲(chóng)HSC70-4氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of HSC70-4 from different insect species based on amino acid sequencesNote: HSC70 amino acids were from the following species with their accession numbers:字地老虎Xestia c-nigrum (AGQ50302.1), 斜紋夜盜蟲(chóng)Spodoptera litura (ADM66138.1), 球萊夜蛾Agrotis ipsilon (AEG78288.1), 小菜蛾P(guān)lutella xylostella (AFC38439.1), 柑橘鳳蝶Papilio xuthus (KPJ19257.1), 金鳳蝶Papilio machaon (XP_013164788.1), 赤擬合盜Tribolium castaneum (XP_966611.1), 山松甲蟲(chóng)Dendroctonus ponderosae (ERL94381.1), 隱尾蠊Cryptocerus punctulatus (AFK49798.1), 東亞小花蝽Orius sauteri (AIA61348.1), 斑衣蠟蟬Lycroma delicatula (AFP54307.1),褐飛虱 Nilaparvatu lugens (ADE34170.1), 灰飛虱Laodelphax striatella (AMD09926.1), 東方蜜蜂Apis cerana (XP_016909782.1), 大蜜蜂Apis dorsata (XP_006620321.1), 西方蜜蜂Apis mellifera (NP_00113544.1), 小蜜蜂Apis florea (XP_012345102.1), 佛羅里達(dá)多弓背蟻Camponotus floridanus (XP_011268514.1),印度跳蟻 Harpegnathos saltator (XP_011153497.1),紅火蟻 Solenopsis invictal (XP_011173246.1), 小火蟻Wasmannia auropunctata (XP_01170048.1),紅收獲蟻 Pogonomyrmex barbatus (XP_011638214.1), 熱帶切葉蟻Atta cephalotes (XP_012063430.1), 切葉蟻Acromymex echinatior (XP_01105968.1).

2.2HSC70-4在中華蜜蜂不同發(fā)育階段的表達(dá)

HSC70-4在中華蜜蜂各生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)量見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，HSC70-4 mRNA表達(dá)在中華蜜蜂整個(gè)發(fā)育時(shí)期中呈現(xiàn)出前期逐漸上升后期波動(dòng)起伏的表達(dá)趨勢(shì)，HSC70-4在幼蟲(chóng)期至羽化出房10日齡(Adu10)之間呈現(xiàn)逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì)，之后在Adu10至Adu20之間呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，隨后在Adu25達(dá)到最高的表達(dá)水平(P<0.01)后，在Adu30時(shí)期下降至較低的表達(dá)水平。此外，通過(guò)比較幼蟲(chóng)期、蛹期和成蟲(chóng)期HSC70-4 mRNA的表達(dá)可發(fā)現(xiàn)該基因在成蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高于幼蟲(chóng)期和蛹期(P<0.01)。

圖3 中華蜜蜂HSC70-4在各發(fā)育階段的表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of HSC70-4 mRNA at different stages of Apis cerana cerana注：不同大寫(xiě)字母表示相同品種在不同發(fā)育階段差異極顯著(P<0.01)。Note: Data with different capital letters indicated significant difference between different stages of the same species at 0.01 level.

2.3HSC70-4在中華蜜蜂不同組織中的表達(dá)

圖4為HSC70-4在中華蜜蜂不同組織中的表達(dá)量。由圖可知HSC70-4在中華蜜蜂頭、胸、腹、足、觸角和翅膀中均有表達(dá)，表達(dá)量由高到低分別為胸>足>頭>翅膀>觸角>腹。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，HSC70-4在6個(gè)組織間可分為3個(gè)表達(dá)水平，在胸部高度表達(dá)，在足中中度表達(dá)，在其余組織中低度表達(dá)(P<0.01)。

圖4 中華蜜蜂HSC70-4在不同組織中的表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of HSC70-4 mRNA in different tissues of Apis cerana cerana注：An，觸角；He，頭(去除觸角)；Th，胸(去除翅膀)；Le，足；Wi，翅膀；Ab，腹。不同大寫(xiě)字母表示相同品種在不同發(fā)育階段差異極顯著(P<0.01)。Note: An, Antenna; He, Head without antenna; Th, Thorax without wings; L, Legs; W, Wings; Ab, Abdomen. Data with different capital letters indicated significant difference between different stages of the same species at 0.01 level.

圖5 中華蜜蜂HSC70-4在低溫脅迫時(shí)的表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of HSC70-4 mRNA in response to different low temperature treatments注：不同大寫(xiě)字母表示相同溫度下不同時(shí)間之間差異極顯著(P<0.01),*表示相同時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05),**表示相同時(shí)間不同處理間差異極顯著(P<0.01)，ns表示相同時(shí)間不同處理間無(wú)顯著差異(P > 0.05)。Note: Data with different capital letters indicated significant difference between different processing time of the same temperature at 0.01 level. * indicated significant difference between different treatments of the same processing time at 0.05 level. ** indicated significant difference between different treatments of the same processing time at 0.01 level. ns indicated no significant difference between different treatments of the same processing time.

2.4HSC70-4在低溫脅迫時(shí)的表達(dá)

圖5為HSC70-4分別在中華蜜蜂10℃和0℃下脅迫0-8 h的表達(dá)量。由圖可知，HSC70-4 mRNA在10℃和0℃的低溫狀態(tài)下表達(dá)趨勢(shì)基本一致。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均表現(xiàn)出先在2 h時(shí)顯著下降后迅速上升(P<0.01)于4 h時(shí)達(dá)到最高的表達(dá)水平(P<0.01)，隨后在6 h和8 h時(shí)維持相對(duì)穩(wěn)定的中度表達(dá)水平。在相同時(shí)間的處理下，2 h、4 h和8 h時(shí)中華蜜蜂HSC70-4在10℃的表達(dá)量均顯著高于0℃(P<0.05)，在0 h和6 h時(shí)兩溫度下HSC70-4的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P> 0.05)。

3 結(jié)論與討論

HSP70家族是HSPs中保守性最高的基因家族，其廣泛分布于生物界中(McKayetal.，1994)。本研究獲得的中華蜜蜂HSC70-4氨基酸序列包括HSP70家族的3個(gè)標(biāo)簽序列和C末端的EEVD序列，表明本研究獲得的HSC70-4屬于DnaK類(lèi)型HSP70，該結(jié)果與韓嵐嵐(2014)對(duì)大豆蚜AphisglycinesHSC70的研究相同。此外，中華蜜蜂HSC70-4氨基酸序列中N端存在GGKP四肽結(jié)構(gòu)，符合組成型HSC70家族中GGXP的標(biāo)志(Wuetal.，2001)。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂HSC70-4的氨基酸序列與膜翅目其他昆蟲(chóng)相似性在94%以上，與其他目昆蟲(chóng)也有較高的相似性，這種非常強(qiáng)的進(jìn)化上的保守性說(shuō)明昆蟲(chóng)HSC70-4基因?qū)τ谏锏纳顒?dòng)有著重要的意義(張拓，2013)。

HSC70作為HSP70家族的組成型蛋白，其在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用一直備受研究者的關(guān)注。李鴻波(2013)研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬FrankliniellaoccidentalisHSC70-1在幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)期均有表達(dá)，其在成蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高于幼蟲(chóng)期和蛹期(P<0.05)。在美洲斑潛蠅LiriomyzasativaBlanchard和斜紋夜蛾Spodopteralitura中的研究也表明HSC70的表達(dá)隨著個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育而顯著上調(diào)(Huangetal.，2009；Shuetal.，2011)。本試驗(yàn)中中華蜜蜂HSC70-4在幼蟲(chóng)期至10日齡逐漸上升，表明HSC70-4參與了中華蜜蜂個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育，推測(cè)是由于該階段中華蜜蜂處于相對(duì)適宜且穩(wěn)定的環(huán)境(蜂箱)中，HSC70-4在中華蜜蜂個(gè)體發(fā)育中發(fā)揮著新合成肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和蛋白前轉(zhuǎn)運(yùn)等功能(Lindquist and Craig，1988)，而在15日齡后由于參與巢外活動(dòng)的增多，應(yīng)對(duì)復(fù)雜的外界環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致該基因的表達(dá)變得波動(dòng)起伏，本試驗(yàn)結(jié)果與西花薊馬、美洲斑潛蠅和斜紋夜蛾的試驗(yàn)結(jié)論基本一致，但與赤擬谷盜Triboliumcastaneum和大螟Sesamiainferens中HSC70的表達(dá)模式不一致，赤擬谷盜HSC70-2在各發(fā)育時(shí)期無(wú)顯著差異(Mahroofetal.，2005)，而大螟HSC70的表達(dá)量隨著幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育逐漸下降(孫猛等，2014)。上述結(jié)果表明HSC70基因在不同昆蟲(chóng)中的表達(dá)模式存在顯著差異，HSC70是否參與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育是因物種而異的。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Hsc70-4在中華蜜蜂胸部和足中的表達(dá)量顯著高于其余組織(P<0.01)，推測(cè)可能是由于胸部是蜜蜂肌肉和內(nèi)骨骼聚集的部位，其和足部也是蜜蜂面臨各種環(huán)境脅迫因子時(shí)反應(yīng)最為靈敏的部位，HSC70-4的高度表達(dá)有助于快速應(yīng)對(duì)突發(fā)的環(huán)境變化，增強(qiáng)個(gè)體的抗應(yīng)激能力。

HSC70和HSP70均屬于HSP70家族成員，兩基因家族之間具有Hsp70家族的很多共有特性，但兩者存在較大差異。研究表明HSP70由于不含內(nèi)含子的緣故在脅迫條件下短時(shí)間內(nèi)可被大量誘導(dǎo)，而HSC70由于包含內(nèi)含子對(duì)溫度脅迫不敏感(Chuangetal.，2007；Wangetal.，2008)，在赤擬谷盜、大螟和大豆蚜中研究也表明HSC70對(duì)不同溫度脅迫無(wú)顯著變化(Mahroofetal.，2005；韓嵐嵐等，2014；孫猛等，2014)。但近年來(lái)研究表明HSC70的表達(dá)與受脅迫的物種、脅迫時(shí)所處的發(fā)育時(shí)期、脅迫溫度和脅迫時(shí)間密切相關(guān)，Sun等(2016)研究表明盲蝽ApolyguslucorumHSC70在1-5齡幼蟲(chóng)期應(yīng)對(duì)18-33℃脅迫時(shí)的表達(dá)量間存在顯著差異(P<0.05)。對(duì)西花薊馬進(jìn)行不同溫度的脅迫后發(fā)現(xiàn)HSC70-1和HSC70-2的表達(dá)量出現(xiàn)顯著性變化(P<0.05)(李鴻波，2013)。本研究中低溫脅迫結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂HSC70-4的表達(dá)受低溫脅迫的誘導(dǎo)，HSC70-4在低溫處理2 h時(shí)表達(dá)量最低，4 h時(shí)達(dá)到最高的表達(dá)水平，之后的6 h到8 h均保持相對(duì)穩(wěn)定的較低的表達(dá)水平，推測(cè)在低溫處理2 h階段由于對(duì)溫度敏感的誘導(dǎo)型HSP70的大量表達(dá)，從而抑制了組成型HSC70-4的表達(dá)(韓嵐嵐等，2014)，而隨后低溫脅迫的持續(xù)，變性蛋白的過(guò)多積累，HSP70誘導(dǎo)受到抑制，HSC70-4的大量表達(dá)有利于變性蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和消除(Lindquist and Craig，1988)，低溫脅迫4 h后蜜蜂個(gè)體對(duì)寒冷逐漸適應(yīng)，但自身代謝速率大為降低，導(dǎo)致6 h和8 h時(shí)處于相對(duì)穩(wěn)定的低度表達(dá)水平，但也有可能是因?yàn)榈蜏? h后蜜蜂抗寒策略發(fā)生改變，由其他耐寒基因作為耐寒的主效基因發(fā)揮抗寒作用，該推斷還需要進(jìn)一步的深入研究。

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Expression characteristcs ofHSC70-4 gene inApisceranacerana(Hymenoptera: Apidae)

XU Kai1, NIU Qing-Sheng2*, LIU Yu-Ling2, CHEN Dong-Hai2, YANG Shuang1,3, ZHAO Hui-Ting4, JIANG Yu-Suo1*

(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi Province, China; 2. Apiculture Science Institute of Jilin Province, Jilin 132108, Jilin Province, China; 3. Sericultural and Apicultural Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Mengzi 661101, Yunnan Province, China; 4. College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi Province, China)

Heat shock protein 70 cognate 4 is an important member of the family of HSP70 and play an important role in the correct folding and transmission of proteins. In order to explore the physiological function ofHSC70-4 gene in response to different development stages and low temperature stress ofApisceranacerana. Based on the successful transcriptome sequencing inA.c.cerana, we analyzed the nucleotide and amino acid sequence ofHSC70-4 and used RT-qPCR to analyze the expression ofHSC70-4 in different development stages, tissues and response to different low temperature stress. Sequence analysis results showedHSC70-4 ofA.c.ceranainclude a 1923 bp open reading frame, encoding a polypeptide of 641 amino acids with an estimated molecular mass of 70.4 kDa.HSC70-4 contained 3 sequence labels of theHsp70 gene family. Sign sequence of GGXP and EEVD were contained in N-terminal and C-terminal, respectively. The amino acids sequence comparison showed that theHSC70-4 had a 94% of similarity with other Hymenoptera, indicating the high level of gene conservation. Expression ofHSC70-4 in adult was higher than larval and pupal (P<0.01). It increased from larval to adu10 and fluctuated from adu15 to adu30. The expression levels ofHSC70-4 were significantly different among different tissues (P<0.01), with the highest expression level in thorax, the higher expression level in leg and the lowest levels in other tissues. The expression ofHSC70-4 was induced by low temperature stress, the minimum and maximum of expression ofHSC70-4 mRNA were low temperature treatments for 2 h and 4 h, respectively. This study displayedHSC70-4 gene involve in the growth and development ofA.c.ceranaand plays significant psychological functions in response to low temperature stress.

Apisceranacerana；HSC70-4；developmental expression；low-temperature stress

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31372386)

徐凱，男，1989年生，山西臨汾人，博士研究生，研究方向?yàn)槊鄯渖飳W(xué)，E-mail：xukaiyuzhonga@126.com

*通訊作者 Author for correspondence，E-mail：1463199779@qq.com; jiangys-001@163.com

Received：2016-10-17；接受日期 Accepted：2016-11-7

Q963;S89

A

1674-0858(2017)01-0055-07

徐凱，牛慶生，劉玉玲，等.中華蜜蜂HSC70-4基因表達(dá)特性的研究[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017,39(1):55-61.