杜亞麗，潘建芳，王樹(shù)杰，楊 爽,2，趙慧婷，姜玉鎖

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101； 3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr167的克隆及表達(dá)分析

杜亞麗1*，潘建芳*，王樹(shù)杰1，楊 爽1,2，趙慧婷3，姜玉鎖1**

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101； 3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

本研究通過(guò)RT-PCR獲得中華蜜蜂氣味受體基因Or167的cDNA序列，并采用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用熒光定量PCR檢測(cè)AcerOr167 mRNA在工蜂羽化后不同發(fā)育階段(1、5、10、15、20、25和30日齡)和不同組織(觸角、頭、胸、腹、足、翅)中的相對(duì)表達(dá)量?？寺～@得中華蜜蜂Or167的cDNA序列，命名為AcerOr167(GenBank登錄號(hào)為KF239369)，其全長(zhǎng)1311 bp，編碼436個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；多序列比對(duì)結(jié)果顯示，中華蜜蜂AcerOr167與西方蜜蜂AmelOr167的一致性最高，達(dá)94%，而與畢氏粗角蟻CbirOr4-like的一致性最低，為49%；熒光定量結(jié)果顯示，AcerOr167 mRNA在成蜂不同發(fā)育期的各個(gè)組織中均有表達(dá)，且觸角中的表達(dá)量極顯著高于其它各個(gè)組織(P<0.01)，在頭、胸、腹、足、翅中有少量表達(dá)；從觸角不同發(fā)育階段的表達(dá)情況來(lái)看，1日齡表達(dá)量最低，5日齡表達(dá)量顯著升高，20日齡表達(dá)量最高，且極顯著高于其它各日齡(P<0.01)。推測(cè)AcerOr167可能在中華蜜蜂的嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)中起著重要的作用，與中華蜜蜂外出采集，識(shí)別花香氣味有關(guān)。本研究為進(jìn)一步深入研究中華蜜蜂傳統(tǒng)氣味受體的功能奠定理論基礎(chǔ)。

中華蜜蜂；AcerOr167；基因克隆；熒光定量；表達(dá)譜

昆蟲(chóng)憑借高度專(zhuān)一、靈敏的嗅覺(jué)感受系統(tǒng)進(jìn)行棲息地的選擇、繁殖、飛翔、躲避天敵和傳遞信息等生命活動(dòng)(Kriegeretal.，2002；Bruceetal.，2005)。昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程非常復(fù)雜，需要多種蛋白參與，其中氣味受體專(zhuān)一性識(shí)別并結(jié)合氣味分子在嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著至關(guān)重要的作用。1999年《Science》雜志報(bào)道鑒定出黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的第一個(gè)氣味受體基因(Pennisietal.，1999)，之后Vosshall等(1999)通過(guò)全基因組測(cè)序的方法從果蠅的基因組中篩選獲得62個(gè)氣味受體基因，這些基因形成一個(gè)高度變異的家族，基因之間的同源性很低。目前已經(jīng)從至少獲得的15種昆蟲(chóng)的全基因組序列中篩選出了氣味受體基因(Sánchez-Graciaetal.，2009)，例如從岡比亞按蚊Anophelesgambiae、家蠶Bombyxmori、意大利蜜蜂Apismellifera、埃及伊蚊Aedesaegypti和金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis等中分別鑒定得到79、64、170、113和301個(gè)Ors基因(Hilletal.，2002；Robertsonetal.，2006；Wanneretal.，2007；Bohbotetal.，2007；Robertsonetal.，2010)。Benton等(2006)利用LacZ融合和綠色熒光蛋白檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)果蠅氣味受體與哺乳動(dòng)物的氣味受體家族一樣具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，但N末端位于細(xì)胞膜內(nèi)。近年來(lái)，對(duì)昆蟲(chóng)氣味受體的功能研究越來(lái)越受到科學(xué)工作者的青睞。

蜜蜂作為一種高級(jí)的社會(huì)性昆蟲(chóng)，主要通過(guò)靈敏的嗅覺(jué)識(shí)別個(gè)體和群體之間的各類(lèi)信息素和外界環(huán)境中的各種氣味物質(zhì)，如蜂王通過(guò)信息素來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂群的調(diào)控、蜂王與雄蜂的交配、蜂王產(chǎn)卵、工蜂之間的分工、采集蜂出巢尋找蜜粉源并準(zhǔn)確定位等(Gruterwmetal.，2007；張巧等，2011)。Krieger等(2003)以果蠅Or83b和岡比亞按蚊AgOr7基因的序列為參考，克隆出西方蜜蜂Apismellifera的第一個(gè)氣味受體基因，命名為AmelR2。2006年西方蜜蜂全基因組測(cè)序完成后，Robertson等(2006)利用生物信息學(xué)方法從中鑒定出了170個(gè)Ors，其中7個(gè)是假基因，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將這170個(gè)Ors分成了5個(gè)亞家族，且研究發(fā)現(xiàn)Ors基因能為蜜蜂尋找蜜粉源和檢測(cè)信息素類(lèi)物質(zhì)提供重要的線(xiàn)索。Wanner等(2007)構(gòu)建西方蜜蜂基因芯片，掃描并檢測(cè)出Or10，Or11，Or18，Or170在雄蜂觸角中呈高豐度表達(dá)，并通過(guò)電生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雄蜂的Or11僅對(duì)9-ODA反應(yīng)敏感，對(duì)其他蜂王信息素?zé)o反應(yīng)。中華蜜蜂Apisceranacerana(簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂)，是我國(guó)獨(dú)有的蜜蜂品種，具有嗅覺(jué)靈敏，采集力強(qiáng)，利用率高，抗寒抗病能力強(qiáng)，消耗飼料少等西方蜜蜂無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)(楊冠煌，2001，2005；曾志將，2002)。中華蜜蜂對(duì)維持我國(guó)動(dòng)植物的生態(tài)平衡起著重要的作用，特別是有利于高寒山區(qū)植物的傳粉授粉，但由于殺蟲(chóng)劑、除草劑等化學(xué)藥品在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，給中華蜜蜂的健康養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的威脅；西方蜜蜂的引入使中華蜜蜂的種群數(shù)量和分布區(qū)域明顯縮小，因而合理利用和保護(hù)我國(guó)特有的蜜蜂資源勢(shì)在必行。

本試驗(yàn)以中華蜜蜂為研究對(duì)象，利用RT-PCR技術(shù)獲得AcerOr167的cDNA序列，并采用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析；利用熒光定量分析AcerOr167在工蜂羽化后不同發(fā)育階段和不同組織中的表達(dá)情況，推測(cè)AcerOr167在中華蜜蜂嗅覺(jué)識(shí)別中發(fā)揮著重要的作用，為進(jìn)一步深入研究中華蜜蜂傳統(tǒng)氣味受體基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

供試中華蜜蜂于2015年5月采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。

采樣方法：將即將羽化出房的工蜂巢脾從蜂場(chǎng)帶回實(shí)驗(yàn)室，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中使之繼續(xù)發(fā)育，待新蜂出房后，標(biāo)記蜜蜂若干頭(>3000頭)，隨后將蜜蜂隨機(jī)放入3個(gè)蜂箱中。從工蜂剛羽化出房開(kāi)始采樣，記為1日齡，之后每5 d取一次樣，共取7次，每次設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用鑷子分別取下各日齡工蜂的觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、足、翅，立即投入裝有液氮的研缽中，研磨至粉末狀，加入裝有1 mL RNAiso Plus的EP管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與試劑盒

Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix perfect Real Time)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、pMDTM19-T載體等分子生物學(xué)試劑均購(gòu)置北京華大基因技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本課題組前期獲得的中華蜜蜂觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，用Primer3 Plus在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)了2對(duì)AcerOr167基因的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)獲得的cDNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR的特異性引物，以西方蜜蜂肌動(dòng)蛋白Arp1基因(GenBank登錄號(hào)為NM_001185146.1)作為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物；試驗(yàn)所用引物均由北京六合華大基因技術(shù)有限公司(TaKaRa)合成。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 設(shè)計(jì)合成的引物及其用途

1.4 總RNA提取和cDNA的合成

根據(jù)Trizol RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)，提取工蜂各日齡各個(gè)組織的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以總RNA為模板、OligdT為引物合成第一鏈cDNA，用作RT-PCR、qRT-PCR模板。

1.5AcerOr167 PCR擴(kuò)增

以中華蜜蜂的觸角cDNA為模板，利用特異引物擴(kuò)增AcerOr167的cDNA序列。反應(yīng)體系(20 μL)：2×Es Taq MasterMix 10 μL，cDNA 2 μL，正向和反向引物各1 μL，RNase-Free Water 6 μL，混勻，短暫離心，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，50℃-58℃ 40 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃延伸8 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V，30 min)后，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)并拍照。

1.6 PCR產(chǎn)物的純化、克隆與測(cè)序

將上述PCR產(chǎn)物按照快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行產(chǎn)物的純化與回收。回收的目的片段與pMDTM19-T載體連接，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化步驟按照DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化說(shuō)明書(shū)操作，轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后，用玻璃棒將E.coli均勻涂抹到加有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日進(jìn)行藍(lán)白斑的篩選，隨機(jī)挑取單一白色菌斑于5 mL含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃ 200 rpm振蕩8-10 h。將陽(yáng)性菌送至北京華大基因技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用比較Ct值法的相對(duì)定量法，分析AcerOr167基因在中華蜜蜂工蜂羽化后不同發(fā)育階段和不同組織中的表達(dá)量。將反轉(zhuǎn)錄分別合成的7個(gè)日齡觸角、頭、胸、腹、足、翅膀的cDNA稀釋4倍后，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上、下游引物(10 μM)各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌超純水6 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火35 s，40個(gè)循環(huán)。所有樣品均重復(fù)3次。

1.8 序列分析

使用EXPASY(Expert Protein Analysis System，http://www.expasy.org)的翻譯工具將獲得的核酸序列翻譯成氨基酸序列，在NCBI中通過(guò)Blast方法進(jìn)行同源序列比對(duì)，找到與目的基因具有同源性的其他昆蟲(chóng)氣味受體。采用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用在線(xiàn)軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)域；使用在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)對(duì)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。采用Mega 5.2軟件中的Neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap進(jìn)行1000次重復(fù)構(gòu)建。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)2-ΔΔCT值比較AcerOr167基因在工蜂羽化后不同發(fā)育階段和不同組織的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用SPSS軟件中的單因素ANOVA方法進(jìn)行方差分析，并選用新復(fù)極差法(new multiple range method)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1AcerOr167基因的克隆

用設(shè)計(jì)的2對(duì)引物分別對(duì)中華蜜蜂AcerOr167基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序(圖1)，采用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得的中華蜜蜂AcerOr167 cDNA序列的長(zhǎng)度為1449 bp，其中ORF全長(zhǎng)1311 bp，編碼436個(gè)氨基酸。將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索比對(duì)(圖2)，發(fā)現(xiàn)與西方蜜蜂AmelOr167(GenBank登錄號(hào)XM_0011230564)編碼的氨基酸序列一致性最高，達(dá)94%，確定克隆得到中華蜜蜂AcerOr167的cDNA序列，并在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)為：KF239369。

圖1 AcerOr167的兩對(duì)特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification of two pairs of specific primers of AcerOr167 注：M，DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和2泳道分別為1051、529 bp。Note: M, DNA Marker; Lane 1 and 2 are 1051, 529 bp respectively.

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1AcerOr167蛋白的基本理化性質(zhì)分析

對(duì)中華蜜蜂AcerOr167編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，該蛋白分子量為50.238 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為8.85。AcerOr167蛋白包含20種常見(jiàn)的氨基酸，未發(fā)現(xiàn)有特殊的吡咯賴(lài)氨酸(Pyl)和硒代半胱氨酸(Sec)，其中異亮氨酸(Ile)的含量最多，為14.7%；半胱氨酸(Cys)含量最少，為1.1%；帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為31，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為37。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為36.94，脂溶系數(shù)為122.13，總平均疏水性系數(shù)為0.562，說(shuō)明AcerOr167蛋白的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，且為水溶性蛋白，親水性較強(qiáng)。

2.2.2AcerOr167蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

使用TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)AcerOr167蛋白具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)，且每?jī)蓚€(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間都含有一段在細(xì)胞膜外的親水序列，它們的氨基酸順序分別為第5-119、209-258、311-436位，在311-436位氨基酸處的親水序列最長(zhǎng)。AcerOr167蛋白的的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4)顯示α-螺旋(helix)占主導(dǎo)地位(74.77%)，其次是卷取環(huán)(loop)(22.71%)，β-折疊(strand)最少(2.52%)。

圖2 中華蜜蜂AcerOr167和西方蜜蜂AmelOr167編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of amino acid sequence between AcerOr167 and AmelOr167注：黑色陰影表示高度一致的殘基位點(diǎn)；灰色陰影表示保守性較高的殘基位點(diǎn)；缺失位點(diǎn)由點(diǎn)代替。Note: Identical amino acids are shaded in black, amino acids with higher identity are shaded in grey, and gaps are indicated by dots.

圖3 AcerOr167蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of transmembrane structure of AcerOr167 protein注：跨膜區(qū)1(28-50)；跨膜區(qū)2(120-142)；跨膜區(qū)3(186-208)；跨膜區(qū)4(259-281)；跨膜區(qū)5(288-310)。Note: Transmembrane region 1 (28-50); transmembrane region 2 (120-142); transmembrane region 3 (186-208); transmembrane region 4 (259-281); transmembrane region 5 (288-310).

圖4 PSIPRED軟件預(yù)測(cè)中華蜜蜂AcerOr167蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Prediction of the secondary structure of AcerOr167 protein from Apis cerana cerana by PSIPRED

2.3AcerOr167與其它膜翅目昆蟲(chóng)氣味受體的進(jìn)化樹(shù)分析

為進(jìn)一步確定中華蜜蜂AcerOr167與其他昆蟲(chóng)氣味受體的進(jìn)化關(guān)系，將AcerOr167氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blastp搜索，結(jié)果顯示只有膜翅目昆蟲(chóng)的氣味受體與目的基因具有較高的一致性(>45%)，在其他目類(lèi)下幾乎找不到同源基因，且中華蜜蜂AcerOr167與西方蜜蜂AmelOr167的氨基酸序列一致性最高，達(dá)94%，其次是迴條蜂HlabOr82a，為66%，與畢氏粗角蟻CbirOr4-like的氨基酸一致性最低，為49%。用Mega 5.2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，采用鄰接法經(jīng)1000次重復(fù)后，該進(jìn)化樹(shù)非常直觀(guān)的呈現(xiàn)中華蜜蜂AcerOr167與膜翅目其他昆蟲(chóng)之間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示，中華蜜蜂先與西方蜜蜂聚為一個(gè)小的分支，之后與迴條蜂、熊蜂、麥蜂聚為一個(gè)較大的分支，而法老蟻、大頭阿塔切葉蟻、小火蟻、畢氏粗角蟻則聚為另一大的分支，這表明中華蜜蜂與西方蜜蜂的親緣關(guān)系最近，與膜翅目其他昆蟲(chóng)的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖5 基于氨基酸序列構(gòu)建的AcerOr167與膜翅目其他昆蟲(chóng)氣味受體的進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of AcerOr167 and other known Hymenoptera Ors based on amino acid sequencesNote：AcerOr167, 中華蜜蜂Apis cerana cerana (KF239369); AmelOr167, 西方蜜蜂Apis mellifera (XP_001120564); BterOr4-like,地熊蜂 Bombus terrestris (XP_012168558); BimpOr4-like,熊蜂 Bombus impatiens (XP_012240156); HlabOr82a, 迴條蜂Habropoda laboriosa (KOC62874); MquaOr82a,麥蜂 Melipona quadrifasciata (KOX77416); MphaOr4-like,法老蟻 Monomorium pharaonis (XP_012527971); AcepOr4-like,大頭阿塔切葉蟻 Atta cephalotes (XP_012063162); WaurOr4-like,小火蟻 Wasmannia auropunctata (XP_011694618); CbirOr4-like, 畢氏粗角蟻Cerapachys biroi (XP_011333674).

2.4AcerOr167 mRNA的表達(dá)譜分析

以Arp1為校正參數(shù)，以10日齡工蜂頭部的AcerOr167表達(dá)量為基準(zhǔn)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算AcerOr167在工蜂羽化后不同發(fā)育階段(觸角中)和不同組織中的表達(dá)差異(圖6)。AcerOr167 mRNA在工蜂各組織中均有表達(dá)，且在觸角中的表達(dá)量極顯著高于其它組織(P<0.01)，在頭部和胸部的表達(dá)量相對(duì)較低，在腹、足和翅膀中的表達(dá)量非常低。1日齡時(shí)觸角的表達(dá)量是頭部的30倍左右，且頭部的表達(dá)量極顯著高于其他組織(P<0.01)，而胸、腹、足和翅膀之間差異不顯著(P>0.05)；5日齡時(shí)觸角的表達(dá)量是胸部的90倍左右，且胸部的表達(dá)量極顯著高于其它組織(P<0.01)，但頭、腹、足和翅膀之間差異不顯著(P>0.05)；10日齡時(shí)胸部的表達(dá)量?jī)H次于觸角，但頭、腹、足和翅膀之間差異不顯著(P>0.05)；15-30日齡頭部的表達(dá)量?jī)H次于觸角，而頭、胸、腹、足和翅膀之間差異不顯著(P>0.05)。AcerOr167 在各日齡成蜂的觸角均有表達(dá)，1日齡時(shí)表達(dá)量最低，之后在整個(gè)發(fā)育階段呈上升的趨勢(shì)；5日齡時(shí)表達(dá)量顯著升高，是1日齡表達(dá)量的3倍左右；10日齡和15日齡表達(dá)量又逐漸降低；20日齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到了整個(gè)發(fā)育階段的最高值，且極顯著高于其他各個(gè)日齡(P<0.01)。

圖6 AcerOr167 mRNA在中華蜜蜂不同發(fā)育階段、不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況Fig. 6 Ralative expressions of AcerOr167 mRNA in different developmental stages and different tissues of Apis cerana cerana注：An，觸角；H，頭(去除觸角)；T，胸(去除翅膀)；Ab，腹；L，足；W，翅膀；1-30 d，成年工蜂的日齡。柱上不同大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別表示不同組織和不同發(fā)育階段差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Note: An, Antenna; H, Head without antenna; T, Thorax without wings; Ab, Abdomen; L, Legs; W, Wings; 1-30 d, days of adult worker bees. Different uppercase letters and lowercase letters above bars indicate highly significant difference at the 0.01 level and significant difference at the 0.05 level respectively between different tissues and different developmental stages.

3 結(jié)論與討論

一般認(rèn)為，昆蟲(chóng)的氣味受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族(GPCRs)，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(Bentonetal.，2006)。而本研究所獲得的AcerOr167的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示只有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與Bengtsson等(2012)分析得到的在其它昆蟲(chóng)中傳統(tǒng)氣味受體可能具有4-8個(gè)跨膜域的結(jié)論相一致，說(shuō)明昆蟲(chóng)的氣味受體不完全具有7次跨膜結(jié)構(gòu)。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂AcerOr167與西方蜜蜂AmelOr167的氨基酸一致性最高，且在跨膜結(jié)構(gòu)域上存在高度保守性；與膜翅目不同屬其它昆蟲(chóng)的氨基酸一致性相對(duì)較低，但在昆蟲(chóng)其它目類(lèi)下幾乎找不到同源基因，這說(shuō)明傳統(tǒng)氣味受體在種間具有高度的變異，這可能與傳統(tǒng)氣味受體通過(guò)形成受體復(fù)合物，專(zhuān)一性識(shí)別并結(jié)合不同氣味分子的特點(diǎn)相關(guān)(Touharaetal.，2009)。

對(duì)于傳統(tǒng)氣味受體的表達(dá)研究已有大量報(bào)道，部分傳統(tǒng)氣味受體在成蟲(chóng)觸角中高表達(dá)甚至特異性表達(dá)，如海飛翅夜蛾SlitOr18在觸角中特異性表達(dá)(Brigandetal.，2009)；Wanner等(2007)通過(guò)研究家蠶BmOr1，BmOr3，BmOr4和BmOr5，結(jié)果表明，這些基因只在雄性家蠶觸角中特異性表達(dá)，推測(cè)它們可能屬于信息素受體；棉鈴蟲(chóng)HarmOr18和煙夜蛾HassOr18都只在觸角中表達(dá)，且在雄蛾觸角中的表達(dá)量高于雌蛾，推測(cè)二者可能參與了雄蛾的性信息素識(shí)別過(guò)程(張帥等，2009；張?jiān)嫉龋?013)。昆蟲(chóng)氣味受體主要在昆蟲(chóng)觸角的嗅覺(jué)感器神經(jīng)元中表達(dá)，在頭部的其他附肢、足、翅膀以及生殖器中也有少量表達(dá)(Kwonetal.，2006；Kokozaetal.，2010)。本試驗(yàn)熒光定量結(jié)果表明AcerOr167在工蜂各組織中均有表達(dá)，除了在觸角中的高表達(dá)外，在頭、胸、腹、足、翅膀中也有少量表達(dá)。因而，推測(cè)AcerOr167可能在嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)中起著重要的作用，但對(duì)AcerOr167在工蜂與雄蜂中的表達(dá)差異有待進(jìn)一步研究。

對(duì)家蠶的66個(gè)氣味受體研究顯示，不同氣味受體在不同的發(fā)育階段和嗅覺(jué)附器中的表達(dá)有明顯的差異，并且具有不同的功能(Tanakaetal.，2009)。馬龍等(2014)發(fā)現(xiàn)MmedOr2在中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂交配后表達(dá)量顯著降低，推測(cè)可能與接受雄性求偶時(shí)釋放的性信息素和尋找寄主產(chǎn)卵等雌蜂特有的行為有關(guān)。蜜蜂是一種高度的社會(huì)性昆蟲(chóng)，其行為與其發(fā)育階段密切相關(guān)，如18日齡以前為內(nèi)勤蜂，內(nèi)勤蜂是蜂群中的幼、青年工蜂，主要以釀蜜、飼喂幼蟲(chóng)和蜂王、清理巢房、夯實(shí)花粉等工作為主；18日齡以上為采集蜂，主要承擔(dān)采蜜、采粉、采膠、采水及巢門(mén)防衛(wèi)工作(Bersheretal.，2001)。本研究中AcerOr167在工蜂整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，且20日齡時(shí)表達(dá)量最高，在采集蜂時(shí)期的表達(dá)量普遍高于內(nèi)勤蜂時(shí)期，推測(cè)AcerOr167可能與蜜蜂外出采集，識(shí)別花香氣味有關(guān)。昆蟲(chóng)傳統(tǒng)氣味受體間的功能分化很大，即使同一物種氣味受體基因的表達(dá)特性也很難進(jìn)行橫向比較，如趙慧婷等(2014)推測(cè)AcerOr1和AcerOr3是位于同一條染色體上呈串聯(lián)排列的兩個(gè)重復(fù)基因，但從熒光定量結(jié)果看，在工蜂不同發(fā)育階段的表達(dá)存在較大差異，因而不同的傳統(tǒng)氣味受體可能具有不同的表達(dá)模式并執(zhí)行不同的功能。

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Cloning and expression analysis of odorant receptor geneAcerOr167 in the Chinese honeybee,Apisceranacerana(Hymenoptera: Apidae)

DU Ya-Li1*, PAN Jian-Fang1*, WANG Shu-Jie1, YANG Shuang2,ZHAO Hui-Ting3, JIANG Yu-Suo1**

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi Province, China; 2.Institute of Sericulture and Apiculture, Yunnan Academy of Agriculture Sciences, Mengzi 661101, Yunnan Province,China; 3.College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi Province, China)

In this study, the cDNA sequence of the odorant receptor geneOr167 fromApisceranaceranawas cloned by RT-PCR，and the relative expression of this gene at different developmental stages (1, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 days) and in different tissues (antennae, head(without antennae), thorax, abdomen, legs and wings) ofA.c.ceranawere profiled by qRT-PCR. The cDNA sequence of theOr167 was obtained and named asAcerOr167(GenBank accession number: KF239369), the open reading frame ofAcerOr167 is 1311 bp, encoding 436 amino acid residues, and homology analysis showed that the amino acid sequences ofAcerOr167 contain five-transmenbrane domains. The multiple alignment and phylogenetic tree analyses showed thatAcerOr167 shared the highest identity of 94% withAmelOr167, and shared the lowest identity of 49% withCbirOr4-like. The results of qRT-PCR showed thatAcerOr167 was clearly detected in different tissues at different developmental stages of adult workers. The expression ofAcerOr167 in the antennae was significantly higher than other tissues (P<0.01), and the slight expression was detected in head(without antennae), thorax, abdomen, legs and wings. From the expression level ofAcerOr167 in every developmental stages, expression was lowest in the 1st, expression increased significantly in the 5thand reached the highest in the 20th. The expression ofAcerOr167 in 20thwas significantly higher than other days.AcerOr167 may play an important role in the olfactory system ofA.c.cerana, and was closely related to the behavior that Chinese honeybee collect pollen and identify the fragrance of flowers. This findings will provide theoretical basis for further functional study of the traditional odorant receptor genes.

Apisceranacerana;AcerOr167; gene cloning; qRT-PCR; expression profile

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31502021，31272513)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2014012)

Received：2016-07-21；接受日期A(yíng)ccepted：2016-08-21

Q963;S89

A

1674-0858(2017)01-0039-09

杜亞麗，潘建芳，王樹(shù)杰，等.中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr167的克隆及表達(dá)分析[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017,39(1):39-47.

*共同第一作者簡(jiǎn)介：杜亞麗，1991年生，在讀博士，研究方向?yàn)槊鄯渖飳W(xué)，E-mail：duyali2000@yeah.net； 潘建芳，1989年生，碩士，研究方向?yàn)槊鄯渖飳W(xué)，E-mail:18404966390@163.com

**通訊作者Author for correspondence，E-mail：jiangys-001@163.com