董愛軍,楊 鑫,張英春,張 華,井 晶

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

反相高效液相色譜法測定牦牛乳中的B族維生素含量

董愛軍,楊 鑫*,張英春,張 華,井 晶

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

建立了同時測定牦牛乳中維生素B1、B2、B3、B6、B12的高效液相色譜法,樣品經(jīng)離心脫脂,高氯酸除蛋白后,采用反相色譜柱分離,DAD檢測器檢測,外標(biāo)法定量。色譜柱為C18柱(25 mm×4.6 mm,i.d.5 μm),流動相為0.023 mol/L H3PO4溶液(pH3.54)和甲醇,采用梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長270 nm。結(jié)果表明:維生素B2、B3在0.1～50.0 mg/L,維生素B1、B6、B12在0.5～250.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均為0.999。5種B族維生素的平均回收率為90.6%～98.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為2.0%～4.3%,在牦牛乳中的檢出限為0.01～0.09 mg/L,定量下限為0.03～0.29 mg/L。本方法樣品處理簡單,分析速度快,準(zhǔn)確度和精密度高,能夠滿足快速分析需要。

牦牛乳,水溶性維生素,維生素B,高效液相色譜

維生素是重要的營養(yǎng)素,在維持機(jī)體代謝和某些特殊功能方面發(fā)揮著重要作用。其中B族維生素是很多重要酶的輔酶,缺乏將會導(dǎo)致與之相關(guān)的某些疾病的發(fā)生[1-2]。由于B族維生素人體不能合成,必須從食物中攝取[3],因此測定食品中B族維生素的含量對評價其營養(yǎng)價值有重要的意義。

B族維生素測定方法主要有光譜法[4-5]、色譜法和色質(zhì)聯(lián)用法[6-7]、電化學(xué)法[8-9]、生物學(xué)法[10]等,其中高效液相色譜法以其分離效率高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),在B族維生素分析測定,特別是多組分分析測定方面有著廣泛的應(yīng)用[11-14]。牦牛乳是一種營養(yǎng)價值極高的動物乳汁[15],目前對其營養(yǎng)成分組成分析研究較多是蛋白質(zhì)、脂肪酸和維生素等[16-18],其中B族維生素分析測定時,樣品處理方法常用的是高溫高壓水解及酶解,該處理方法復(fù)雜費(fèi)時,而且高溫高壓也會造成部分B族維生素的損失。為了縮短分析時間,減少B族維生素的損失,本實驗建立了一種簡單、快速測定牦牛乳中B族維生素的高效液相色譜方法,樣品只需脫脂和除蛋白,即可進(jìn)行色譜分析,20 min內(nèi)即可測定出牦牛乳中維生素B1、B2、B3、B6、B12的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素B1(鹽酸噻胺)、B2(核黃素)、B3(煙酸)、B6(鹽酸吡哆辛)、B12(氰鈷胺) Sigma公司;甲醇、磷酸 為色譜純;高氯酸 為分析純;實驗用水 為18.2 MΩ·cm的高純水。

Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司,配備四元梯度泵,100位自動進(jìn)樣器,二極管陣列檢測器(DAD);冷凍離心機(jī) 德國Hettich公司;旋渦混勻器 海門市其林貝爾儀器公司;Millipore purification system超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,i.d. 5 μm);柱溫25 ℃;檢測波長270 nm;進(jìn)樣量20 μL;流動相:A為0.023 mol/L H3PO4溶液(pH3.54),B為甲醇,采用梯度洗脫,流速0.5 mL/min。梯度洗脫程序為:流動相B的初始比例為25%(v/v),保持5 min;1 min內(nèi)流動相B由25%線性增加至40%,保持12 min;1 min內(nèi)流動相B由40%線性降至25%,保持5 min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將5種B族維生素標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水分別配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,并于-20 ℃避光儲存。準(zhǔn)確吸取B2、B3標(biāo)準(zhǔn)儲備液各10 mL,B1、B6、B12標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 mL,混合并定容至100 mL,配制成B2、B3質(zhì)量濃度分別為100 mg/L,B1、B6、B12濃度為500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)母液,于-20 ℃避光儲存。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)母液逐級稀釋,配制成B2、B3濃度分別為0.1、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L,B1、B6、B12濃度為0.5、2.5、5、10、25、50、100、250 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋,并注意避光。

1.4 樣品處理

牦牛乳在2500 r/min,4 ℃下離心10 min脫脂,取1 mL脫脂后的牦牛乳樣品,加入1 mL 7.2%的高氯酸,漩渦混勻,然后于4000 r/min,4 ℃下離心15 min。上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后,上機(jī)分析。全部操作過程需在避光下進(jìn)行。

1.5 定性定量方法

5種B族維生素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.2的色譜條件進(jìn)行分析,以各化合物的峰面積對質(zhì)量濃度繪制工作曲線,并進(jìn)行線性回歸。處理后的牦牛乳樣品在相同的色譜條件下分析,每個樣品重復(fù)2次,以保留時間定性,外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法確定

B族維生素不穩(wěn)定,光、金屬離子、高溫及堿性條件下很容易被破壞,因此在測定食品中維生素B的含量時,樣品處理方法、處理時間會直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常的樣品處理方法是高溫高壓水解及酶解[18],但該方法復(fù)雜費(fèi)時,乳制品中的主要干擾成分是脂肪和蛋白質(zhì),可以采用有機(jī)溶劑除去二者[19]。本實驗采用離心脫脂和高氯酸沉淀蛋白,考察了離心轉(zhuǎn)速和離心時間以及高氯酸添加量對測定的影響。結(jié)果表明牦牛乳樣品在2500 r/min,4 ℃下離心10 min,可除去85%以上的脂肪。高氯酸按料液比1∶1添加,處理后的上清液清澈透明,色譜圖雜峰少(見圖1B),5種維生素B的回收率均高于90%。本處理方法操作簡單、條件溫和,不僅節(jié)約分析時間,而且B族維生素在酸性條件下穩(wěn)定,損失少,測定結(jié)果的準(zhǔn)確性提高。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 洗脫方法選擇及優(yōu)化 本實驗研究了等度和梯度兩種洗脫方法的分離效果,并對梯度洗脫方法進(jìn)行了優(yōu)化。等度洗脫時,B1、B6拖尾嚴(yán)重,導(dǎo)致B1、B6、B3分不開,雖然降低甲醇的比例,分離度稍有改善,但B2的出峰時間延長至30 min以后。為了改善分離效果,縮短分析時間,本實驗采用梯度洗脫,優(yōu)化后的梯度洗脫程序為:0.023 mol/L H3PO4與甲醇的初始比例為75%∶25%(V∶V),保持5 min;1 min內(nèi)甲醇線性增加至40%,保持12 min;1 min內(nèi)甲醇線性降低至25%,保持5 min。采用此梯度洗脫程序,全部分析時間(包括柱平衡時間)僅為24 min。圖1為該洗脫條件下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和牦牛乳樣品的色譜圖。

圖1 B族維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和牦牛乳樣品(B)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of vitamin B standard mixture(A)and yak milk(B)

2.2.2 流動相流速優(yōu)化 本實驗考查了流動相流速對分離效果和分析時間的影響。流速大于0.5 mL/min時,雖然B2的保留時間縮短,但B1、B6、B3的分離效果很差。當(dāng)流速為0.5 mL/min,不僅B1、B6、B3的分離效果得到改善,而且B2的保留時間為18.6 min,20 min內(nèi)即可完成5種B族維生素的分離分析。

表1 B族維生素的回歸方程、線性范圍、檢出限與定量下限Table 1 Regression equations,linear ranges,limit of detection(LOD)and limit of quantitation(LOQ)of vitamin B

表2 牦牛乳中5種B族維生素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 2 Recoveries and RSD of vitamin B in yak milk(n=3)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.2的色譜條件進(jìn)行分析,以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X,mg/L),建立工作曲線并進(jìn)行線性回歸。按3倍信噪比(S/N)確定本方法的檢出限(LOD),10倍信噪比(S/N)確定本方法的定量下限(LOQ),結(jié)果見表1。5種B族維生素工作曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)均為0.999,線性關(guān)系良好。 該5種B族維生素在牦牛乳中的檢出限為0.01～0.09 mg/L,定量下限為0.03～0.29 mg/L。

2.4 回收率與精密度

在牦牛乳樣品中,按低、中、高3個濃度水平添加維生素B標(biāo)樣,每個水平重復(fù)3次,進(jìn)行回收率和精密度實驗,結(jié)果見表2。牦牛乳中5種B族維生素的平均回收率為90.6%～98.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～4.3%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度較高,能夠滿足實際檢測的需要。

2.5 B族維生素的穩(wěn)定性

將維生素B混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫避光、4 ℃避光、-20 ℃避光三種條件下放置,每隔6 h測定一次峰面積,連續(xù)測定48 h。三種條件下,5種維生素B的峰面積的RSD均小于2.3%,表明該5種維生素B在實驗時間范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.6 實際樣品的測定

采用本實驗建立的方法,測定了6批次牦牛乳樣品中的B族維生素的含量,每個樣品重復(fù)3次,B1、B2、B3、B6、B12的平均含量分別為68.38、1.64、3.32、9.54、2.95 mg/L。B2和B3與文獻(xiàn)報道的水平接近,B1和B6高于文獻(xiàn)報道的水平[18,20],原因在于本實驗的牦牛乳樣品來自四川阿壩州,而不同地區(qū)的牦牛乳的營養(yǎng)成分含量是有差異的[21],另外B1是B族維生素中最不穩(wěn)定的一種[20],B6易光解和熱解,而本實驗的樣品處理條件溫和,30 min內(nèi)即可完成樣品處理,維生素?fù)p失少。

3 結(jié)論

B族維生素是重要的營養(yǎng)素,在維持機(jī)體代謝和生長發(fā)育方面有重要的作用。本研究建立了同時測定牦牛乳中B族維生素的方法,樣品經(jīng)離心脫脂,高氯酸沉淀蛋白后,利用反相色譜柱分離,DAD檢測器檢測,可同時對B1、B2、B3、B6、B12進(jìn)行定量分析。該方法樣品處理簡單、分析時間短、靈敏、準(zhǔn)確,適合牦牛乳中B族維生素的快速檢測。

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Determination of vitamin B in yak milk by reversed phase high performance liquid chromatography method

DONG Ai-jun,YANG Xin*,ZHANG Ying-chun,ZHANG Hua,JING Jing

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

A method was developed for the determination of vitamin B1,B2,B3,B6,B12in yak milk by reversed phase high performance liquid chromatography method. After derosination by centrifugation and deproteinization with perchloric acid,the sample was separated on a C18column(250 mm×4.6 mm,i.d.5 μm)at 25 ℃. A gradient programme was carried out using 0.023 mol/L H3PO4(pH3.54)and methyl alcohol as elution solvent at a flow rate of 0.5 mL/min. The response signal was detected at 270 nm. The results showed that vitamin B1,B2,B3,B6,B12could be separated within 20 min. The calibration curves were linear in the ranges of 0.1～50.0 mg/L for vitamin B2,B3,and 0.5～250.0 mg/L for vitamin B1,B6,B12with correlation coefficient of 0.999. The spiked recoveries of vitamin B in yak milk were in the range of 90.6%～98.4% with the relative standard deviations(RSDs)of 2.0%～4.3%. The limits of detection(LODs)of five vitamin B in yak milk were in the range of 0.01～0.09 mg/L,the limits of quantitation(LOQs)were 0.03～0.29 mg/L. The developed method was sensitive and precise,which could meet the demands of rapid analysis.

yak milk;water-soluble vitamins;vitamin B;high performance liquid chromatography

2016-07-28

董愛軍(1969-)，女，碩士，副教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：daj@hit.edu.cn。

*通訊作者:楊鑫(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：yangxin@hit.edu.cn。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)03-0314-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.052