和 磊,羅 婧,王亞蕓,石玉杰,任建武,*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,北京 100191)

和 磊1,2,羅 婧1,王亞蕓1,石玉杰2,任建武1,*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,北京 100191)

目的:研究金釵石斛脂溶性生物堿提取物對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞生長的抑制作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法:MTT法檢測金釵石斛脂溶性生物堿提取物對HT-29細(xì)胞存活率的影響,Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)活性氧水平、線粒體膜電位、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率變化;蛋白免疫印跡檢法測蛋白Caspase-3,9和胞內(nèi)細(xì)胞色素C的表達(dá)。結(jié)果:金釵石斛脂溶性生物堿提取物能降低HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞存活率,呈劑量和時間效應(yīng),48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.72 mg/mL;金釵石斛脂溶性生物堿提取物能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡,并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2期;金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘使線粒體膜電位降低,胞內(nèi)活性氧濃度升高;激活型Caspase-9,3與胞內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá)水平增高。結(jié)論:金釵石斛脂溶性生物堿提取物對HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的生長具有抑制作用并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其可能通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

金釵石斛,脂溶性生物堿,HT-29細(xì)胞,細(xì)胞凋亡,活性氧

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是一種對人類威脅巨大的高發(fā)惡性腫瘤,其發(fā)病率近年來呈逐年上升趨勢,在全球惡性腫瘤發(fā)病率中居第三位,死亡率居第二位,世界范圍內(nèi)每年大約有100萬新增結(jié)腸癌患者[1-2]。目前結(jié)腸癌的治療主要以手術(shù)為主,但術(shù)后復(fù)發(fā)率高,5年生存率較低,僅為50%左右[3-4],尚無其他有效的療法。

基于天然產(chǎn)物的抗腫瘤新藥研發(fā)一直是近年來研究的熱點,天然產(chǎn)物中的活性成分通過抑制增殖或誘導(dǎo)凋亡等方式殺死腫瘤細(xì)胞,臨床常用的抗腫瘤藥物紫杉醇、三尖杉等就是以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)研發(fā)的[5-6]。金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl)為蘭科石斛屬植物,其主要化學(xué)成分包括生物堿類、多糖類等,其中又以石斛堿含量最高是其特征性成分[7-8]。生物堿具有降血糖、抗腫瘤、解熱止痛等功效,以往研究中發(fā)現(xiàn),金釵石斛生物堿在減緩大鼠糖性白內(nèi)障癥狀[9]減輕腦部的缺血性損傷[10]等方面有良好應(yīng)用。近年來其抗腫瘤作用越來越受到重視,研究表明金釵石斛生物堿能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-12]。但目前尚未有金釵石斛脂溶性生物堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29作用的報導(dǎo),因此本文探究了金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及可能機(jī)制,以期為合理開發(fā)利用石斛屬資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HT-29人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS) 美國Hyclone公司;RPMI-1640培養(yǎng)液 美國Gibco公司;MTT、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、Hoechst 33342、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、DCFH-DA活性氧檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、抗Caspase-3,9抗體、抗Cytochrome C 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L) 碧云天生物試劑公司;BCA試劑盒 南京建成生物科技有限公司;PI(碘化丙啶) 北京邁晨科技有限公司;RNA酶 北京索萊寶科技有限公司。

311氣套式細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;CKX31-A12PHP倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司;TD25-WS臺式離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表公司;DYY-10C電泳儀、DYCZ-20電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化,傳代。

1.2.2 金釵石斛脂溶性生物堿的制備 金釵石斛脂溶性生物堿的提取參照文獻(xiàn)[13-15],切片、干燥(75 ℃,48 h)、磨粉,80%(v/v)乙醇85 ℃回流提取4次,每次3.5 h,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃回收乙醇,得到濃縮水液,旋蒸儀90 ℃蒸干濃縮水液水分,得到黑色浸膏,5%鹽酸溶解浸膏,過濾酸水液,在過濾后的酸水液里加入NaCl,再次過濾,氯仿萃取二次過濾后的酸水液,萃取比例為酸水液∶氯仿(3∶1(v/v)),萃取8～10次。合并氯仿層,旋蒸儀回收氯仿。用純凈水將回收至小體積的氯仿層洗至中性,水洗比例為氯仿∶水(3∶1(V/V)),水洗 10次。合并水洗后的氯仿層,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃回收氯仿后即得脂溶性生物堿提取物。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞存活率 將對數(shù)期的HT-29細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×104/孔),每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔,貼壁后加入終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mg/mL的金釵石斛脂溶性生物堿提取物,分別培養(yǎng)24 h和48 h;吸去培養(yǎng)液,加入20 μL MTT溶液(5.0 mg/mL),37 ℃溫育4 h,棄去上清液,每孔加入100 μL溶解液,室溫繼續(xù)孵育。結(jié)晶全部溶解后,測定570 nm處OD值,計算細(xì)胞存活率:

存活率(%)=(實驗組OD值/空白組OD值)×100。

計算IC50:IC50=lg-1[Pm-n(∑ S-0.5)]

Pm:設(shè)計的最大加藥濃度對數(shù)值;n:為相鄰濃度對數(shù)值之差;∑ S:為各組生長抑制率之和;0.5為經(jīng)驗常數(shù)。

1.2.4 Hoechst 33342染色 將HT-29細(xì)胞接種于35 mm共聚焦小皿上(3×105/皿),細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8和1.6 mg/mL),處理16 h后吸去培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,加入預(yù)冷0.5 mL 4%多聚甲醛,室溫固定30 min,PBS洗滌3次,加入500 μL Hoechst 33342染液染色(2 μg/mL),4 ℃染色30 min,PBS洗滌2次,加400 μL PBS,倒置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 Annexin-V/PI法檢測細(xì)胞凋亡率 將對數(shù)期HT-29細(xì)胞接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(6×105/皿),細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL),48 h后收集細(xì)胞。800 r/min室溫離心3 min。PBS重懸細(xì)胞,收集1×105細(xì)胞,加入200 μL的Binding Buffer(緩沖液)懸浮細(xì)胞,加入10 μL Annexin V-FITC混勻,4 ℃孵育30 min,加入5 μL PI染液,室溫、避光染色5 min,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位 將HT-29細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3×105/孔),細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集6×105個細(xì)胞,0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸,加入0.5 mL JC-1染色工作液,混勻,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min,使用JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞3次。用適量的JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.7 胞內(nèi)活性氧水平的檢測 將對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中(5×105/皿),細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8和1.6 mg/mL)。處理48 h后,消化收集細(xì)胞,800 r/min室溫離心5 min,棄上清。用PBS重懸細(xì)胞。加入1 mL DCFH-DA(10 μmol/L),37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。加入500 μL PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平變化。

1.2.8 金釵石斛脂溶性生物堿對細(xì)胞周期的影響 將對數(shù)期的HT-29細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中(2×106/皿),細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的金釵石斛脂溶性生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞,于800 r/min室溫離心3 min,用PBS洗滌細(xì)胞2次,收集1×106個細(xì)胞,離心去上清PBS,用70% 冰乙醇混勻固定,4 ℃保存過夜。2000 r/min 室溫離心5 min,去除乙醇,PBS洗滌細(xì)胞2次。加入100 μL RNase A,并于37 ℃水浴30 min;加入400 μL PI染液,4 ℃避光染色30 min,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.9 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將對數(shù)期的HT-29細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(3×106/皿),細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度金釵石斛生物堿提取物(0、0.4、0.8、1.6 mg/mL),48 h后消化收集細(xì)胞,800 r/min室溫離心3 min,去上清,加入200 μL PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,BCA法測樣品蛋白濃度,以12% SDS-PAGE分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,ECL法通過X-光片曝光顯影從而檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,經(jīng)金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理24 h后,隨著脂溶性生物堿提取物濃度的增加,HT-29細(xì)胞的存活率由93.32%±2.73%下降至49.65%±3.34%;處理48 h后,細(xì)胞存活率由91.49%±1.69%下降至28.19%±1.17%;并求得48 h的IC50為0.72 mg/mL。表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物對細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用,具有明顯的時間與濃度效應(yīng)關(guān)系。

圖1 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the survival rate of HT-29 cells

2.2 金釵石斛脂溶性生物堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

如圖2所示,圖中箭頭指示破碎細(xì)胞核,可見正常組細(xì)胞細(xì)胞核完整,少見凋亡小體產(chǎn)生,表明凋亡細(xì)胞數(shù)目較少;而經(jīng)0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿處理 48 h和Hoechst 33342染色后,HT-29細(xì)胞豐潤,細(xì)胞核固縮、碎裂成小塊,凋亡小體隨著處理濃度增加而增多,并呈濃度依賴性。結(jié)果表明,金釵石斛脂溶性生物堿提取物能夠誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the cell morphology of HT-29 cells

2.3 金釵石斛脂溶性生物堿對細(xì)胞凋亡率影響

圖3 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on apoptosis rate of HT-29 cells

如表1所示，與對照組(7.11%±0.27%)相比，0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理組細(xì)胞的凋亡率顯著升高(p<0.01)，分別為13.92%±0.18%、24.74%±0.33%和33.34%±0.38%，進(jìn)一步證實金釵石斛脂溶性生物堿能有效誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。

表1 金釵石斛脂溶性生物堿處理對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29凋亡率的影響Table 1 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on apoptosis rate of HT-29 cells(Mean±SD)

注:*p<0.05,**p<0.01,與空白組比較。

2.4 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-l是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)ΔΨm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中,產(chǎn)生紅色熒光;線粒體膜電位降低時,JC-1以單體形式存在于胞漿中,發(fā)出綠色熒光,因此可通過熒光顏色的強(qiáng)度比值轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化[16-17]。如圖4所示,與空白對照組相比,經(jīng)0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿處理48 h后,HT-29細(xì)胞中紅綠熒光強(qiáng)度比值分別為295.49±4.66、262.2±7.28和173.39±3.59,與空白對照組318.54±3.24比較,差異極顯著(p<0.01),表明HT-29細(xì)胞線粒體膜電位隨著加入金釵石斛脂溶性生物堿濃度升高而降低。以上結(jié)果表明,金釵石斛脂溶性生物堿能誘使HT-29細(xì)胞線粒體膜電位降低。

圖4 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the mitochondrial membrane potential in HT-29 cells

2.5 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

活性氧(ROS)是細(xì)胞內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物,在生物系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著雙重作用。實驗中利用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行胞內(nèi)活性氧檢測,DCFH-DA本身沒有熒光,可以穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH本身無熒光,細(xì)胞內(nèi)的活性氧進(jìn)一步氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度值變化來檢測胞內(nèi)活性氧水平的改變[18-19]。如圖5所示,經(jīng)0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理48 h后,胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度水平分別為60.5±2.68、78.62±4.75、92.84±5.99,與空白對照組(26.54±8.54)相比差異極顯著(p<0.01),呈濃度依賴性。結(jié)果表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物能誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS水平升高。

圖5 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平的影響Fig.5 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the level of intracellular reactive oxygen species in HT-29 cells

2.6 金釵石斛脂溶性生物堿對細(xì)胞周期分布影響

細(xì)胞周期的調(diào)控是細(xì)胞凋亡過程中一個重要因素,流式細(xì)胞儀檢測金釵石斛脂溶性生物堿提取物對細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響。如圖6所示,經(jīng)0.4、0.8和1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理48 h后的HT-29細(xì)胞G2期比例逐漸升高,其G2期比例分別為29.69%±1.89%,59.7%±2.86%和89.64%±4.64%,均顯著高于對照組(15.69%±2.96%)(p<0.01),出現(xiàn)明顯的G2期阻滯,呈劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明金釵石斛脂溶性生物堿能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞G2期阻滯從而抑制細(xì)胞生長。

圖6 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effects of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on the cell cycle distribution in HT-29 cells

2.7 金釵石斛脂溶性生物堿對HT-29細(xì)胞內(nèi)Caspase-3,9和細(xì)胞色素 C表達(dá)的影響

為進(jìn)一步闡明金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,經(jīng)0.4、0.8、1.6 mg/mL金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理HT-29細(xì)胞48 h后,Western blot檢測細(xì)胞Caspase-3,9和細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)量變化。結(jié)果如圖7所示,Cyt C為促凋亡因子,正常細(xì)胞中的Cyt C主要定位于線粒體,細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)水平很低,細(xì)胞受到藥物刺激后從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20],經(jīng)脂溶性生物堿處理后,胞質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平升高。Caspase蛋白是重要的凋亡執(zhí)行者,在正常細(xì)胞中處于非活化的酶原(Procaspase)形式,Procaspase酶原被剪切為激活型Caspase(Cleaved caspase)時近一步切割相應(yīng)底物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]。由圖7中結(jié)果可知隨著藥物處理濃度增加激活型Caspase-3(Cleaved caspase-3)與Caspase-9(Cleaved caspase-9)表達(dá)升高,呈濃度依賴效應(yīng),表明Caspase-9,3被剪切激活,而空白對照組未見激活型Caspase活性片段,表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)促凋亡蛋白細(xì)胞色素C表達(dá)量及剪切激活Caspase-3,9活性有關(guān)。

圖7 金釵石斛脂溶性生物堿對Caspase-3,9和細(xì)胞色素C表達(dá)影響Fig.7 Impacts of fat-soluble alkaloids extracted from Dendrobium Nobile Lindl on protein expression of Caspase3,9 and Cyt C

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是在多種調(diào)控因子共同作用下發(fā)生的,是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制之一[22]。很多抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生療效,目前已將藥物是否能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為藥物是否具有抗腫瘤效應(yīng)來進(jìn)行新藥物的研發(fā)的前提[23]。細(xì)胞凋亡同時是一個細(xì)胞自我破壞的生理過程,大致分為外部死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。線粒體是細(xì)胞生命活動的控制中心,不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心,而且也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition,MPT)及線粒體膜電位改變更是在線粒體細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。ROS濃度增加可以誘發(fā)氧化應(yīng)激引起線粒體損傷,進(jìn)而使線粒體膜電位降低同時增強(qiáng)線粒體膜的通透性[24-25],促使細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt c)等促凋亡因子從線粒體釋放到胞漿中[26]。大量研究表明,Cyt c等凋亡相關(guān)因子從線粒體釋放到胞漿中是線粒體凋亡途徑細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟,Cyt c及凋亡相關(guān)因子釋放到胞漿后,細(xì)胞色素C與胞漿內(nèi)的一種凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1結(jié)合,進(jìn)而與線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白Caspase-9酶原結(jié)合,Caspase-9位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)最上游,是重要的凋亡始動子,Caspase-9酶原活化后,激活Caspase-3酶原從而進(jìn)一步激活下游細(xì)胞凋亡通路[27-29],最終凋亡發(fā)生。實驗中經(jīng)金釵石斛脂溶性生物堿提取物處理的細(xì)胞中檢測到凋亡小體,表明金釵石斛脂溶性生物堿能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也檢測到胞內(nèi)活性氧濃度升高,線粒體膜電位降低,同時Cyt c與被剪切為17KD的Cleaved caspase-3,37KD的Cleaved caspase-9激活型分子片段表達(dá)增加,表明金釵石斛脂溶性生物堿提取物可能是通過誘使胞內(nèi)活性氧濃度升高引起線粒體損傷,進(jìn)而引起線粒體膜電位降低,促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。

綜上所述,本研究表明,金釵石斛脂溶性生物堿提取物能顯著降低HT-29細(xì)胞存活率,且呈濃度時間效應(yīng);同時,金釵石斛脂溶性生物堿提取物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期阻滯于G2期,提高胞內(nèi)活性氧濃度,使線粒體膜電位降低,促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放,進(jìn)而激活Caspase-3、9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上所述,金釵石斛脂溶性生物堿提取物凋亡誘導(dǎo)機(jī)制可能涉及線粒體凋亡途徑的激活,但其詳細(xì)凋亡調(diào)控機(jī)理尚需進(jìn)一步實驗研究。

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Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl induced apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells

HE Lei1,2,LUO Jing1,WANG Ya-yun1,SHI Yu-jie2,REN Jian-wu1,*

(1.College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.School of Pharmaceutical science,Peking University Health Science Center,Beijing 100191,China)

Objective:Anti-growth effects of fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl on human colorectal cancer HT-29 cells and its possible apoptotic mechanism were studied. Methods:The MTT assay was used to assess the effect of fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl on survival rate of HT-29 cells;the morphological changes of HT-29 cells were observed with Hoechst 33342 staining;the levels of intracellular reactive oxygen species(ROS),mitochondrial membrane potential(ΔΨm),cell cycle distribution and apoptosis rate were studied using flow cytometry;western blotting analysis was used to detect the expressions of Caspase-9,3,and intracellular cytochrome C. Results:Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl decreased survival rate of human colorectal cancer HT-29 cells in a dose-and time-dependent manner;IC50value for 48 h was 0.72 mg/mL. Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl induced cell apoptosis and cell cycle was arrested in G2 phase;it caused decline of ΔΨm and induced ROS accumulation with increased expression levels of apoptotic proteins such as activated Caspase-9,activated Caspase-3,and level of intracellular cytochrome C. Conclusion:Fat-soluble alkaloids extracted fromDendrobiumNobileLindl can inhibit the growth of HT-29 cells and induce cell apoptosis,which may be associated with the involvement of the mitochondria-mediated apoptotic pathway.

DendrobiumNobileLindl;fat-soluble alkaloids;HT-29 cells;apoptosis;reactive oxygen species

2016-09-12

和磊(1990-)，男，碩士研究生，研究方向： 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：18701590313@163.com。

*通訊作者:任建武(1967-)，男，博士，副教授， 研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：jianwur@sina.com。

國家自然科學(xué)基金項目(31572149)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.024