呂耀龍,李少英,趙春杰,包丹丹

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014109:2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌的耐藥性及gyrA基因分析

呂耀龍1,李少英2,*,趙春杰1,包丹丹1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014109:2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

本研究以內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中分離的16株乳酸菌為研究對(duì)象,采用紙片擴(kuò)散法對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素四種抗菌藥進(jìn)行耐藥性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:93.75%的菌株對(duì)氧氟沙星和鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,100%的菌株對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星表現(xiàn)為耐藥;耐藥菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增、gyrA基因編碼的氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)有1株乳酸菌的耐藥性與gyrA基因突變有關(guān)。

乳酸菌,耐藥性檢測(cè),gyrA基因分析

內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中富含乳酸菌資源,這些菌種在食品業(yè)、飼料業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1]。乳酸菌有著較長的安全使用歷史,近年來研究表明,抗生素在醫(yī)藥、飼料等行業(yè)使用泛濫,導(dǎo)致微生物耐藥問題日趨嚴(yán)重,致使人們?cè)趹?yīng)對(duì)微生物性疾病時(shí)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。有研究表明,臨床分離的細(xì)菌中有近50%～70%的乳酸菌對(duì)氟喹諾酮類藥物表現(xiàn)出耐藥性[3-4]。

乳酸菌對(duì)喹諾酮類的氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氨基糖苷類的鏈霉素四種抗菌藥物表現(xiàn)為較高的耐藥率,但也存在一定的差異性[3-8]。四種抗菌藥物在不明確菌株耐藥機(jī)理的情況下盲目研究其耐藥性防控乃至用于生產(chǎn)實(shí)踐,將造成后續(xù)工作的不確定性。乳酸菌耐藥機(jī)理之一是拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變介導(dǎo),Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶(主要是DNA旋轉(zhuǎn)酶)是喹諾酮類等藥物的作用靶位,DNA旋轉(zhuǎn)酶組成之一是gyrA基因編碼A亞基[5]。本文旨在研究內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素四種抗菌藥物的耐藥性和耐藥機(jī)理gyrA基因分析,為乳酸菌選育提供了方向、耐藥機(jī)理研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 來自內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中分離純化保存的菌種,共16株,分別為:DM1、DM2、DM3、DM4、DM6、DM8、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18、DM19、DM21;標(biāo)準(zhǔn)菌株 糞腸球菌Enterococcusfaecalis(CICC:23658)標(biāo)號(hào)FC,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;質(zhì)控菌株:大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC:25922)標(biāo)號(hào)DC,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;瓊脂糖 Sigma公司、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;2×Easy Tap PCR Supermix 北京全式金生物技術(shù)有限公司;DL2000 DNA Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司;6×Loading buffer 北京全式金生物技術(shù)有限公司;核酸染料 北京賽百盛生物工程公司;gyrA基因擴(kuò)增引物:上游:5′-gagggatagcggttagatgag-3′,下游:5′-ccgttcaccagcaggttagg-3,中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司,查閱文獻(xiàn)[5]而定。

鏈霉素(C014,10 μg/片)、環(huán)丙沙星(C045,5 μg/片)、諾氟沙星(C033,10 μg/片)、氧氟沙星(C044,5 μg/片) 杭州天和微生物試劑有限公司。TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基,按文獻(xiàn)[9]進(jìn)行配制。

表1 紙片法使用的抗菌藥物及藥物敏感型標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)Table 1 The standard of antibacterial drug and drug sensitivity of paper method(CLSI)

注:S(susceptible)為敏感;R(resistant)為耐藥;I(intermediate)為中度敏感。

熒光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超凈臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司;離心機(jī) Eppendorf公司;電泳儀 北京市六一儀器廠;PCR擴(kuò)增儀 BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 按照文獻(xiàn)[10]中方法進(jìn)行。

1.2.2 供試菌液制備 按照文獻(xiàn)[3]中方法進(jìn)行。

1.2.3 采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌直徑 用無菌的吸管吸取1 mL供試菌液,分別加入未凝固的25 mL MRS培養(yǎng)液中,充分搖勻后倒入平皿中待凝固。在凝固好的平皿中均等的放置2個(gè)藥敏紙片、1個(gè)空白紙片。同樣方法做質(zhì)控菌株對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)量抑菌圈直徑。上述實(shí)驗(yàn)每個(gè)菌株都做3次重復(fù)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)四種抗菌藥物的敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn) 供試菌株對(duì)四種抗菌藥物的藥敏性參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)[10-11]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(見表1)進(jìn)行,報(bào)告該供試菌對(duì)四種抗菌藥物是敏感,用S表示,中度敏感I表示,耐藥R表示[11-12]。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)菌株DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟提取。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)菌株DNA驗(yàn)證 取5 μL提取后的實(shí)驗(yàn)菌株DNA與0.5 μL的6×Loading buffer混勻,點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),觀察條帶。電泳參數(shù):電泳液為1×TBE buffer,電壓為110 V,時(shí)間為30 min。

1.2.7 PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)菌株的gyrA基因引物的設(shè)定是參照文獻(xiàn)[5]中公布的引物進(jìn)行,擴(kuò)增片段為500 bp,由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司提供合成。

PCR擴(kuò)增體系為50 μL:模板DNA(4 μL)、上游引物(1 μL)、下游引物(1 μL)、2×Easy Tap PCR Supermix(25 μL)、ddH2O(19 μL)。

PCR循環(huán)參數(shù)[5],預(yù)變性:94 ℃、3 min,(變性:94 ℃、30 s,退火:60 ℃、30 s,延伸:72 ℃、1 min)45個(gè)循環(huán),末端延伸:72 ℃、5 min。

1.2.8 擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證 將提取的DNA取5 μL點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),觀察條帶。電泳參數(shù):電泳液為1×TBE buffer,電壓為110 V,時(shí)間為30 min。

1.2.9 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 將1.2.7中g(shù)yrA基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株耐藥抑菌圈直徑及藥敏結(jié)果

供試菌株培養(yǎng)24 h后,測(cè)量培養(yǎng)皿抑菌圈直徑大小求平均值,藥敏結(jié)果見表2,耐藥率結(jié)果見表3。

表2 四種抗菌藥物對(duì)16株乳酸菌的抑菌直徑及藥敏結(jié)果Table 2 Antibacterial diameter and the susceptibility results of four kinds of antibacterial drugs treatments against 16 strains of lactic acid bacteria

注:W為在CLSI規(guī)定值范圍之內(nèi)。

表3 16株實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)四種抗菌藥物的耐藥率Table 3 Drug-resistance rates of the 16 Strains of lactic acid bacteria tested against the four kinds of Antimicrobials

表4 四種抗菌藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株抑菌直徑的F檢驗(yàn)Table 4 F test of four Kinds of Antimicrobials against the antibacterial diameter of 16 strains of lactic acid bacteria tested

從表2、表3結(jié)果表明,16株菌對(duì)氧氟沙星只有DM17表現(xiàn)為中度敏感,其余均為耐藥;對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星均表現(xiàn)為耐藥;對(duì)鏈霉素DM11表現(xiàn)為中度敏感,其余均為耐藥。16株實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)氟喹諾酮類和氨基糖苷類兩大類四種藥的耐藥率較高,氧氟沙星和鏈霉素為93.75%,環(huán)丙沙星和諾氟沙星為100%。

質(zhì)控菌株大腸桿菌對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素的耐藥直徑均在CLSI規(guī)定允許的范圍內(nèi),說明實(shí)驗(yàn)菌株耐藥直徑數(shù)值可靠準(zhǔn)確。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌株的耐藥性分析

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果做四種抗菌藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株抑制性差異的分析,結(jié)果如表4。

從表4可以看出,四種抗菌藥物對(duì)乳酸菌的抑制作用差異極顯著,顯著水平p<0.01。

2.3 實(shí)驗(yàn)菌株DNA提取條帶和PCR擴(kuò)增條帶

DNA提取條帶如圖1所示。目的條帶與預(yù)期條帶大小一致。個(gè)別樣品出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象是因酶量過多或退火溫度低產(chǎn)生了PCR特異性產(chǎn)物。

圖1 實(shí)驗(yàn)菌株總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA of lactic acid bacteria tested

實(shí)驗(yàn)菌株gyrA基因的PCR擴(kuò)增條帶如圖2、圖3所示。

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株gyrA基因引物1PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of gyrA gene primer of lactic acid bacteria tested

圖3 標(biāo)準(zhǔn)菌株和質(zhì)控菌株gyrA基因引物PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of gyrA gene primer of standardized and quality-controlled strains

分析部分實(shí)驗(yàn)菌株未出現(xiàn)條帶,主要是因引物存在特異性所致。

2.4 實(shí)驗(yàn)菌株gyrA基因編碼的氨基酸序列分析

將gyrA引物擴(kuò)增DM21、FC和DC的測(cè)序結(jié)果輸入軟件DNASTAR中的EditSeq中翻譯成氨基酸序列,后將DM21和FC、DM21和DC分別輸入MegAlign進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),結(jié)果詳見圖4、圖5。

由圖4的結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)菌株DM21相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株FC的gyrA基因的堿基突變導(dǎo)致gyrA亞基發(fā)生氨基酸序列的改變,共有2個(gè)氨基酸發(fā)生了改變,改變位點(diǎn)是142位L(Leu)變?yōu)閃(Trp)、145位R(Arg)變?yōu)門(Thr)。圖5的結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)菌株DM21相對(duì)質(zhì)控菌株DC的gyrA基因的堿基突變導(dǎo)致gyrA亞基發(fā)生氨基酸序列的改變,共有3個(gè)氨基酸發(fā)生改變,改變位點(diǎn)是142位G(Gly)變?yōu)閃(Trp)、143位D(Asp)突變?yōu)镚(Gly)、145位R(Arg)變?yōu)門(Thr)。

圖4 菌株DM21和FC的gyrA基因氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparision results of amino acid sequence of gyrA gene of DM21 and FC

圖5 菌株DM21和DC的gyrA基因氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果Fig.5 The comparision results of gyrA gene amino acid through DM21 and DC sequence

馬沁沁[13]等研究發(fā)現(xiàn)分離自四川地區(qū)人腸道及發(fā)酵食品的52株乳桿菌中,60%以上的菌株分別對(duì)紅霉素、萬古霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥;董春陽[14]對(duì)48株乳酸菌耐藥性研究發(fā)現(xiàn),95.83%的菌株對(duì)鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,45.83%的菌株對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)為耐藥;秦宇軒[15]等市售酸奶中分離到100株乳酸菌,均對(duì)鏈霉素和慶大霉素耐藥;杜金城[16]等對(duì)具有抑制大腸桿菌作用的3株乳酸菌進(jìn)行耐藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),對(duì)氨基糖苷類的抗生素展現(xiàn)出耐受,呂耀龍[17]研究內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)氧氟沙星的表現(xiàn)為較高的耐藥率。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與以上學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,16株乳酸菌對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素表現(xiàn)為較高的耐藥率,分別為93.75%、100%、100%、93.75%。于濤[18]在56株乳酸菌中共檢出5種不同的耐藥基因;霍小琰[5]通過對(duì)耐藥菌株DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡgyrA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序,與敏感性大腸桿菌gyrA基因進(jìn)行突變位點(diǎn)的比較,發(fā)現(xiàn)10株耐氟喹諾酮類抗菌藥乳酸菌的gyrA基因位點(diǎn)發(fā)生突變,證實(shí)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)喹諾酮類抗菌藥產(chǎn)生的耐藥性與菌體DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ gyrA基因突變有直接關(guān)系。宋曉敏[19]研究乳酸菌耐藥機(jī)理發(fā)現(xiàn),耐藥菌株的gyrA和parC基因發(fā)生氨基酸突變,證實(shí)這些氨基酸突變與菌株耐氟喹諾酮類藥物有關(guān);gyrB基因中引入了終止密碼子,出現(xiàn)無義突變,可能是菌株耐藥的原因之一。目前人類濫用抗菌藥物嚴(yán)重,乳酸菌對(duì)多數(shù)抗菌藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥,分析本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)部分菌株的gyrA基因的堿基突變導(dǎo)致gyrA亞基發(fā)生氨基酸序列的改變是致使乳酸菌耐藥的原因所在。

3 結(jié)論

16株乳酸菌中,對(duì)4種抗菌藥物表現(xiàn)為較高的耐藥率,93.75%的菌株對(duì)氧氟沙星、鏈霉素表現(xiàn)為耐藥,100%的菌株對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星表現(xiàn)為耐藥。

內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)部分抗菌藥物呈現(xiàn)較高的耐藥性,經(jīng)gyrA基因PCR擴(kuò)增、氨基酸序列分析,菌株DM21的耐藥性與gyrA基因突變有直接關(guān)系。鑒于此,對(duì)食品工業(yè)而言,在選育高發(fā)酵力乳酸菌的同時(shí)還應(yīng)考慮發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)和安全性;對(duì)乳酸菌耐藥性研究而言,致使耐藥因素較多,應(yīng)對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變、主動(dòng)外排系統(tǒng)和質(zhì)粒介導(dǎo)等逐一研究排查。

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Study on drug resistance testing and gyrA gene analysis of milk lactobacillus of Damao pastoral areas of Inner Mongolia

LV Yao-long1,LI Shao-ying2,*,ZHAO Chun-jie1,BAO Dan-dan1

(1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109,China;2.Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The research subject of this study was sixteen strains of lactobacillus which separated from milk of Damao pastoral areas of Inner Mongolia,and paper diffusion method was used to test the drug resistance of four kinds of antibacterial drugs of ofloxacin,ciprofloxacin,norfloxacin,and streptomycin. The results showed that 93.75% of sixteen strains of lactobacillus were resistant to ofloxacin and streptomycin,and 100% of sixteen strains of lactobacillus were resistant to ciprofloxacin and norfloxacin. The results of PCR amplification and amino acid sequence analysis for all drug resistance lactobacillus showed that the resistance of one strains of lactobacillus was related to mutation of gyrA gene.

Lactobacillus;drug resistance testing;gene analysis of gyrA

2016-08-19

呂耀龍(1982-)，男，碩士研究生，講師，主要從事食品微生物研究，E-mail:lylong1982@163.com。

*通訊作者:李少英(1961-)，女，博士研究生，教授，主要從事有益微生物的研究，E-mail:nmglshy@126.com。

內(nèi)蒙古高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(NJ09059)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060014)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.023