張莉力,許云賀,肖海蒂,王淋楓,黃 濤,陳文瑩,2,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,貴州遵義 563000)

張莉力1,許云賀1,肖海蒂1,王淋楓1,黃 濤1,陳文瑩1,2,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,貴州遵義 563000)

地衣芽孢桿菌作為一個(gè)益生菌在食品或飼料工業(yè)中都具有廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)以芽孢數(shù)和芽孢率為指標(biāo),經(jīng)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),得到最佳發(fā)酵條件為:K+濃度為0.002 mol/L、Mg2+濃度為1 g/L、接種量5%、種子菌齡12 h,發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為36 h。對(duì)確定的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果得到地衣芽孢桿菌BL-5的產(chǎn)芽孢率為94.67%,芽孢數(shù)為3.32×109CFU/mL。

地衣芽孢桿菌BL-5,芽孢率,芽孢數(shù),響應(yīng)面法

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一類(lèi)益生菌,屬于G+好氧菌[1]。地衣芽孢桿菌因有著良好的適應(yīng)能力和能產(chǎn)生豐富的酶系,使其長(zhǎng)期應(yīng)用于生產(chǎn)食品工業(yè)用的酶制劑。Roy等[2]從印度東北部阿薩姆的土壤樣品中分離到一個(gè)嗜堿菌菌株。該菌株能夠在極堿性pH(12.5)條件下生長(zhǎng)并產(chǎn)生α-淀粉酶。Rehman等[3]分離的地衣芽孢桿菌KIBGE IB-21具有果膠酶活性。Gurung等[4]通過(guò)來(lái)自地衣芽孢桿菌DSM 13的UDP葡糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC在體外成功合成了芹菜素糖苷。

此外,地衣芽孢桿菌是一種理想的飼料添加劑,能夠提高腸屏障功能和抑制致病細(xì)菌粘附于腸壁,能夠提高牲畜的免疫力和抗病力,提高飼料的利用率,增加牲畜和家禽的生產(chǎn)能力[5-6]。Zhang等[7]研究表明膳食地衣芽孢桿菌水平從0上升到1×107CFU/g,白細(xì)胞數(shù)量、補(bǔ)體活性以及血清總蛋白、球蛋白含量全部顯著升高。Gobi等[8]研究表明105CFU/mL地衣芽孢桿菌Dahb1能夠通過(guò)增強(qiáng)亞洲鯰魚(yú)的生長(zhǎng)、免疫及抗氧化來(lái)抵抗副溶血性弧菌Dahv2感染。Lei等[5]研究表明飼喂含地衣芽孢桿菌(0.01%和 0.03%)的飼料能夠增加雞蛋產(chǎn)量和質(zhì)量,并且存在劑量依賴(lài)關(guān)系。地衣芽孢桿菌發(fā)揮其作用主要通過(guò)降低應(yīng)激響應(yīng)、上調(diào)生長(zhǎng)激素和增進(jìn)腸道健康來(lái)實(shí)現(xiàn)。Liu等[9]研究表明膳食補(bǔ)充地衣芽孢桿菌能夠顯著增加肉雞體重,并顯著改善3～6周和0～6周飼養(yǎng)期的飼料轉(zhuǎn)化率。此外,補(bǔ)充地衣芽孢桿菌也導(dǎo)致蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的增加,并降低雞胸肉條脂肪含量(p<0.05)。因此地衣芽孢桿菌可作為在肉雞生長(zhǎng)促進(jìn)和肉質(zhì)增強(qiáng)劑。

因此本文在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)地衣芽孢桿菌BL-5芽孢數(shù)及芽孢率的影響因素進(jìn)行優(yōu)化,為提高地衣芽孢桿菌BL-5的益生效果提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持,為地衣芽孢桿菌BL-5在食品或飼料工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

表1 芽孢率及芽孢數(shù)PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of the rate and number of spores in the experiment of Plackett-Burman design

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌BL-5 錦州醫(yī)科大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 均為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;UV754PC紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀表有限公司;DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHP-9052型pH計(jì) 上海一恒科技有限公司;M4-AL204電子分析天平 蘭州中西儀器有限公司;HZQ-F200振蕩培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;數(shù)碼生物顯微鏡 奧林巴斯(中國(guó))有限公司;微量移液器 百得實(shí)驗(yàn)室儀器;DK-98-1型水浴鍋 天津泰斯特儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化方法 將凍存于-80 ℃超低溫冰箱中的地衣芽孢桿菌BL-5以2%(體積/體積)接種量接入5 mL種子培養(yǎng)基(牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 L、pH7.0)進(jìn)行活化,37 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)24 h,傳代培養(yǎng)3次。至活力上升后,接種于斜面培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂)上,用于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中種子菌的制備。

1.2.2 產(chǎn)芽孢菌的篩選 將活化后的保存于斜面上的菌株挑取少許劃線于促芽孢培養(yǎng)基(葡萄糖1.0 g、蛋白胨1.0 g、硫酸銨0.2 g、酵母膏0.7 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、磷酸氫二鉀1.0 g、瓊脂20.0 g(固體培養(yǎng)基時(shí)),水1 L,pH7.2)平皿上,30 ℃培養(yǎng)24 h后挑選獨(dú)立且大菌落到裝有25 mL無(wú)菌生理鹽水中,振蕩均勻后置100 ℃水浴鍋中水浴10 min,再涂布于促進(jìn)芽孢生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行培養(yǎng),反復(fù)多次。最后挑取平板上大的單菌落轉(zhuǎn)接到促進(jìn)芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基的試管斜面上,30 ℃下培養(yǎng)24 h后,轉(zhuǎn)置于4 ℃冰箱冷藏室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 芽孢測(cè)定方法 芽孢數(shù)(b):將培養(yǎng)后的菌液在致死溫度(75 ℃)下處理15 min后,迅速冷卻后采用稀釋梯度平皿計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù);總菌數(shù)(a):將培養(yǎng)后的菌液直接進(jìn)行稀釋梯度平皿計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)[10]。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)(PB設(shè)計(jì))篩選主要影響因素 在前期對(duì)地衣芽孢桿菌BL-5的生長(zhǎng)條件優(yōu)化(固定:蔗糖29.85 g/L、硫酸銨10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、pH8.0、轉(zhuǎn)速150 r/min)[11]基礎(chǔ)及產(chǎn)孢單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)除了致死溫度和種子培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)2個(gè)因素以外的6個(gè)因素(發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、種子菌齡、K+濃度和Mg2+)進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)[12]。運(yùn)用Minitab軟件將其6種因素進(jìn)行兩水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),每組實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取均值確立主要影響因素。

1.2.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)折點(diǎn) 在Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定的三個(gè)主要影響因素的結(jié)果基礎(chǔ)上,根據(jù)三個(gè)因素的影響的正負(fù)效應(yīng),設(shè)計(jì)出6個(gè)實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取均值分析出其中作為轉(zhuǎn)折點(diǎn)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件。

1.2.4.3 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值 在最陡爬坡的基礎(chǔ)上,確定了一個(gè)最高點(diǎn),然后運(yùn)用Minitab軟件對(duì)三種因素采用Box-Behnken法進(jìn)行優(yōu)化,每組實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[13-14]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS Statistics17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,其中兩兩比較采用了SNK方法;Plackett-Burman設(shè)計(jì)、部分析因設(shè)計(jì)和響應(yīng)面Box-Behnken法采用Minitab16.0軟件進(jìn)行方差分析[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB設(shè)計(jì)篩選主要影響因素

首先,由表1可知,第8個(gè)實(shí)驗(yàn)的芽孢率最佳,能達(dá)到93.90%,但以芽孢數(shù)為指標(biāo)比較時(shí),第10個(gè)實(shí)驗(yàn)的芽孢數(shù)最佳(13.2×108CFU/mL),且芽孢率能達(dá)到82.00%。再由圖1和圖2的芽孢率和芽孢數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)分析可知,芽孢率有發(fā)酵時(shí)間、K+濃度和Mg2+濃度具有顯著差異,但以芽孢數(shù)作為指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析時(shí),6個(gè)因素均無(wú)顯著差異。此外,從圖1可看出,發(fā)酵時(shí)間、K+濃度和Mg2+濃度的顯著性影響次序?yàn)?發(fā)酵時(shí)間>K+濃度>Mg2+濃度。以芽孢數(shù)為指標(biāo)時(shí),如圖2所示,并無(wú)顯著差異的影響因素。

表2 芽孢率和芽孢數(shù)的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The steepest ascent experimental design and results of the rate and number of spores

注:不同字母之間表示存在顯著差異(p<0.05),同一字母表示不顯著。

在圖1統(tǒng)計(jì)結(jié)果基礎(chǔ)上,得到發(fā)酵時(shí)間、K+濃度和Mg2+濃度的主效應(yīng)圖(圖3),其中發(fā)酵時(shí)間和Mg2+濃度呈正效應(yīng),隨水平的增加芽孢率增加,而K+濃度呈負(fù)效應(yīng),隨著K+濃度增加,芽孢率反而降低,此主效應(yīng)圖對(duì)下一階段的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)選定水平走向有著重要意義。其余沒(méi)有顯著影響的條件固定為:發(fā)酵溫度30 ℃、接種量5%、種子菌齡12 h。

圖1 芽孢率PB設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)分析Fig.1 The standardized effect analysis of the rate of spores in the experiment of Plackett-Burman design

圖2 芽孢數(shù)PB設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)分析Fig.2 The standardized effect analysis of the number of spores in the experiment of Plackett-Burman design

圖3 芽孢率PB設(shè)計(jì)的主效應(yīng)圖Fig.3 The main effects plot of the rate of spores in the experiment of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)折點(diǎn)

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中結(jié)果可知,其中發(fā)酵時(shí)間和Mg2+濃度呈正效應(yīng),K+濃度呈負(fù)效應(yīng),在此基礎(chǔ)上調(diào)整水平范圍,設(shè)計(jì)6組實(shí)驗(yàn),以確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)折點(diǎn),具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知,以芽孢率為指標(biāo)時(shí),第1組、第5組和第6組實(shí)驗(yàn)之間不存在顯著差異,而第2組、第3組和第4組之間也不存在顯著差異,但是第1、5和6組芽孢率顯著低于第2、3和4組,其中第3組的芽孢率最佳,為95.25%。

以芽孢數(shù)為指標(biāo)時(shí),第3組的芽孢數(shù)最高,芽孢數(shù)達(dá)到2.18×108CFU/mL。綜合芽孢率和芽孢數(shù)的指標(biāo),均為第3組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果最佳,因此選定第3組的因素水平,即:發(fā)酵時(shí)間為42 h,K+濃度為0.004 mol/L,Mg2+濃度為1.5 g/L。

2.3 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件為中心,以芽孢率為主要指標(biāo),芽孢數(shù)為輔助指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表3 芽孢率和芽孢數(shù)的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The Box-Behnken experimental design and results of the rate and number of spores

表4 芽孢率響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析Table 4 The variance analysis of the rate of spores in response surface experiment

注:*表示差異“顯著”(p<0.05),**表示差異“極顯著”(p<0.01),表5同。

由表3可知,以芽孢率為指標(biāo)時(shí),第12組實(shí)驗(yàn)結(jié)果為最優(yōu),但芽孢數(shù)并不是最佳。而以芽孢數(shù)為指標(biāo)時(shí),第5組實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳,芽孢數(shù)達(dá)3.97×109CFU/mL,且芽孢率能達(dá)到99.1%,僅次于第12組實(shí)驗(yàn)中的芽孢率。但運(yùn)用Minitab 16.0 軟件進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,芽孢數(shù)的分析結(jié)果如表5所示,模型中回歸和線性p>0.05,均無(wú)顯著意義,即:芽孢數(shù)既不存在直線回歸關(guān)系,也不存在曲線回歸關(guān)系,換而言之,芽孢數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,地衣芽孢桿菌BL-5的進(jìn)一步優(yōu)化不再以芽孢數(shù)作為指標(biāo)參考。

在芽孢率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果中(表4),回歸有著極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而線性并無(wú)顯著意義,說(shuō)明芽孢率的響應(yīng)優(yōu)化結(jié)果是曲線回歸。平方和交互作用均為顯著,尤其是平方極顯著,故芽孢率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

通過(guò)對(duì)運(yùn)用Minitab 16.0 軟件對(duì)地衣芽孢桿菌BL-5的芽孢率進(jìn)行回歸分析,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到二次回歸方程:

Y=86.533+19.021X12-22.204X22-16.654X32+15.925X2X3

其中:X1-發(fā)酵時(shí)間;X2-K+濃度;X3-Mg2+濃度。

其中決定系數(shù)R2=88.87%,說(shuō)明這種實(shí)驗(yàn)方法比較可靠,回歸擬合程度較好,可以用此模型對(duì)芽孢率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程,運(yùn)用Minitab 16.0 軟件,作出以發(fā)酵時(shí)間、K+濃度和Mg2+濃度任一一個(gè)因素的水平不變,另外兩個(gè)因素對(duì)芽孢率的影響的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖[17],見(jiàn)圖4。

如圖4所示,當(dāng)保持Mg2+濃度為1 g/L時(shí),發(fā)酵時(shí)間和K+濃度對(duì)芽孢率的響應(yīng)面曲線圖呈弧形的弓曲面,等高值線呈雙曲線的規(guī)律。另外根據(jù)芽孢率在等高值線上的變化,顯示發(fā)酵時(shí)間和K+濃度并無(wú)交互作用,反而呈現(xiàn)各自的平方具有顯著意義。

當(dāng)保持發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí),K+濃度和Mg2+濃度對(duì)芽孢率的響應(yīng)面曲線圖呈規(guī)則弧形圖,且K+濃度和Mg2+濃度對(duì)芽孢率的交互作用隨著K+濃度和Mg2+濃度升高,響應(yīng)值芽孢率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),表明兩因素的交互作用顯著。

當(dāng)保持K+濃度為0.002 mol/L時(shí),發(fā)酵時(shí)間和Mg2+濃度對(duì)芽孢率的響應(yīng)面曲線圖也是呈弧形的弓曲面,等高值線呈雙曲線的規(guī)律。根據(jù)芽孢率在等高值線上的變化,表明兩因素并無(wú)交互作用,只是各自平方的顯著影響芽孢率。

表5 芽孢數(shù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析Table 5 The variance analysis of the number of spores in response surface experiment

圖4 芽孢率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 The response surface and contour plots of the rate of spores

最終由Minitab 16.0軟件,以最優(yōu)芽孢率為目的,進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件為:K+濃度為0.002 mol/L,Mg2+濃度為1 g/L,發(fā)酵時(shí)間為36 h。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),結(jié)果得到地衣芽孢桿菌BL-5的產(chǎn)芽孢率平均值為94.67%,芽孢數(shù)為3.32×109CFU/mL,優(yōu)化結(jié)果較為理想。因而,可認(rèn)為基于響應(yīng)面分析法所得到地衣芽孢桿菌BL-5產(chǎn)芽孢率優(yōu)化發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以芽孢率和芽孢數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),得到最佳發(fā)酵條件為:K+濃度為0.002 mol/L、Mg2+濃度為1 g/L、接種量5%、種子菌齡12 h,發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為36 h。對(duì)確定的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果得到地衣芽孢桿菌BL-5的產(chǎn)芽孢率平均值為94.67%,芽孢數(shù)為3.32×109CFU/mL。

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Optimization of fermentation conditions of spores production ofBacilluslicheniformisBL-5

ZHANG Li-li1,XU Yun-he1,XIAO Hai-di1,WANG Lin-feng1,HUANG Tao1,CHEN Wen-ying1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China;2.School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China)

Bacilluslicheniformis,as one member of probiotics,has broad application prospects in the food and feed industries. According to the number and rate ofBacilluslicheniformisBL-5 spores,the optimal conditions of fermentation was acquired via the Plackett-Burman experimental design,steepest ascent experimental design,and response surface experiment. And the results showed the optimized conditions were K+concentration of 0.002 mol/L,Mg2+concentration of 1 g/L,inoculation amount of 5%,inoculating age of 12 h,fermentation temperature of 30 ℃,fermentation time of 36 h. The optimum condition was verified,the rate and number ofBacilluslicheniformisBL-5 spores were 94.67% and 3.32×109CFU/mL,respectively.

BacilluslicheniformisBL-5;the rate of spores;the number of spores;response surface methodology

2016-08-20

張莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向:微生物,E-mail:lilyzhang1977@163.com。

*通訊作者:陳文瑩(1989-)，女，碩士，研究方向：微生物，E-mail:chenxiaomi1006@163.com

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014022046);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301499)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.020