王 樂，鄭新華，項海波，陳 晞 ，張愛霞

(1.濟南出入境檢驗檢疫局，山東 濟南 250014;2.山東出入境檢驗檢疫局,山東 青島 266000)

HPLC測定食品包裝用膠黏劑中5種樹脂酸含量

王 樂1*，鄭新華1，項海波2，陳 晞1，張愛霞1

(1.濟南出入境檢驗檢疫局，山東 濟南 250014;2.山東出入境檢驗檢疫局,山東 青島 266000)

建立高效液相色譜測定食品包裝用膠黏劑中樅酸、新樅酸、去氫樅酸、長葉松酸和左旋海松酸的分析方法。對樣品前處理和色譜分析條件進行了優(yōu)化，以乙酸乙酯為溶劑，甲醇沉淀高聚物離心后微孔濾膜過濾，乙腈-0.4%乙酸水(80∶20)為流動相，流速為1.0 mL/min，等度洗脫，采用Venusil MP C18(2)色譜柱，二極管陣列檢測器(DAD)，高效液相色譜法測定，樅酸和新樅酸的檢測波長為240 nm，長葉松酸和左旋海松酸為270 nm，去氫樅酸為208 nm，以外標法定量。結果表明，5種樹脂酸的定量下限為2.5～10.0 mg/kg，線性范圍跨越兩個數(shù)量級以上，連續(xù)6次進樣的相對標準偏差(RSD)不大于3.4%，加標回收率為92.2%～103.6%。該方法操作簡單、干擾因素少、分析速度快，滿足食品包裝用膠黏劑中5種樹脂酸的檢測要求。

食品包裝；膠黏劑；樹脂酸；高效液相色譜

松香黏性甚佳，尤其是壓敏性、快黏性、低溫黏性很好，因此作為膠黏劑的重要組成部分應用于制造工業(yè)，特別是以塑料、紙張為基材的食品包裝[1-2]，如食品標簽、復合食品包裝材料等。因基材本身具有一定的滲透性能，作為助劑使用的膠黏劑中的有毒有害成分在食品包裝的儲存及使用過程中存在向食品遷移的風險，繼而引起食品安全問題[3-4]。松香的主要成分為樅酸、新樅酸、去氫樅酸、長葉松酸和左旋海松酸等同分異構的樹脂酸[5]，毒理學研究表明樅酸等樹脂酸可導致人體肺泡上皮細胞溶解，對人體紅細胞、多核白細胞有毒性作用[6-8]，可損傷DNA的活性[9]，另有報道稱，銀屑敵膠囊中因含非法添加物松香酸，造成部分患者失明、急性肝壞死等[10]。據(jù)此，歐盟分類法規(guī)已將松香含量大于1%的產品標識為R43(能引起皮膚過敏)[11]。

樹脂酸的測定大多采用氣相色譜法[12]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[13-14]、高效液相色譜法[15-16]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[17-18]，檢測對象有化妝品、藥材、食品、松香產品等，其中氣相色譜法可檢測多種樹脂酸的同分異構體，但需甲酯化，操作較復雜且無法有效區(qū)分樹脂酸和樹脂酸甲酯；液相色譜法可檢測的目標物僅局限于樅酸和脫氫樅酸，無法有效區(qū)分多種樅酸同分異構體，因此不能對樅酸異構體總量進行準確定量。目前，有關食品包裝用膠黏劑中多種同分異構樹脂酸的液相色譜檢測方法尚未見報道。本文以樅酸、新樅酸、去氫樅酸、長葉松酸和左旋海松酸5種樹脂酸作為食品包裝用膠黏劑中松香的主要標志物，研究確定了樣品的提取方法，首次建立了樅酸、新樅酸、去氫樅酸、長葉松酸和左旋海松酸5種樹脂酸的HPLC分離、測定條件。本方法操作便捷、準確，研究結果可為完善我國膠黏劑標準以及食品包裝企業(yè)正確選擇膠黏劑提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1260 液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配有二極管陣列(DAD)檢測器；色譜柱：AgelaVenusil MP C18(2)(4.6 mm×250 mm×5 μm，天津博納艾杰爾)。KQ700DE超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司。樅酸標準品(75.0%，美國Toronto Research Chemicals Inc.)，新樅酸標準品(98.0%，美國Sigm公司)，脫氫樅酸標準品(96.0%，美國Toronto Research Chemicals Inc)，長葉松酸標準品(99.5%，挪威Chiron公司)，左旋海松酸標準品(96.5%，挪威Chiron公司)；乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙酸(HPLC級，美國Fisher公司)。標準溶液：用甲醇配制1 000 mg/L的樹脂酸標準儲備溶液，使用時再以甲醇逐級稀釋。

陽性樣品的制備：分別稱取10 g不含樹脂酸的309膠(自然干燥至恒重)、熱熔膠空白樣品于兩燒杯中，各加入20 mL乙酸乙酯使之完全溶解，再分別加入0.01 g，0.1 g(精確至0.000 1 g)樅酸標準品，攪拌或超聲混勻后，將液體倒入玻璃培養(yǎng)皿中，放入通風櫥內，待乙酸乙酯全部揮發(fā)后，得到樅酸含量分別為1 000，10 000 mg/kg的兩種陽性樣品。

1.2 色譜條件

流動相：乙腈-0.4%乙酸水(80∶20)，等度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：208 nm，240 nm和270 nm；進樣體積：10 μL。

1.3 樣品制備

稱取2.5 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL具塞玻璃離心管中，準確加入5 mL 乙酸乙酯完全溶解后，加入20 mL甲醇渦流、沉淀，靜置5 min后過0.22 μm 濾膜，上機測定。

2 結果與討論

2.1 前處理方式的選擇

膠黏劑中有毒有害物質的提取通常以甲醇為提取溶劑，采用超聲[19]、振蕩[20]等方法時，對于致密樣品中的目標物可能提取不完全，會導致檢測結果偏低。國標GB19340-2014采用乙酸乙酯完全溶解膠黏劑樣品[21]，考慮到膠黏劑的高分子聚合物基體進入液相時會對色譜系統(tǒng)造成污染，本研究采用甲醇為沉淀劑將基質雜質等聚合物除去[22]。實驗采用制備的兩種膠黏劑陽性樣品，對比了甲醇超聲法提取(甲醇為提取溶劑，25 mL超聲提取60 min)和乙酸乙酯溶解/甲醇沉淀法(溶解/沉淀法)對309膠和熱熔膠的提取效率。結果顯示，乙酸乙酯溶解/甲醇沉淀法的提取效率(回收率均大于90%)明顯好于甲醇超聲法(回收率低于30%)，且未有樅酸以外的樹脂酸種類檢出，這是由于乙酸乙酯為有機強溶劑，可在不改變樣品pH值的情況下完全溶解或分散各種類型的膠黏劑樣品以提取目標物，且不改變各樹脂酸同分異構體的平衡狀態(tài)，從而可以得到各樹脂酸同分異構體的準確含量。而甲醇由于對于致密或粘稠的膠黏劑的溶解性較差，提取效率不高。因此，本研究選取乙酸乙酯溶解/甲醇沉淀法進行樣品前處理。

圖1 不同色譜柱分析5種樹脂酸的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 5 resin acid standards under different chromatographic column

圖2 乙腈-水(80∶20)體系中5種樹脂酸的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 5 resin acid standards under acetonitrile-water(80∶20)

圖3 不同檢測波長下5種樹脂酸的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of 5 resin acid standards under different detection wavelengths

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 本研究的目標物包含樅酸、新樅酸、去氫樅酸、長葉松酸和左旋海松酸，其中樅酸、新樅酸、長葉松酸和左旋海松酸為同分異構體，它們的分離為液相色譜柱的選擇帶來了挑戰(zhàn)。C18柱是液相色譜最常用的反相色譜柱，由于鍵合基質、載碳量、硅羥基封尾基團的不同，C18色譜柱的選擇性和分離效果會有很大的差別。本研究嘗試了多種型號的C18色譜柱，實驗結果見圖1。采用Thermoaccucore C18，Waters XTerra@ RP18，AgelaVenusil XBP C18(L)進行實驗時，4種同分異構體的出峰時間相同或相近，分離效果均不理想。實驗發(fā)現(xiàn)AgelaVenusil MP C18(2)和AgilentTC-C18(2)色譜柱對5種目標物均具有較好的分離效果，但由于AgilentTC-C18(2)對于左旋海松酸、長葉松酸與樅酸的分離差于AgelaVenusil MP C18(2)。因此，最終選擇AgelaVenusil MP C18(2)進行分析。

2.2.2 流動相的選擇 采用AgelaVenusil MP C18(2)色譜柱進行分離，分別對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%乙酸水等流動相體系進行考察。結果顯示，甲醇-水體系在40 min仍不出峰。采用乙腈-水體系時4種同分異構體只分成兩組峰且峰形較差(圖2)。而乙腈-0.4%乙酸水體系有利于樹脂酸同分異構體的分離且色譜峰對稱性較好。進一步對乙腈和乙酸水的比例進行優(yōu)化，當乙腈與0.4%乙酸水的體積比為 80∶20，流速1.0 mL/min時，5種目標化合物可在20 min 內依次出峰(圖3)。

2.2.3 檢測波長的選擇 在190～450 nm范圍內測定5種樹脂酸標準溶液的紫外-可見吸收光譜，樅酸、新樅酸、長葉松酸、左旋海松酸和去氫樅酸的最大吸收波長分別為240，250，266，275，200 nm。為降低鄰近峰的干擾，本研究選擇多通道監(jiān)測，樅酸和新樅酸采用240 nm 波長進行定量計算，長葉松酸和左旋海松酸采用270 nm 波長進行定量計算；為降低乙腈、甲醇試劑在低波長的干擾，去氫樅酸采用208 nm 波長進行定量計算。

2.3 線性范圍與定量下限

取各樹脂酸標準儲備液，用甲醇逐級稀釋配成適宜范圍的混合標準工作溶液。在優(yōu)化條件下進行測定，以各目標物的質量濃度(x，mg/L)為橫坐標，色譜峰的峰面積(y)為縱坐標進行擬合，計算各化合物的線性方程、相關系數(shù)(r)和線性范圍。以空白膠黏劑樣品加標，按本文建立的方法進行處理和測定，以信噪比(S/N)大于10計算得到方法的定量下限(LOQ)。結果顯示，新樅酸和長葉松酸在0.25～100.0 mg/L、左旋海松酸和樅酸在0.35～100.0 mg/L、去氫樅酸在1.0～100.0 mg/L范圍內呈良好的線性關系(r≥0.999 9)，5種樹脂酸的定量下限為2.5～10.0 mg/kg。

表1 5種樹脂酸的線性方程、相關系數(shù)及定量下限Table 1 Regression equations,correlation coefficients(r) and limits of quantitation(LOQ) of 5 resin acids

2.4 回收率與精密度

在選定的前處理和測定條件下，以空白膠黏劑樣品(環(huán)保透明型萬能膠)加標使基質中去氫樅酸的最終含量分別為10.0，20.0，100.0 mg/kg，其余各樹脂酸的最終含量分別為4.0，8.0，40.0 mg/kg，每個水平連續(xù)平行測定6次，加標回收率和相對標準偏差(RSD)結果見表2。由表2可見，方法的加標回收率為92.2%～103.6%，RSD為0.43%～3.4%，表明本方法的回收率高、精密度好。

表2 膠黏劑中5種樹脂酸的加標回收率和精密度Table 2 Recoveries and precisions(RSD) of 5 resin acids in adhesives

2.5 實際樣品分析

用本文建立的方法對市售16份膠黏劑樣品(其中309萬能膠2份、502強力膠1份、302強力膠1份、環(huán)保透明型萬能膠4份、PVC-U膠黏劑2份、雙面膠5份、熱熔膠1份)進行樅酸、新樅酸、去氫樅酸、長葉松酸和左旋海松酸的測定，結果見表3。其中，309萬能膠、502強力膠、302強力膠、環(huán)保透明型萬能膠、PVC-U膠黏劑為溶劑型膠黏劑，易溶解或分散于乙酸乙酯；雙面膠、熱熔膠樣品較粘稠或致密，需要超聲輔助分散或溶解。從檢測結果看，2份309萬能膠和4份雙面膠樣品檢出樅酸、新樅酸、去氫樅酸和長葉松酸，未檢出左旋海松酸；1份302強力膠僅檢出去氫樅酸；1份雙面膠樣品和1份熱熔膠樣品中5種樹脂酸均有檢出；其余樣品為陰性樣品。

表3 陽性膠黏劑樣品中5種樹脂酸的含量Table 3 Contents of 5 resin acids in positive adhesive samples (mg·kg-1)

n.d.:no detected

3 結 論

本文建立了HPLC測定食品包裝用膠黏劑中5種樹脂酸含量的方法。研究確定了優(yōu)化的樣品前處理和色譜分析條件，實現(xiàn)了食品包裝用膠黏劑中樅酸、新樅酸、長葉松酸和左旋海松酸4種同分異構體樹脂酸與去氫樅酸的同時快速測定。各樹脂酸在一定濃度范圍內呈良好的線性關系(r≥0.999 9)，加標回收率為92.2%～103.6%，相對標準偏差不高于3.4%，定量下限為2.5～10.0 mg/kg。該方法前處理簡單、靈敏度高、重復性好、穩(wěn)定性高，可用于食品包裝用膠黏劑中5種樹脂酸含量的測定。

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Determination of 5 Resin Acids in Food Contact Adhesives by HPLC

WANG Le1*,ZHENG Xin-hua1,XIANG Hai-bo2,CHEN Xi1,ZHANG Ai-xia1

(1.Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jinan 250014,China;2.Shandong Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao 266000,China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the determination of 5 resin acids,including abietic acid,neoabietic acid,dehydroabietic acid,palustric acid and levopimaric acid in food contact adhesives．The conditions of sample pretreatment and chromatographic separation were optimized.The sample was dissolved with ethyl acetate,and the polymer was precipitated with methanol.After filtration with filter membrane,the extract was separated on a Venusil MP C18(2) column with acetonitrile-0.4%acetic acid(80∶20) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min,detected accurately by HPLC with diode-array detector(DAD) at 240 nm for abietic acid and neoabietic acid,270 nm for palustricacid and levopimaric acid,208 nm for dehydroabietic acid,and quantified by the external standard method．The HPLC method showed a good linearity above two orders of magnitude，with detection limits of 2.5-10.0 mg/kg.The RSDs for 5 resin acids were no more than 3.4%,and the recoveries were in the range of 92.2%-103.6%．The method has the advantages of simple operation,rapid analysis and less interference factors,and could provide credible analysis for 5 resin acidsin food contact adhesives.

food package;adhesive;resin acids;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-08-23；

2016-09-21

質檢總局科研項目(2015IK212)；國家認監(jiān)委科研制標項目(2015B074)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.020

O657.72；O622.5

A

1004-4957(2017)02-0267-05

*通訊作者：王 樂，博士，高級工程師，研究方向：食品及食品接觸制品品質研究與分析，Tel：0531-88527039，E-mail：dingshenyong@163.co