張志強(qiáng)，王麗娟，安東各，涂光忠，趙 陽

(1.北京微量化學(xué)研究所，北京 100091；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

保健食品中壯陽類西藥成分的核磁共振氫譜定量分析

張志強(qiáng)1*，王麗娟1，安東各1，涂光忠1，趙 陽2

(1.北京微量化學(xué)研究所，北京 100091；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

建立了保健食品中枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非的核磁共振氫譜定量(1H qNMR)分析方法。采用布魯克Avance DRX 500超導(dǎo)核磁共振波譜儀，以氘代二甲亞砜為溶劑，2,3,5-三碘苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物，優(yōu)化了儀器采集參數(shù)，并進(jìn)行了方法驗(yàn)證。結(jié)果表明：當(dāng)內(nèi)標(biāo)添加量為2 mg、內(nèi)標(biāo)與待測化合物摩爾比在1∶0.1～1∶1.2范圍時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)不小于0.999；枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非的檢出限分別為0.045，0.026，0.033 mg/mL，定量下限分別為0.218，0.128，0.159 mg/mL；日內(nèi)精密度RSD值分別為0.38%，0.85%，0.34%；日間精密度RSD值分別為0.72%，1.2%，1.4% 。利用所建立的方法對13種實(shí)際樣品進(jìn)行定量分析；并將測試結(jié)果與HPLC-DAD法測試結(jié)果進(jìn)行比較，兩種測試結(jié)果的RSD在1%～8%之間。

核磁共振氫譜定量；保健食品；枸櫞酸西地那非；他達(dá)拉非；伐地那非

保健食品產(chǎn)銷門檻低，利潤高。不法商販為了牟取高額利潤，常在“補(bǔ)腎壯陽類”保健食品中添加大量的枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非等西藥成分，以達(dá)到其宣稱的“補(bǔ)腎壯陽”、“速效”、“持久”等功效。但大量攝入此類西藥，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害食用者身體健康，甚至造成死亡[1]。保健食品的非法添加現(xiàn)象已引起社會(huì)和政府的高度關(guān)注，相關(guān)部門也加大了對保健食品的管理和查處力度。

中藥及保健食品中非法添加化學(xué)藥品的檢測方法主要有薄層色譜法[2]、液相色譜法[3]、液質(zhì)聯(lián)用法[4]、毛細(xì)管電泳法和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法[7-8]、近紅外光譜法和傅立葉變換紅外光譜法[9-10]、拉曼光譜法和表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11-12]等。但隨著檢測設(shè)備的更新?lián)Q代和樣品多樣化的擴(kuò)展，社會(huì)對分析測試科學(xué)在檢測手段和檢測能力如時(shí)效性、準(zhǔn)確性、可靠性等方面提出了更高要求。近年來，運(yùn)用1H qNMR進(jìn)行定量檢測的研究逐年增多，Pauli等[13]對近90篇關(guān)于1H qNMR測定天然產(chǎn)物的文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述；張偉等[14]運(yùn)用核磁共振法對8種生物胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的純度進(jìn)行了定值；中國、美國和歐洲藥典也收錄了核磁共振定量方法的應(yīng)用。

保健食品種類復(fù)雜、有機(jī)雜質(zhì)含量高，傳統(tǒng)的檢測方法通常需要繁瑣的分離、凈化步驟，對檢測方法的適應(yīng)性具有較高要求。核磁共振氫譜定量(1H qNMR)分析技術(shù)以信號(hào)強(qiáng)度(譜峰的峰面積)與產(chǎn)生該信號(hào)的1H核數(shù)目成正比為理論依據(jù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：樣品制備環(huán)節(jié)少、質(zhì)控性強(qiáng)、可多組分同時(shí)檢測、同步實(shí)現(xiàn)定性和定量分析、受樣液中色素等有機(jī)雜質(zhì)干擾小、內(nèi)標(biāo)物選擇范圍廣、特定物質(zhì)有特定吸收峰可直接定性、樣品可回收等。本文針對補(bǔ)腎壯陽及抗疲勞類保健食品中常見的枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非和伐地那非成分建立了1H qNMR檢測方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XS205DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；500 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(Avance DRX 500，瑞士Bruker公司)，配5 mm寬帶多核(BBFO plus)探頭)。

枸椽酸西地那非標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.8%)、他達(dá)拉非(純度99.9%)、伐地那非標(biāo)準(zhǔn)品(純度90.5%)均為European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare產(chǎn)品；2,3,5-三碘苯甲酸(純度99.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)；二甲基亞砜DMSO-d6(氘代率99.9%，美國CIL公司)。

1.2 核磁測試溶液的配制

1.2.1 待測化合物母液 稱取標(biāo)準(zhǔn)品枸櫞酸西地那非66.64 mg、他達(dá)拉非39.16 mg、伐地那非48.81 mg，加DMSO-d6至10.349 89 g，配制成枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非濃度分別為6.44，3.78，4.72 mg/g的混合母液。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)母液 稱取2,3,5-三碘苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品100.46 mg于5.00 mL容量瓶中，用DMSO-d6溶解并定容，配制成0.020 09 g/mL的內(nèi)標(biāo)母液。

圖1 枸櫞酸西地那非(A)、伐地那非(B)、他達(dá)拉非(C)及三者混合物(D)的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectra of sildenafil(A)，vardenafil(B) and tadalafil(C) and the mixture of them(D)

1.2.3 供試溶液 線性范圍測試溶液：分別稱量適量混標(biāo)溶液并加入100 μL內(nèi)標(biāo)母液，加DMSO-d6至約0.60 mL，配制成內(nèi)標(biāo)與化合物的摩爾比分別為1∶0.1，1∶0.3，1∶0.5，1∶0.8，1∶0.95，1∶1，1∶1.2的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品試液的配制：選取代表性樣品，粉碎、混勻后稱取適量，加入100 μL內(nèi)標(biāo)母液，用0.66 mL DMSO-d6溶解，超聲萃取10 min，以 9 000 r/min離心3 min，移取0.60 mL上清液至核磁管中待測。

1.3 核磁共振譜儀參數(shù)

譜寬為8 012 Hz，中心頻率設(shè)置為3 250 Hz。脈沖寬度8 μs，掃描間隔時(shí)間20 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 待測化合物定量特征峰的選擇

測試得到3種化合物及其混合物的氫譜(見圖1)。3種化合物的化學(xué)位移主要分布在δ0～δ2，δ2～δ4.5，δ6～δ8，δ11～δ13，在實(shí)際檢測中，δ2～δ6區(qū)域易受樣品基質(zhì)干擾，δ11～δ13區(qū)域?yàn)榛顫姎湫盘?hào)，均不適合作定量特征峰。

枸櫞酸西地那非和伐地那非在δ6～δ8區(qū)域和δ0～δ2區(qū)域，相近的峰互相重疊，所以當(dāng)枸櫞酸西地那非與伐地那非共存時(shí)，先用δ1.20～δ1.23處的三重峰(3H)對伐地那非進(jìn)行定量，然后按比例由δ6～δ8區(qū)域的峰計(jì)算枸櫞酸西地那非的含量。各化合物的定量峰選擇如下：枸櫞酸西地那非：δ7.816～δ7.870的峰組(2H)；伐地那非：δ7.92～δ7.97處的峰組(2H)；δ1.204～δ1.233處的三重峰(3H)；他達(dá)拉非：δ7.525～δ7.541處的二重峰(1H)。

2.2 內(nèi)標(biāo)化合物的選擇

參考Torgny等[15]考察的25種內(nèi)標(biāo)物，本實(shí)驗(yàn)以2,3,5-三碘苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)，以δ8.268～δ8.414(1H)的雙峰作為其定量特征峰。該內(nèi)標(biāo)物不干擾待測物的測定，與待測物定量特征峰的化學(xué)環(huán)境相似，溶解性良好。

圖2 伐地那非在不同脈寬下與內(nèi)標(biāo)峰面積之比隨掃描間隔時(shí)間的變化關(guān)系Fig.2 Ratio of vardenafil's quantitative peak areas to internal standard in various pulse width conditions with relaxation delay values changes pulse width(1-4):30°，45°，60°，90°

2.3 掃描間隔時(shí)間和脈沖寬度的優(yōu)化

分別測試了在30°，45°，60°，90°脈沖寬度下，待測化合物與內(nèi)標(biāo)定量特征峰面積的比值隨掃描間隔時(shí)間(D1)改變發(fā)生的變化(見圖2)。結(jié)果表明，90°脈沖寬度下，掃描間隔時(shí)間大于25 s時(shí)，待測化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值趨于穩(wěn)定。

采用小角度的脈沖寬度可以更快地達(dá)到完全弛豫，有效縮短測試時(shí)長。但脈沖角度太小時(shí)，信號(hào)響應(yīng)低，信噪比差，積分效果不穩(wěn)定，誤差較大。

綜合以上因素，本實(shí)驗(yàn)選擇60°脈沖寬度，即8 μs，掃描間隔時(shí)間設(shè)置為20 s。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 按“1.3”測試條件測定“1.2.3”所述線性范圍測試溶液，以化合物與內(nèi)標(biāo)的摩爾比為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到3種化合物的線性方程為：枸櫞酸西地那非：y=0.033 4x+0.071 6，r2=0.999 4；伐地那非 ：y=0.023 5x+0.033 0,r2=0.999 5；他達(dá)拉非：y=0.007 8x+0.033 3，r2=0.999 7。

2.4.2 檢出限(LOD)與定量下限(LOQ) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)化合物的摩爾比為1∶0.01時(shí)，枸櫞酸西地那非與伐地那非混合峰組(δ7.90)的信噪比為17.76，他達(dá)拉非(δ7.53)的信噪比為4.21，伐地那非(δ1.15)已接近噪音，此時(shí)掃描次數(shù)達(dá)到32次，測定時(shí)間約20 min，再增加掃描次數(shù)所得到信噪比的增長率降低，時(shí)間效益較低，因此認(rèn)為此點(diǎn)為3種物質(zhì)的檢出限，即枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非的檢出限分別為0.045，0.026，0.033 mg/mL。

當(dāng)內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)化合物的摩爾比為1∶0.05時(shí)，枸櫞酸西地那非與伐地那非混合峰組(δ7.90)的信噪比為55.48，他達(dá)拉非(δ7.53)的信噪比為13.64，伐地那非(δ1.15)的信噪比為40.84，可認(rèn)為是此3種物質(zhì)的定量下限，即枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非的定量下限分別為0.218，0.128，0.159 mg/mL。

2.4.3 儀器精密度與日內(nèi)、日間精密度 對內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)化合物摩爾比1∶0.95標(biāo)準(zhǔn)溶液，用優(yōu)化后的條件連續(xù)測試10次，以2,3,5-三碘苯甲酸δ8.32峰面積為1，記錄各目標(biāo)化合物定量峰面積，計(jì)算得到為櫞酸西地那非、他達(dá)拉非及伐地那非的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.16%，0.25%，0.45%。

選取內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)化合物的摩爾比1∶0.95標(biāo)準(zhǔn)溶液，用優(yōu)化后的條件間隔4，8，12，24，48，72 h分別進(jìn)行測定，記錄化合物對內(nèi)標(biāo)的定量峰面積比，計(jì)算得到枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非的日內(nèi)RSD值分別為0.38%，0.85%，0.34%，日間RSD值分別為0.72%，1.2%，1.4% 。

本文對粉劑、丸劑、片劑、硬膠囊、軟膠囊5種劑型共13個(gè)樣品分別用HPLC法[16]與1H qNMR法進(jìn)行了測試，結(jié)果見表1和圖3。對同一樣品通過兩種方法得到的含量進(jìn)行對比分析，RSD值在1%～8%之間，準(zhǔn)確度符合方法比對的要求。由于取樣量小(2～20 mg)、樣品均勻度不夠等原因，會(huì)導(dǎo)致測試存在誤差，但偏差較小。

圖3 軟膠囊的HPLC譜圖(A)及1H NMR譜圖(B)Fig.3 HPLC chromatogram(A) and 1H NMR spectra(B) of soft capsule

TestNo．Sample1HqNMRresult(%)HPLCresult(%)RSD(%)VDSDTDVDSDTDSildenafilTadalafil1Powder10000 010 010 01--2Powder20000 010 010 01--3Powder30000 010 010 01--4Pill1015 0700 0113 990 015 3-5Pill200 0000 010 010 01--6Pill3028 0100 0127 280 011 9-7Tablet1021 7600 0120 960 002 6-8Tablet201 5900 061 410 018 3-9Tablet3021 8600 0222 190 011 0-10Capsule100000 040--11Capsule2098 5900 0190 170 016 3-12Capsule3071 4900 0169 510 012 0-13Softcapsule001 15001 24-5 3

*VD：vardenafil，SD：sildenafil，TD：tadalafil；“-” no data

3 結(jié) 論

本文以氘代二甲亞砜為溶劑，2,3,5-三碘苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物，確定了定量檢測枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非和伐地那非的最佳分析條件。該方法檢測枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非和伐地那非的相關(guān)系數(shù)r2≥0.999，檢出限分別為0.045，0.026，0.033 mg/mL，定量下限分別為0.218，0.128，0.159 mg/mL；目標(biāo)化合物枸櫞酸西地那非、他達(dá)拉非和伐地那非的日內(nèi)精密度RSD值分別為0.38%，0.85%，0.34%，日間精密度RSD值分別為0.72%，1.2%，1.4% 。分別采用本方法與HPLC-DAD法測試相同樣品，兩種方法測定結(jié)果的RSD值在1%～8%之間，驗(yàn)證了1H qNMR法的準(zhǔn)確性。本方法只有一步萃取環(huán)節(jié)，操作簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)進(jìn)行定性鑒別與定量測定，且無需待測物標(biāo)準(zhǔn)品，不會(huì)造成交叉污染，適用于食品或藥品中非法添加物質(zhì)的定性與定量檢測。

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Determination of Anti-impotence Pharmaceutical Components in Dietary Supplements by1H qNMR

ZHANG Zhi-qiang1*，WANG Li-juan1，AN Dong-ge1，TU Guang-zhong1,ZHAO Yang2

(1.Beijing Institute of Microchemistry，Beijing 100091，China；2.Institute of Forensic Science，Ministry of Public Security P.R.C，Beijing 100038，China)

A method of1H qNMR was developed for the determination of sildenafil citrate，tadalafil and vardenafil added in dietary supplements illegally.In this experiment，Bruker Avance DRX 500 was applied，with deuterated dimethylsulfoxide(DMSO-d6) as solvent and 2,3,5-triiodobenzoic acid as internal standard substance.The spectral width，center frequency，pulse width，relaxation delay and the number of scans were optimized，and the method was validated.The results showed that,the correlation coefficients for the linear regression were not less than 0.999.The detection limits of the method for sildenafil citrate，tadalafil and vardenafil were 0.045，0.026，0.033 mg/mL，and the quantitation limits were 0.218，0.128，0.159 mg/mL，respectively.The inter-day RSDs were 0.38%，0.85%，0.34%，and the intra-day RSDs were 0.72%，1.2%，1.4%，respectively.The accuracy of the method was also verified by comparing the results of1H qNMR and HPLC-DAD，testing the same 13 samples.The results showed that the RSDs of two methods were between 1% and 8%.

1H qNMR；dietary supplements；sildenafil citrate；tadalafil；vardenafil

2016-09-07；

2016-09-30

北京市科技計(jì)劃(Z151100001215006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.018

O482.532;TQ460.72 6

A

1004-4957(2017)02-0257-05

*通訊作者：張志強(qiáng)，碩士，研究方向：復(fù)雜體系的微量綜合剖析，Tel：010-62887860-110，E-mail：zhang33_zzq@163.com