瑙 甘,金鈺龍*,黃嫣嫣,趙 睿*

(1.中國科學院化學研究所，中國科學院活體分析化學重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院大學，北京 100049)

腦啡肽的固相合成與LC-MS/MS分離鑒定

瑙 甘1,2,金鈺龍1,2*,黃嫣嫣1,2,趙 睿1,2*

(1.中國科學院化學研究所，中國科學院活體分析化學重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院大學，北京 100049)

多肽在生命過程中扮演著重要的角色，對其生理生化功能的研究與應用，離不開對單一多肽物質的需求，而化學合成法是獲取目標多肽的最有效方法之一。對合成產物的分離與鑒定，是優(yōu)化合成條件，以得到高產率的重要保證。以兩種內源性神經肽亮氨酸腦啡肽和甲硫氨酸腦啡肽為模型，利用Fmoc固相多肽合成策略對其進行合成，并建立了HPLC-ESI-MS/MS新方法用于所制備的亮氨酸腦啡肽和甲硫氨酸腦啡肽的分離與結構鑒定。研究結果顯示，主要合成產物均為目標多肽，副產物主要包括C端丟失1個氨基酸所形成的四肽，以及由于甲硫氨酸殘基氧化而形成的含甲硫氨酸亞砜的多肽。該研究為高效合成含敏感氨基酸的生理活性多肽提供了新信息。

多肽固相合成；甲硫氨酸腦啡肽；亮氨酸腦啡肽；氧化；液相色譜-質譜聯(lián)用

多肽是由氨基酸通過酰胺鍵連接形成的、大小介于氨基酸與蛋白質之間的重要生理活性物質。多肽既是蛋白質的重要組成部分，同時作為生命物質，其自身也參與生物體內眾多的分子事件，并發(fā)揮著重要的生理生化功能。多肽在生物體內可作為神經遞質、神經調質和激素等，通過與受體相互作用影響細胞間的信號傳導與信息交流。以多肽為識別功能單元的分子探針可被應用于生命相關活性分子的檢測[1-4]；利用多肽特異性識別靶分子的特點，發(fā)展了基于多肽識別的靶向藥物運輸體系[5-6]。此外，多肽在醫(yī)藥、材料領域也得到越來越廣泛的應用，可構建諸如納米籠、納米管、納米纖維等結構的自組裝體，具有催化、模擬生物分子結構等功能[7-8]；多肽也因其生物相容性好、毒副作用小，被應用于抗癌、抗病毒、抗心腦血管等疾病的藥物，并顯示出誘人的發(fā)展前景。

無論是多肽的功能研究還是多肽的生物化學應用，均離不開對多肽純品的需求。相比于生物制備方法，多肽的化學合成方法具有制備簡單、合成效率高、易于自動化等優(yōu)勢。自1963年 Merrifield教授等[9-10]發(fā)展了多肽固相合成(Solid phase peptide synthesis，SPPS)這一獨創(chuàng)性的方法以來，引起了多肽合成領域的革命性轉變，Merrifield教授也因此獲得了1984年諾貝爾化學獎。目前多肽的固相化學合成已成為最重要的多肽制備方法之一，SPPS除了可以合成含有天然氨基酸的多肽之外，還能夠合成含有非天然氨基酸的多肽，大大增加了合成多肽的多樣性和信息量。然而由于多肽的基本結構單元除20種天然氨基酸外還有眾多的衍生物，其側鏈基團結構差異大，且性質各異，極易造成制備過程中偶聯(lián)效率低，以及氨基酸殘基的消旋、敏感位點的修飾等副反應，因此多肽的高效合成與純化鑒定仍然是亟需解決的關鍵問題。

高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)是復雜樣品分離的重要手段，具有高效、快速、高靈敏度、應用范圍廣等特點，質譜(Mass spectrometry，MS)通過檢測帶電粒子的質荷比(Mass to charge ratio,m/z)而實現(xiàn)對化合物的結構鑒定，將HPLC與MS相結合，可充分發(fā)揮色譜對復雜樣品的高效分離能力，以及質譜高選擇性、高靈敏度檢測及提供結構信息的能力，在多肽的分離、鑒定、純化中發(fā)揮著越來越重要的作用[11-13]。

腦啡肽(Enkephalin)是一種分布在中樞神經系統(tǒng)的五肽，被稱為內源性神經肽。1975年科學家研究發(fā)現(xiàn)有兩種天然存在的內源性腦啡肽，分別為亮氨酸腦啡肽(Leucine-enkephalin,Leu-ENK)和甲硫氨酸腦啡肽(Methionine-enkephalin，Met-ENK)，其區(qū)別僅在于C端第1個氨基酸。腦啡肽除鎮(zhèn)痛作用[14]外，還可參與神經內分泌與免疫系統(tǒng)間的循環(huán)，免疫調節(jié)[15]，感情行為的控制[16]，促進傷口恢復[17]，輔助抗癌作用[18]等。

本文以Leu-ENK和含敏感氨基酸的Met-ENK為模型對象，采用Fmoc多肽固相合成策略，對兩種腦啡肽進行了固相化學合成。建立了腦啡肽合成產物的LC-MS/MS分離分析新方法，對多肽粗產物中的幾種主要成分進行了結構鑒定，并進一步提出了合成條件的優(yōu)化方法。該研究為含敏感氨基酸的生理活性多肽的高效制備以及快速LC-MS/MS鑒定提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，吉爾生化有限公司)；Fmoc-AA-Wang樹脂(Advanced Chemtech公司，美國)；Fmoc-AA-OH與乙二硫醇(EDT)均購自美國Siam公司；三氟乙酸(TFAs，Sigma-Aldrich公司，美國)；甲酸(FA，Dikma公司，中國)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司，美國)；N-甲基嗎啡啉(NMM)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、六氫吡啶均為分析純，購自北京化工廠；三異丙基硅烷(TIS，百靈威科技有限公司，中國)；實驗用水為超純水，由美國Millipore公司的Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備。

UHPLC-ESI-IT-MS/MS為配備二極管陣列檢測器(DAD-3000RS)的Ultimate 3000 UHPLC串聯(lián)LCQ Fleet質譜儀(Thermo Fisher公司，美國);Halo Peptide ES-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,2 μm,Advanced Materials Technology公司，美國);SKY-100C恒溫培養(yǎng)振蕩器(Sukun公司，中國)；分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)。

1.2 腦啡肽的固相合成

采用Fmoc固相肽合成法對Leu-ENK和Met-ENK進行合成,其合成過程主要包括3部分：樹脂上Fmoc保護基的脫除、多肽鏈的延長以及多肽從樹脂上的裂解。Leu-ENK的序列為YGGFL，Met-ENK的序列為YGGFM。將Fmoc-Leu-Wang Resin和Fmoc-Met-Wang Resin分別裝入多肽合成管中，加入足量的DMF溶液浸泡樹脂至少30 min，使其充分溶脹。采用DMF清洗3次。在磁力攪拌下加入20%六氫吡啶/DMF溶液(3 mL)以從氨基酸的N-端脫掉Fmoc-保護基，反應2次，每次10 min。采用Kaiser試劑[19]對樹脂進行檢測。脫保護成功后用DMF洗滌樹脂6次，以除去殘留的六氫吡啶。

在氨基酸偶聯(lián)步驟中，使用0.4 mol/L的N-甲基嗎啡啉/DMF溶液作為堿性催化劑，將3倍量Fmoc-氨基酸和3倍量HBTU加入上述N-甲基嗎啡啉/DMF溶液中進行活化，將活化后的氨基酸溶液加入多肽合成管中，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中反應1 h(T=40 ℃,n=140 r/min)。反應結束后，進行Kaiser檢測，樹脂不變藍色表明反應完全，否則延長時間或重復偶聯(lián)。重復上述步驟以完成多肽的延長。合成完成后用二氯甲烷置換樹脂珠上殘存的DMF，再用甲醇收縮樹脂，真空干燥2 h，置于冰箱保存。

在多肽裂解步驟中，取所合成的干燥多肽-樹脂于玻璃瓶中，添加裂解液(20 mL/g樹脂)，置于冰浴中磁子攪拌反應15 min，隨后在室溫條件下反應2 h。對于Leu-ENK，裂解液組成為：TFA∶H2O=95∶5(體積比)；對于Met-ENK，裂解液組成為：TFA∶EDT∶H2O=95∶2.5∶2.5(體積比)。裂解反應后過濾除去樹脂，并用少量裂解液洗滌樹脂兩次，將得到的濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至約1 mL，隨后將預冷的乙醚加入到上述多肽/TFA溶液中，靜置，使多肽析出。將此渾濁液轉移至離心管內，離心，除去上清液，并用冷乙醚洗滌沉淀兩次。將含有多肽固體的離心管置于真空干燥器中干燥2 h去除乙醚，得到多肽粗產品。

1.3 多肽粗品的LC-UV-MS/MS分析

UHPLC-UV-MS/MS分析，色譜系統(tǒng)：Thermo Fisher UHPLC-UV-LCQ-MS；色譜柱：Halo Peptide ES-C18(2.1 mm×150 mm,2 μm)；流動相:A為0.1% FA/H2O，B為0.1% FA/CH3CN；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～10 min,5%～60% B;10～10.01 min,60%～80% B;10.01～13 min,80%B。質譜掃描模式為正離子模式；毛細管溫度：300 ℃；噴霧電壓：4.5 kV；二極管陣列檢測器監(jiān)測波長：220 nm。通過數(shù)據(jù)依賴性掃描模式(data dependent MS/MS,ddMS2)采集二級質譜信號。

2 結果與討論

2.1 腦啡肽合成

多肽合成的基礎，是氨基與羧基之間形成酰胺鍵的縮合反應。固相肽合成技術是使多肽合成在不溶性的固相載體上進行，其突出的特點是，可以使用過量的試劑使反應趨于完全，在反應結束后，通過簡單的過濾，很容易地除掉過量的反應試劑，并將樹脂洗滌干凈以進行下一步反應。固相肽合成是需重復進行的多步反應。由于對多肽合成反應的深入研究，理論上每一個偶聯(lián)循環(huán)幾乎可以達到99%以上的產率。在經過n次偶聯(lián)循環(huán)，可以獲得近于[99%]n的總收率。然而，由于氨基酸結構的差異、性質的不同，以及序列的多樣性，使得合成多肽的產率遠不能達到預期，因此多肽的高效合成仍然成為多肽研究中亟待解決的問題。

圖1 Met-ENK與Leu-ENK的化學結構式與氨基酸序列Fig.1 Chemical structures and amino acid sequences of Met-ENK and Leu-ENK

Fmoc固相肽合成[20]的基本步驟是將第一個氨基酸通過其羧基與固相載體上的羥基進行反應，以共價鍵連接于固相載體上。然后以六氫吡啶脫掉氨基酸的α-氨基保護基，形成游離氨基；將下一個氨基酸的游離羧基與此游離氨基在偶聯(lián)試劑作用下進行反應，以形成新的酰胺鍵；反復進行脫保護和偶聯(lián)過程，便可以不斷地延長肽鏈；最后，將目的多肽從固相載體上裂解下來，同時脫掉側鏈保護基，得到目標多肽。本研究采用Fmoc戰(zhàn)略進行了亮氨酸腦啡肽和甲硫氨酸腦啡肽的合成，其化學結構式及氨基酸序列如圖1所示。

2.2 腦啡肽粗產物的LC-UV-MS分離分析

在多肽的高效化學制備中，為了優(yōu)化合成條件，減少副產物，提高多肽合成產率，需對多肽合成粗產物進行HPLC-UV分離分析及MS/MS鑒定。

圖2 甲硫氨酸腦啡肽合成粗產物(a)及亮氨酸腦啡肽合成粗產物(b)的UHPLC譜圖Fig.2 UHPLC chromatograms of crude product of Met-ENK(a) and Leu-ENK(b)

首先采用UHPLC-UV-MS聯(lián)用的方法，對Met-ENK和Leu-ENK的合成粗產物進行分離分析，UHPLC-UV結果如圖2所示，無論是Met-ENK或是Leu-ENK，除主峰外，均存在一定程度的雜峰。對于Met-ENK合成粗產物(圖2a)，保留時間為5.48 min的色譜峰4具有最大的峰面積，是主產物，其一級質譜圖中出現(xiàn)質荷比分別為574.4和1 147.5的信號(表1)，分別與Met-ENK的單電荷分子離子峰[M+H]+(理論m/z= 574.2)以及單電荷二聚體[2M+H]+(理論m/z=1 147.4)相吻合，因此推測粗產物中的主要成分峰4即目標五肽YGGFM，通過峰面積歸一化法計算出Met-ENK的含量為79.8%。粗產物中主要存在兩種副產物，色譜圖中分別標記為峰2和峰3，保留時間分別為4.29 min和4.72 min，保留時間均比Met-ENK短，根據(jù)反相色譜分離理論，產物峰2和峰3具有比Met-ENK更大的極性。一級質譜表征結果顯示，峰2的質荷比(m/z)為590.2([M+H]+)，比Met-ENK多16 Da，可能是目標物的單加氧產物YGGFM(O)，由于其極性大于目標多肽Met-ENK，因此其保留時間縮短。Met-ENK中易被氧化的位點有甲硫氨酸殘基、苯丙氨酸殘基和酪氨酸殘基，因此，峰2可能是Met-ENK中甲硫氨酸殘基被氧化為亞砜，或苯丙氨酸殘基側鏈被氧化為苯酚，或酪氨酸殘基側鏈苯酚被氧化形成鄰二酚的產物。峰3的質荷比(m/z)為443.1([M+H]+)，比Met-ENK少131 Da，減少的部分與甲硫氨酸殘基質量相符，初步推測可能是C端丟失1個氨基酸殘基而形成的四肽YGGF。

表1 腦啡肽粗產物主要色譜峰的保留時間及對應質譜信號Table 1 Retention times and signals of main peaks of crude enkephalin

對于亮氨酸腦啡肽合成粗產物，如圖2b所示，樣品中主要成分色譜峰8的保留時間為5.99 min，其一級質譜圖中出現(xiàn)質荷比分別為556.4和1 111.5的信號(表1)，這分別與亮氨酸腦啡肽的單電荷分子離子峰[M+H]+(理論m/z= 556.3)以及單電荷二聚體 [2M+H]+(理論m/z= 1 111.5)相吻合，推測其為目標產物Leu-ENK，通過峰面積歸一化法計算Leu-ENK粗產物的含量為85.2%。從圖2B中可見主要雜質色譜峰7，保留時間為4.71 min，這與Met-ENK粗產物中的峰3保留時間(4.72 min)相近，色譜峰7的一級質譜圖中可見質荷比(m/z)為443.2([M+H]+)的信號，與峰3質荷比(m/z) 443.1([M+H]+)接近，初步推測該產物同樣是C端丟失1個氨基酸而形成的四肽YGGF。

2.3 Met-ENK合成粗產物的LC-MS/MS分析與結構鑒定

僅通過一級質譜信號對多肽合成粗產物中的不同成分進行定性是不夠的，特別是在低分辨質譜中，分子量接近的物質易引起誤判。MS/MS通過對選取的母離子進行碎裂，進一步對碎片離子信號進行分析，可獲得多肽序列以及豐富的氨基酸修飾信息，這已成為多肽以及蛋白質分析的重要手段。

因此，為了確證腦啡肽粗產物的結構，并解釋出現(xiàn)副產物的原因，進一步做了LC-MS/MS分析。圖3(A～C)為Met-ENK各組分的二級質譜圖。首先選取色譜峰4 質荷比為574.4的母離子進行碎裂，如圖3A所示，主產物峰4的二級質譜信號中豐度較大的為酰胺鍵斷裂后電荷保留于N端形成的b系列碎片離子b2(221.1),b3(278.0),b4(424.9)和b5(556.0)，以及酰胺鍵斷裂后電荷保留于C端形成的y系列碎片離子y2(297.0),y3(354.0),y4(411.1)和y5(574.0)，與氨基酸殘基的分子量比對后，確證主產物峰4對應于目標多肽Met-ENK。

選取色譜峰2的分子離子峰(m/z=590.2)作為母離子進行二級碎裂，碎片信號如圖3B所示，碎片離子b4和b5(O)的質荷比分別為 424.9和572.1，兩者之差為147 Da，恰好是甲硫氨酸亞砜殘基的分子量，因此表明氧化位點發(fā)生在Met-ENK的甲硫氨酸殘基上，而非酪氨酸殘基或苯丙氨酸殘基。進一步與色譜峰4的碎片離子信號進行比較后，發(fā)現(xiàn)兩色譜峰對應的b2-b4碎片離子質荷比相同，而峰2的b5碎片信號比峰4的b5碎片大16，因此可以推斷峰2對應的副產物氧化位點為C端甲硫氨酸殘基。在單位分辨質譜的MS/MS鑒定中，往往很難區(qū)分甲硫氨酸亞砜殘基與苯丙氨酸殘基，因為它們的分子量均為147 Da。在本實驗中,b5(O)(m/z=572.1)丟失64 Da，產生質荷比(m/z)為508.2的碎片，這種特征的中性丟失信號(64 Da)是由于甲硫氨酸殘基側鏈的甲次磺酸在碰撞誘導解離(CID)條件下，經過分子內重排反應脫落所致，斷裂機理如圖3D所示，這些碎片離子進一步證明了甲硫氨酸亞砜殘基的存在。綜上所述，Met-ENK中的甲硫氨酸殘基易于在合成過程中發(fā)生氧化形成甲硫氨酸亞砜。因此在含敏感氨基酸甲硫氨酸殘基的多肽裂解過程中，需保持無氧環(huán)境(氮氣保護)，多肽裂解時間盡可能縮短，這將有效降低形成氧化產物的比例。

色譜峰3的二級碎片信號如圖3C所示，檢測到a系列碎片離子：a1(136.0)和a4(397.0)，b系列碎片離子：b2(221.0)，b3(278.0)，b4(425.0)，以及y系列碎片離子：y2-Met(166.0)，y3-Met(223.0)，y4-Met(280.0)，這表明氨基酸殘基缺失出現(xiàn)在C端第一位。進一步與色譜峰4的碎片離子信號比較可發(fā)現(xiàn)，兩色譜峰對應的y2-y4碎片離子質荷比均相差131，此為甲硫氨酸殘基的分子量，表明峰3對應的副產物為C端丟失甲硫氨酸殘基而形成的殘缺肽。推測在偶聯(lián)苯丙氨酸的過程中，苯丙氨酸活化的羧基除連接在甲硫氨酸的氨基上形成酰胺鍵外，還直接與樹脂上的羥甲基相連形成酯鍵。出現(xiàn)這種結果的可能原因是Fmoc-aa-Wang樹脂存在游離的羥甲基所致。

圖2a中其他雜質色譜峰(1，5，6號峰)的含量均小于2%，進一步的MS和MS/MS分析表明，峰1為酪氨酸側鏈保護基未脫去的副產物Y(tBu)GGFM，峰5和峰6分別為YGGFMM和YGGFMM(O)。

2.4 Leu-ENK合成粗產物的LC-MS/MS分析與結構鑒定

Leu-ENK主成分(峰8)的MS/MS分析結果如圖4A所示，其中豐度較大的為酰胺鍵斷裂后電荷保留于N端形成的b系列碎片離子：b2(221.0)，b3(278.0)，b4(425.0)，b5(538.1)，同時還可觀察到酰胺鍵斷裂后電荷保留于C端形成的y系列碎片離子：y2(279.1)，y3(336.0)，y4(393.2)，y5(556.1)。綜合分析這兩個系列碎片離子，再根據(jù)系列碎片離子間的質量差可以確定峰8的氨基酸序列為YGGFL，即目標五肽Leu-ENK。

色譜峰7的二級碎片信號如圖4B所示，檢測到的碎片離子包括a系列碎片離子：a1(136.0)，a2(193.0)，a4(397.1)，b系列碎片離子：b2(221.0)，b3(278.0)，b4(425.0)，以及y系列碎片離子：y2-Leu(166.0)，y3-Leu(223.0)，y4-Leu(280.0)等，進一步與色譜峰8的碎片離子信號進行比較后，發(fā)現(xiàn)兩色譜峰對應的b2-b4碎片離子質荷比均相同，而y2-y4碎片離子質荷比均相差113，此為亮氨酸殘基的分子量，表明該副產物為目標物C端丟失亮氨基酸殘基所形成，其原理與Met-ENK丟失甲硫氨酸殘基形成的四肽相同。亮氨酸腦啡肽和甲硫氨酸腦啡肽合成粗品中，均檢測到C端丟失1個氨基酸殘基而形成的四肽副產物(YGGF)，其原因可能是Wang樹脂連接手臂末端存在游離的羥基所致。為克服上述問題，可提前使用乙酸酐進行封閉，以降低C端丟失1個氨基酸副產物的生成。

3 結 論

本文以兩種內源性腦啡肽為模型對象，采用Fmoc固相多肽合成策略對其進行了合成，通過HPLC-MS/MS對多肽合成粗產物進行了快速分離與結構鑒定，并對主要副產物的形成原因進行了分析。結果表明，主要副產物為兩類：一類是敏感氨基酸的氧化產物，另一類是由于樹脂封閉不完全所導致的C端殘缺肽。對其進行快速分析與結構鑒定，可為優(yōu)化合成條件，提高固相多肽合成產率提供快捷的指導，同時也為其他含敏感氨基酸的生理活性多肽的高效合成提供了借鑒。

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Separation and Characterization of Solid Phase Synthesized Enkephalins by LC-MS/MS

NAO Gan1,2,JIN Yu-long1,2*,HUANG Yan-yan1,2,ZHAO Rui1,2*

(1.CAS Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

Peptides play an important role in life process.In this paper,two endogenous neuropeptides including methionine enkephalin and leucine enkephalin were selected as research targets.They were synthesized by Fmoc solid phase peptide synthesis strategy.An HPLC-ESI-MS/MS method was established to investigate the composition of synthetic peptides.The possible structure modifications during peptide synthesis procedures were also identified.The results showed that the main byproducts were incomplete peptides and oxidative peptides.Solutions for high efficient synthesis of methionine enkephalin and leucine encephalin were further proposed.This study provides new perspectives in rapid peptide structure identification and efficient bioactive peptide synthesis.

solid phase peptide synthesis;methionine enkephalin;leucine enkephalin;oxidation;high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

2016-09-26；

2016-10-20

國家自然科學基金資助項目(21375134,21475140)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.006

O657.63;TQ936.16

A

1004-4957(2017)02-0190-06

*通訊作者：趙 睿，博士，研究員，研究方向：肽識別與選擇性分離分析，Tel:010-62557910，E-mail:zhaorui@iccas.ac.cn 金鈺龍，博士，助理研究員，研究方向：肽識別與選擇性分離分析，Tel:010-62557910,E-mail:jinyulong@iccas.ac.cn