羅志剛，何菁菁,3，賀玖明，再帕爾·阿不力孜，2*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中央民族大學(xué) 生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100081；3.教育部高等教育教學(xué)評(píng)估中心，北京 100081)

敞開式質(zhì)譜成像方法的組織樣品穩(wěn)定性研究

羅志剛1，何菁菁1,3，賀玖明1，再帕爾·阿不力孜1，2*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中央民族大學(xué) 生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100081；3.教育部高等教育教學(xué)評(píng)估中心，北京 100081)

以添加鎮(zhèn)靜催眠候選新藥N6-羥芐腺嘌呤核苷[N6-(4-hydroxybenzyl)adenine riboside，NHBA]的組織勻漿切片作為考察對(duì)象，對(duì)空氣動(dòng)力輔助離子化質(zhì)譜成像系統(tǒng)(Air Flow Assisted Ionization Mass Spectrometry Imaging，AFAI-MSI)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行考察與優(yōu)化，以保證最佳條件進(jìn)行樣品檢測。在此基礎(chǔ)上，對(duì)預(yù)處理的整體大鼠組織切片進(jìn)行平行的連續(xù)兩次質(zhì)譜成像分析，考察了其內(nèi)源性代謝物在成像分析過程中是否發(fā)生變化。通過對(duì)采集數(shù)據(jù)中關(guān)鍵質(zhì)譜峰的篩選等處理步驟，并采用可視化的主成分分析(PCA)方法，開展了組織樣品內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性分析，最終驗(yàn)證了采用該樣品前處理和質(zhì)譜成像方法，能夠保證組織切片樣品中內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性，為質(zhì)譜成像分析結(jié)果提供了可靠依據(jù)。

空氣動(dòng)力輔助離子化(AFAI)；敞開式質(zhì)譜成像(AMSI)；樣品穩(wěn)定性；藥物；內(nèi)源性代謝物

在新藥研發(fā)過程中，獲得藥物在體內(nèi)的靶向分布及原位信息對(duì)于了解藥物的吸收、分布、代謝和排泄情況，進(jìn)行藥效及毒理學(xué)的評(píng)價(jià)、藥代動(dòng)力學(xué)研究等均有著非常重要的意義[1]。質(zhì)譜成像(Mass spectrometry imaging，MSI)技術(shù)是結(jié)合了質(zhì)譜分析和影像可視化方法的分子成像技術(shù)，無需標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)不同分子或多種分子、高靈敏度的同時(shí)檢測，并能夠直接提供目標(biāo)化合物的空間分布和分子結(jié)構(gòu)信息，已成為藥物及體內(nèi)分子原位可視化分析的強(qiáng)有力工具，并廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究[2-5]。另外，敞開式質(zhì)譜離子化技術(shù)(Ambient mass spectrometry，AMS)的發(fā)展，為原位可視化的表面分析提供了一種新的手段，已成功地應(yīng)用于藥物分子[6-7]、天然產(chǎn)物[8]、指紋印章[9-10]等成像分析。本課題組自主開發(fā)的空氣動(dòng)力輔助離子化質(zhì)譜成像(AFAI-MSI)技術(shù)[2，7，11-14]，凸顯了敞開式質(zhì)譜成像技術(shù)的優(yōu)勢，該技術(shù)更適合于整體動(dòng)物體內(nèi)分子的質(zhì)譜成像分析，其主要特點(diǎn)為無需復(fù)雜樣品前處理、操作空間靈活且最大程度保持被測樣品的原位信息[15]。然而，對(duì)整體大鼠切片等大體積組織樣本的成像分析通常需耗時(shí)7～8 h，由于組織樣品在室溫和空氣中暴露時(shí)間長，則在此過程中，組織中藥物或內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性能否保證，成為敞開式質(zhì)譜成像技術(shù)需要關(guān)注的關(guān)鍵問題。

針對(duì)上述問題，本研究在優(yōu)化并保證AFAI-MSI系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，對(duì)質(zhì)譜成像過程整體大鼠組織切片中內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。通過對(duì)預(yù)處理的整體大鼠組織切片進(jìn)行平行的連續(xù)兩次質(zhì)譜成像對(duì)比，以前后兩次質(zhì)譜成像內(nèi)源性代謝物分子輪廓的比較為依據(jù)，結(jié)合對(duì)采集數(shù)據(jù)中關(guān)鍵質(zhì)譜峰的篩選等處理，并采用可視化的主成分分析(PCA)方法，開展了組織樣品及其內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，該樣品前處理及質(zhì)譜成像方法能夠保證組織切片中內(nèi)源性物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料

自主開發(fā)的AFAI-MSI系統(tǒng)：分別與QTRAP 5500型質(zhì)譜儀和Qstar-Elite 型Q-TOF 串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX，美國)相兼容的AFAI離子源接口；離子傳輸管(Length 500 mm，OD 4 mm，ID 3 mm)；氣體流量計(jì)(0～45 L·min-1，LZB-10WB，天津流量儀表有限公司)；高壓電源(-10 000～10 000 V，東文高壓電源(天津)股份有限公司)；三維電控平移臺(tái)(MTS225，北京光學(xué)儀器廠)；SC100步進(jìn)電機(jī)控制器(北京北光世紀(jì)儀器有限公司)。

Longer Pump注射泵(LSP01-2A，保定蘭格恒流泵有限公司)；萊卡冷凍切片機(jī)(萊卡CM 3600，德國)。Microtech掃描儀(MRS-2400A48U，上海中晶科技有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，Merck 公司，Darmstadt，Germany)；甲酸(色譜純，Dikma Technologies INC，CA，USA)；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。生理鹽水(吉林科倫康乃爾制藥有限公司)；干冰(北京龍潔斯經(jīng)貿(mào)有限公司)。鎮(zhèn)靜催眠候選新藥N6-羥芐腺嘌呤核苷[N6-(4-hydroxybenzyl) adenine riboside，NHBA]由藥物研究所石建功教授課題組提供。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性Wistar大鼠3只，體重(140～160) g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0007。

1.2 整體動(dòng)物組織切片及添加均一濃度NHBA的組織勻漿切片的制備

將3只Wistar雄性大鼠分別稱重，均作為空白實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹腔注射含吐溫80體積比為1∶100的生理鹽水溶液。20 min后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用CO2處死。將一只空白大鼠的皮毛用水沾濕后，右側(cè)臥固定置于模具中，倒入冷凍液，于-80 ℃冰箱中迅速冷凍，使大鼠及冷凍液凝結(jié)成一個(gè)整體固體后移入萊卡CM3600冷凍切片機(jī)中放置，先用粗切刀將包埋的大鼠切至主要臟器組織均出現(xiàn)在一個(gè)層面上后，改用精細(xì)切割刀具，再根據(jù)切片厚度要求切割3次。制作切片時(shí)，先將轉(zhuǎn)粘膠帶壓貼于待切割的模塊上，使其與模塊緊密接觸，設(shè)定切片厚度參數(shù)，在手動(dòng)模式下緩慢切下切片，然后將膠帶上粘有大鼠切片組織的一面向下，平整放置于表面涂有高聚物粘合劑的載玻片上(3 in.×4 in.×1.2 mm)，通過滾軸按壓使大鼠切片與載玻片表面緊密接觸，然后經(jīng)過強(qiáng)紫外燈的照射后，緩慢去除轉(zhuǎn)粘膠帶，完成組織切片的制作。20 μm是切片機(jī)能夠切出的整體組織切片的最小厚度，但在轉(zhuǎn)粘貼過程中易出現(xiàn)器官組織丟失的問題，60 μm和80 μm厚度的切片在成像過程中，會(huì)出現(xiàn)大塊組織被噴霧氣剝離進(jìn)入離子傳輸通道，進(jìn)而堵塞質(zhì)譜儀錐孔的問題，經(jīng)過優(yōu)化選定制作40 μm厚度的切片，將其用于內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性考察。摘取出另外2只空白大鼠的腦組織，用生理鹽水清洗后，部分腦組織用于空白組織切片的制備，余下部分加入等體積的4 ℃生理鹽水后，于冰浴中對(duì)組織進(jìn)行勻漿。然后在組織勻漿中加入配好的4 mg·mL-1的NHBA生理鹽水混懸液，渦旋混勻，得到50 pg·mg-1的均一濃度NHBA組織勻漿液，然后將其置于液氮中迅速冷凍。將冷凍好的組織勻漿塊放入用3.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液配制的冷凍液中，于-80 ℃迅速冷凍，采用上述相同步驟切割出40 μm厚度的冷凍勻漿切片，用于AFAI-MSI系統(tǒng)參數(shù)的優(yōu)化。

1.3 AFAI-MSI系統(tǒng)關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化

1.3.1 考察生物組織中基質(zhì)對(duì)NHBA離子化效率的影響 將等濃度的NHBA生理鹽水混懸液分別滴加到空白載玻片和空白組織切片上，在相同的條件下分別對(duì)3種切片及其樣品所在1 cm×1 cm的區(qū)域進(jìn)行AFAI-MSI分析，獲取相應(yīng)的像圖，并對(duì)像圖中NHBA的平均離子強(qiáng)度進(jìn)行比較。關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用與QTRAP 5500型質(zhì)譜儀相兼容的AFAI-MSI系統(tǒng)。

1.3.2 噴霧溶劑種類、流速及噴霧氣壓力的優(yōu)化 噴霧溶劑以甲醇、乙腈和水為主要考察對(duì)象，制備6種不同配比的混合溶劑(A，B，C，D，E，F(xiàn))作為電噴霧溶劑，將含均一濃度NHBA的腦組織勻漿切片作為考察對(duì)象，采用MRM的掃描模式，對(duì)組織中的NHBA特征離子對(duì)(m/z374.1→242.0)進(jìn)行檢測，通過比較其在不同噴霧氣壓力(0.4，0.5，0.6，0.7 MPa)和不同噴霧溶劑流速(5，10，15，20 μL·min-1)條件下，采用不同噴霧溶劑獲得的提取離子色譜圖(XIC)峰面積的差異，來選擇最優(yōu)溶劑條件。每個(gè)檢測條件下平行檢測3次，取平均值。

1.3.3 電噴霧針與樣品表面和離子傳輸管管口的距離優(yōu)化 以同樣的上述組織切片為考察對(duì)象，通過比較電噴霧針與樣品表面距離分別為0.4，0.5，0.7，1.0 mm，以及電噴霧針與離子傳輸管管口距離分別為2,3,5 mm時(shí)，獲得的特征離子對(duì)XIC圖上峰面積的差異，來確定最優(yōu)距離參數(shù)。每個(gè)檢測條件下平行檢測3次，取平均值。

1.4 整體大鼠組織切片的預(yù)處理

將待測整體大鼠組織切片從-80 ℃低溫冰箱取出后，立即置于真空干燥器中，干燥器底部放置硅膠顆粒，真空干燥1 h，使切片溫度平衡至室溫，并除盡切片表面及組織內(nèi)部水分，以防止組織中內(nèi)源性代謝物的進(jìn)一步生化反應(yīng)。

1.5 整體大鼠質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的采集

整體大鼠質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)采用與Q-TOF型質(zhì)譜儀相兼容的AFAI-MSI系統(tǒng)完成。為了考察組織切片中內(nèi)源性物質(zhì)在成像過程中的穩(wěn)定性，在對(duì)切片樣品進(jìn)行全程成像掃描后，將此切片的位置恢復(fù)至起始點(diǎn)，并以此初始位置為基準(zhǔn)，沿X軸向，從初始位置向后移動(dòng)0.15 mm后作為新的起始點(diǎn)，再次對(duì)該切片進(jìn)行相同條件下的全掃描質(zhì)譜成像分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，采用正離子全掃描模式，質(zhì)譜儀參數(shù)的設(shè)置與NHBA在整體動(dòng)物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)的相同[14]。數(shù)據(jù)分析采用Analyst QS 2.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.6 可視化的主成分分析用于組織切片樣品穩(wěn)定性的考察

將兩次掃描獲得的質(zhì)譜成像原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過峰篩選、像素點(diǎn)篩選、歸一化處理等與NHBA在整體動(dòng)物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)相同的處理步驟和可視化的主成分分析(PCA)[14]，通過比較連續(xù)兩次成像掃描所獲得的可視化的主成分分析像圖的差異，來評(píng)價(jià)組織樣品的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物組織基質(zhì)對(duì)NHBA離子化效率的影響

圖1 空白載玻片表面噴涂NHBA、空白組織切片表面噴涂NHBA及均勻添加NHBA組織切片的AFAI-MSI像圖及其平均離子強(qiáng)度比較，NHBA采用MRM掃描模式(m/z 374.1→242.0)Fig.1 Comparisons of the averaged ion intensity detected in MRM scan mode(m/z 374.1→242.0)，among NHBA on slides，on tissue sections and in homogenate tissue sections corresponding MSI images are under the bar graph，respectively

生物組織的成分復(fù)雜，對(duì)被測物的離子化會(huì)產(chǎn)生抑制或競爭的基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)于實(shí)際給藥組織切片的AFAI-MSI分析，由于被測藥物分子需在噴霧溶劑作用下從組織中解析出來，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)離子化，因此受基質(zhì)效應(yīng)影響存在一定的離子信號(hào)抑制。如圖1所示，同等濃度的被測藥物(NHBA)滴加在空白載玻片和空白組織切片上，以及含等濃度NHBA的組織勻漿切片，在相同條件下對(duì)其進(jìn)行成像分析，所獲得的離子強(qiáng)度在空白載玻片中最高，而在組織勻漿添加藥物制得的切片中最低。因此，在考察組織切片樣品穩(wěn)定性之前，需針對(duì)添加藥物的組織勻漿切片，在最接近給藥動(dòng)物組織切片的真實(shí)情況下，對(duì)AFAI-MSI方法的系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 噴霧溶劑種類、流速及噴霧氣壓力的優(yōu)化結(jié)果

噴霧溶劑的選擇對(duì)于從組織切片中解析出藥物分子，并實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的離子化效果很關(guān)鍵。一般，非極性溶劑不利于被測物的解析或離子化，而極性溶劑還需要有一定的揮發(fā)性和對(duì)組織樣品的萃取能力，因此，以組織勻漿切片為檢測對(duì)象，以AFAI-MSI分析中對(duì)NHBA檢測具有較高離子化效率的溶劑(甲醇、乙腈和水)，通過不同配比獲得的混合溶劑作為噴霧溶劑，考察了6種條件下的離子化效果。結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)在C溶劑體系：CH3OH∶H2O(80∶20)+0.1%FA下，可獲得最佳的離子化效果。每個(gè)溶劑條件下進(jìn)行3次平行測試，檢測組織切片的不同部分，結(jié)果顯示，NHBA的離子化效率相近，這在一定程度上也表明組織勻漿切片中NHBA濃度的均一性和AFAI-MSI成像系統(tǒng)的穩(wěn)定。

圖2 不同溶劑系統(tǒng)條件下采用MRM掃描模式獲得的NHBA(m/z 374.2→242.0)XIC峰面積比較Fig.2 Comparisons of the XIC peak area of NHBA detected in MRM mode(m/z 374.2→242.0)，among different spray solvent optimizing conditions three parallel experiments were done under each condition and the averaged value was used for comparison

圖3 不同溶劑流速與不同噴霧氣壓條件下，采用MRM掃描模式獲得的NHBA(m/z 374.2→242.0)XIC峰面積比較Fig.3 Comparisons of the XIC peak area of NHBA detected in MRM mode(m/z 374.2→242.0)，under different spray solvent rate and different spray solvent pressure three parallel experiments were done under each condition and the averaged value was used for comparison

圖4 電噴霧針與樣品不同表面距離，以及與不同離子傳輸管口距離條件下，采用MRM掃描模式獲得的NHBA(m/z 374.2→242.0)XIC峰面積比較Fig.4 Comparisons of the XIC peak areas of NHBA detected in MRM mode(m/z 374.2→242.0) at different distances between sprayer tip and sample surface and between sprayer tip and inlet of transport tube three parallel experiments were done under each condition and the averaged value was used for comparison

圖5 全掃描模式下連續(xù)兩次整體大鼠組織切片AFAI-MSI平行實(shí)驗(yàn)的光學(xué)像圖(A)與光學(xué)像圖對(duì)應(yīng)的可視化PCA得分圖,真空脫水后立即進(jìn)行AFAI-MSI實(shí)驗(yàn)的可視化PCA得分圖(B),在AFAI-MSI實(shí)驗(yàn)條件下暴露7小時(shí)后連續(xù)進(jìn)行AFAI-MSI實(shí)驗(yàn)的可視化PCA得分圖(C)Fig.5 Optical images and visualized PCA results of MSI data acquired by AFAI-MSI method in full-scan mode comparing twice parallel MSI experiments throughout one tissue section of rat (A) ,visualized PCA result of MSI data immediately obtained after dehydration(B),visualized PCA result of MSI data obtained after 7 h exposure under MSI experimental conditions for the visualized PCA result(C)the PCA score value for each pixel on each of first three components determines the intensity for red，green and blue(RGB)，respectively(對(duì)于可視化PCA得分圖，每個(gè)像素點(diǎn)都由紅、綠、藍(lán)三色的強(qiáng)度代表PC1、PC2、PC3的得分)

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較了不同噴霧氣壓力條件下，噴霧溶劑流速對(duì)獲得NHBA離子信號(hào)強(qiáng)度的影響(見圖3)。結(jié)果表明,在噴霧溶劑流速為10 μL·min-1，噴霧氣壓力為0.6 MPa時(shí)，NHBA的離子化效果最佳。

2.3 電噴霧針與樣品表面和離子傳輸管管口的最佳距離

AFAI-MSI成像系統(tǒng)的電噴霧針與組織樣品及離子傳輸管的空間距離是影響被測物解析及其離子信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)鍵參數(shù)。針對(duì)二者不同距離條件下，考察了藥物NHBA分子離子強(qiáng)度，獲得的結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，電噴霧針與樣品表面距離為0.7 mm，以及電噴霧針與離子傳輸管管口距離為3 mm時(shí)，獲得NHBA的離子化效果最佳。

2.4 組織切片樣品中內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性考察

在質(zhì)譜成像過程中，需要關(guān)注生物組織中內(nèi)源性物質(zhì)的種類和含量在數(shù)據(jù)采集過程中是否發(fā)生變化，以確保獲得的內(nèi)源性代謝物變化與樣品本身或成像過程無關(guān)。本研究以組織切片樣品中內(nèi)源性代謝物的分子輪廓為考察對(duì)象，通過比較連續(xù)兩次質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)的可視化統(tǒng)計(jì)結(jié)果，考察了組織切片樣品的穩(wěn)定性。

根據(jù)被測物的性質(zhì)，選用正離子檢測的全掃描數(shù)據(jù)采集方式，以保障考察的藥物及相關(guān)內(nèi)源性物質(zhì)能夠被檢測到，同時(shí)又能保證相對(duì)于負(fù)離子模式，能有更多種類和數(shù)量的內(nèi)源性物質(zhì)被檢出。然而在獲得大量離子峰的同時(shí)，也采集了很多與內(nèi)源性物質(zhì)無關(guān)的離子峰數(shù)據(jù)，因此需對(duì)觀察到的離子峰進(jìn)行篩選。本研究建立了可以保留完整分子輪廓及空間分布信息的數(shù)據(jù)降維方法，通過篩選主要內(nèi)源性代謝物的質(zhì)譜峰作為研究對(duì)象，排除無關(guān)離子峰的干擾，同時(shí)挖掘離子強(qiáng)度低的內(nèi)源性代謝物信息，提高了各像素點(diǎn)下分子輪廓信息的可比性。

采用主成分分析(PCA)方法對(duì)來自于整體大鼠切片每個(gè)像素點(diǎn)的分子輪廓(降維處理后的數(shù)據(jù)陣)進(jìn)行聚類運(yùn)算。經(jīng)計(jì)算獲得每個(gè)像素點(diǎn)的PCA得分反映了該像素點(diǎn)的分子輪廓信息，分別用不同強(qiáng)度的紅色、綠色及藍(lán)色表示每個(gè)像素點(diǎn)的前3個(gè)主成分得分值(PC1，PC2，PC3)。由于具有相似分子輪廓信息的像素點(diǎn)應(yīng)顯示相似的顏色，則發(fā)生明顯變化的內(nèi)源性代謝物的分子輪廓會(huì)展現(xiàn)出顯著的顏色差別[16]。

內(nèi)源性代謝物在適宜的生化反應(yīng)條件下會(huì)迅速發(fā)生變化，因此質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)之前的脫水處理非常必要[17]。一張整體大鼠切片的質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)需耗時(shí)7～8 h，需考察在此過程中噴霧溶劑、光照等實(shí)驗(yàn)條件是否會(huì)引起內(nèi)源性代謝物分子輪廓的變化。由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的AFAI-MSI成像的空間分辨率為200～300 μm，而成像實(shí)驗(yàn)的行間距離設(shè)定為500 μm，則在同一切片上每兩個(gè)掃描行之間仍存留200～300 μm的未被剝蝕和掃描的完整組織[18]，而這些組織恰好是在相同條件下被放置了相同時(shí)間，因此，選擇這部分組織，對(duì)其在相同條件下再進(jìn)行一次AFAI-MSI掃描實(shí)驗(yàn)，通過比較兩次成像結(jié)果中分子輪廓的可視化PCA得分圖，來判斷大鼠組織切片中內(nèi)源性代謝物在成像實(shí)驗(yàn)條件及掃描全程中是否穩(wěn)定。結(jié)果如圖5所示，圖5A是組織切片的光學(xué)掃描圖片，圖5B和5C分別是對(duì)第一次和第二次質(zhì)譜成像掃描獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析獲得的可視化得分圖，從圖中可見兩次掃描結(jié)果的可視化PCA得分圖顏色基本一致，提示兩次掃描獲得像圖上對(duì)應(yīng)像素點(diǎn)的分子輪廓基本一致。該結(jié)果表明在成像掃描過程中，大鼠切片的分子輪廓未發(fā)生變化，則所關(guān)注的內(nèi)源性代謝物穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本研究在對(duì)生物組織基質(zhì)影響NHBA離子化效率考察的基礎(chǔ)上，為了使AFAI-MSI成像系統(tǒng)能夠獲得更穩(wěn)定、準(zhǔn)確的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)，以組織勻漿添加藥物制得的切片為對(duì)象，考察了影響NHBA解析及離子化的關(guān)鍵參數(shù)。進(jìn)一步采用AFAI-MSI成像系統(tǒng)，并結(jié)合可視化的主成分分析(PCA)方法，進(jìn)行了大鼠組織切片中內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)定性考察。研究結(jié)果表明，采用該樣品前處理和質(zhì)譜成像方法，能夠保證組織切片樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的穩(wěn)定性，從而為敞開式質(zhì)譜成像技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

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Investigation on Tissue Sample Stability by Ambient Mass Spectrometry Imaging Method

LUO Zhi-gang1,HE Jing-jing1,3,HE Jiu-ming1,ABLIZ Zeper1,2*

(1.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines,Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China;2.Centre for Bioimaging & Systems Biology，Minzu University of China,Beijing 100081,China;3.Higher Education Evaluation Center，Ministry of Education，Beijing 100081，China)

Key parameters of air flow assisted ionization mass spectrometry imaging(AFAI-MSI) system were investigated and optimized by using tissue sections adding homogeneous NHBA as the target samples.The parameters，including those related with spray solvent，spray gas，as well as geometric setting of AFAI system were optimized.Based on the optimization，stability of endogenous metabolites from the tissue section was also taken into consideration during the AFAI-MSI experiment.It usually takes 7-8 h for a complete MSI experiment for a whole-body tissue section，and the stability of endogenous metabolites needs to be investigated during such a long process.Therefore，a whole-body tissue section was imaged twice consecutively，and then the data of resulted images were compared using visualized component principle analysis(PCA) after selecting main mass spectra peaks.By visualized comparing of the result，the similarity of the visualized PCA score plot demonstrated the endogenous metabolites were stable during MSI experiment.In conclusion，the optimized parameters guaranteed the stability and sensitivity of AFAI-MSI experiment.Additionally，after proper sample pretreatment，the endogenous metabolites in tissue sections were able to remain stable during the AFAI-MSI experiment，which ensured the reliability for research of the variability of endogenous metabolites.Thus the AFAI-MSI method is promising to be applied in the study of drug development.

airflow assisted ionization(AFAI)；ambient mass spectrometry imaging(AMSI)；sample stability；medicines；endogenous metabolites

2016-10-06；

2016-11-16

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)資助(2011YQ170067)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.004

O657.63；Q493.2

A

1004-4957(2017)02-0178-06

*通訊作者：再帕爾·阿不力孜，博士，研究員，研究方向：質(zhì)譜新技術(shù)及其新應(yīng)用途徑新方法的開發(fā)研究，Tel：010-63165218，E-mail：zeper@imm.ac.cn