侯靜菲 楊延蓮 王 琛

(國(guó)家納米科學(xué)中心，中國(guó)科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院納米標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，北京100190)

納米材料－蛋白質(zhì)界面相互作用的分子機(jī)制

侯靜菲 楊延蓮*王 琛*

(國(guó)家納米科學(xué)中心，中國(guó)科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院納米標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院納米科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，北京100190)

納米材料由于其優(yōu)異的性能在化工、電子、機(jī)械、環(huán)境、能源、航天等各個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，并且在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。納米材料－蛋白質(zhì)界面相互作用是納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的科學(xué)問題，對(duì)于納米材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及生物安全性評(píng)價(jià)至關(guān)重要。蛋白質(zhì)分子與納米材料在界面的相互作用，一方面可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象、組裝結(jié)構(gòu)甚至功能的改變，另一方面可以引起納米材料的表面親疏水性、電荷性質(zhì)等表面物理化學(xué)性質(zhì)的改變?；诘鞍踪|(zhì)與納米材料相互作用檢測(cè)技術(shù)及結(jié)果，本文從分子水平闡述了納米材料與蛋白質(zhì)分子在界面之間的相互作用機(jī)理及相應(yīng)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的變化，從而可以深化對(duì)兩者之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制的理解，對(duì)于推進(jìn)納米材料在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用及健康、安全、持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

納米材料；蛋白質(zhì)；界面；相互作用；生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用；分子機(jī)制

1 引言

納米材料獨(dú)特的電學(xué)、光學(xué)、力學(xué)、磁學(xué)、化學(xué)等特性在化工、電子、機(jī)械、環(huán)境、能源、航天等各個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用1,2。近年來(lái)，納米材料在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，如生物芯片、生物探針、核磁共振成像技術(shù)、納米體外診斷技術(shù)及納米藥物載體等3－6。納米材料由于量子限域效應(yīng)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，可以用于分子影像探針、體外診斷檢測(cè)探針等。例如，半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有高的熒光量子產(chǎn)率，并且抗光漂白，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記從而可以實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)胞水平的生物學(xué)過(guò)程，在細(xì)胞成像、腫瘤造影、組織染色和藥物運(yùn)輸?shù)确矫嬉呀?jīng)有重要應(yīng)用7；而貴金屬納米顆粒的表面等離激元特性也為納米材料帶來(lái)了特殊的消光特性，在免疫檢測(cè)等的診斷試劑、膠體金試紙條等方面已經(jīng)有廣泛應(yīng)用5,6；另外，其等離激元吸收引起的溫度升高也在腫瘤的光熱治療中表現(xiàn)了潛在的應(yīng)用前景。納米材料具有高的比表面積，納米顆粒、納米管及納米片等納米材料，如聚合物納米粒、碳納米管(CNTs)、氧化石墨烯(GO)、金納米顆粒、多孔納米二氧化硅等可以作為藥物載體8,9，提高藥物的局部濃度。腫瘤組織對(duì)納米材料的增強(qiáng)通透性和滯留(EPR)效應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)藥物的被動(dòng)靶向，通過(guò)在納米材料上修飾抗體、多肽及靶向小分子還可以實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放、腫瘤的靶向治療等10。很多納米材料(如碳材料納米顆粒、金屬及金屬氧化物納米顆粒、半導(dǎo)體納米材料等)還能夠引起包含DNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物分子的構(gòu)象變化及細(xì)胞膜和骨架的改變，介導(dǎo)細(xì)胞的彈性、形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、粘附及入侵等方面性能發(fā)生改變4，從而對(duì)細(xì)胞通訊、遷移、粘附、神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、干細(xì)胞的分化和增殖等產(chǎn)生影響。另外，納米材料與蛋白質(zhì)、多肽等形成的復(fù)合材料(如生物礦化材料、有機(jī)無(wú)機(jī)雜化材料等)在組織工程學(xué)領(lǐng)域(如人工骨、人工支架等方面)的應(yīng)用可以提高生物穩(wěn)定性和組織相容性，同時(shí)降低生物毒性和免疫原性11－14。納米材料與蛋白質(zhì)的相互作用在醫(yī)學(xué)診斷及治療方面引起了越來(lái)越高的重視，為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。兩者界面之間相互作用的研究可以從分子水平揭示其作用機(jī)理，既是物理化學(xué)學(xué)科的重要科學(xué)問題，也是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的核心問題。

侯靜菲，1988年生。2011年畢業(yè)于北京科技大學(xué)，2011年至今就讀于中國(guó)科學(xué)院國(guó)家納米科學(xué)中心物理化學(xué)專業(yè)。主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)/多肽分子相互作用、組裝規(guī)律及結(jié)構(gòu)調(diào)控。

楊延蓮，國(guó)家納米科學(xué)中心研究員、博士生導(dǎo)師。分別于1996年和1999年獲得山東大學(xué)學(xué)士和碩士學(xué)位，2002年獲得北京大學(xué)博士學(xué)位。研究領(lǐng)域：疾病相關(guān)的多肽組裝結(jié)構(gòu)及其調(diào)控的分子機(jī)制；基于掃描探針顯微技術(shù)的納米表征方法。

王琛，國(guó)家納米科學(xué)中心研究員、博士生導(dǎo)師、杰青、中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)常務(wù)理事、中國(guó)真空學(xué)會(huì)理事等，1992年獲得美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)博士學(xué)位。研究領(lǐng)域：掃描探針顯微技術(shù)及應(yīng)用；單分子化學(xué)和物理性質(zhì)；分子納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、構(gòu)筑和表征等。

蛋白質(zhì)主要是由20種天然氨基酸構(gòu)成的生物大分子。氨基酸的排布方式、肽鏈的折疊方式使其形成具有空間構(gòu)象和復(fù)雜功能的蛋白質(zhì)分子，作為一級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過(guò)氫鍵、疏水作用等形成蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等，進(jìn)而通過(guò)氨基酸側(cè)鏈之間的疏水相互作用、鹽橋、氫鍵、范德華力和靜電力等卷曲折疊形成的球狀分子空間構(gòu)象，這是蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，有些蛋白質(zhì)還會(huì)通過(guò)多條肽鏈聚合形成更為復(fù)雜的空間三維結(jié)構(gòu)，這是蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)側(cè)基的性質(zhì)，氨基酸分為疏水、帶電荷、含芳香族側(cè)鏈、含硫及極性側(cè)鏈五類，不同性質(zhì)的氨基酸之間的作用力大不相同。而納米材料的性質(zhì)及功能也會(huì)隨著其尺寸、形態(tài)、晶體結(jié)構(gòu)及表面化學(xué)性質(zhì)的不同表現(xiàn)出很大的差異性。由于相互作用的本質(zhì)對(duì)于不同的材料是具有共性的，因此納米材料與蛋白質(zhì)的界面相互作用會(huì)受到二者表面物理化學(xué)性質(zhì)的影響，而且會(huì)不可避免的通過(guò)界面相互作用改變納米材料以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。蛋白質(zhì)在納米材料界面的識(shí)別、結(jié)合及自組裝是熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)的過(guò)程，大多數(shù)條件下是吸熱的過(guò)程，受外界溫度、pH值等因素影響，其達(dá)到平衡態(tài)可以短至幾秒，長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)。蛋白質(zhì)在納米材料表面的結(jié)合分為特異性結(jié)合及非特異性結(jié)合12，與蛋白質(zhì)序列相關(guān)15。其次，界面的吸附和組裝受蛋白質(zhì)物理結(jié)構(gòu)16和化學(xué)基團(tuán)17的共同影響。蛋白質(zhì)的尺寸影響其在界面的分布速率，其空間構(gòu)象還決定著與界面接觸位點(diǎn)的數(shù)量。蛋白質(zhì)形成氫鍵的能力及其氨基酸帶電性、親疏水性等因素共同決定著蛋白質(zhì)在納米材料表面的結(jié)合方式、速率及反應(yīng)程度。另外，多肽或蛋白質(zhì)在表面的吸附組裝還與納米材料表面的性質(zhì)(尺寸、形狀、化學(xué)修飾等)和溶液條件等因素有關(guān)18－21。

蛋白質(zhì)與納米材料的相互作用22,23一方面會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而介導(dǎo)其生物效應(yīng)發(fā)生改變。另一方面其還會(huì)對(duì)納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響，實(shí)現(xiàn)其功能化修飾。本文將主要從分子水平揭示蛋白質(zhì)與納米材料的相互作用機(jī)理，并介紹納米材料與蛋白質(zhì)相互作用對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能及納米材料物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生的影響，以及納米材料潛在的安全性及其帶來(lái)的挑戰(zhàn)。

2 蛋白質(zhì)分子與納米材料的相互作用力

納米材料與蛋白質(zhì)界面之間的相互作用及結(jié)合常數(shù)可以通過(guò)多種表征技術(shù)進(jìn)行研究，如表面等離激元共振技術(shù)(SPR)24可以定量分析蛋白質(zhì)與納米顆粒結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和熱力學(xué)平衡常數(shù)；石英晶體微天平(QCM)25可以定量測(cè)量納米材料與所吸附的蛋白質(zhì)之間的作用力大小，并精確到納克級(jí)，也可以同時(shí)獲得動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)；等溫滴定量熱法(ITC)26可以測(cè)得蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合常數(shù)及其他熱力學(xué)參數(shù)，可以獲取納米材料與蛋白質(zhì)分子之間的結(jié)合方式。利用掃描探針顯微鏡可以探測(cè)到蛋白質(zhì)分子在納米材料表面的吸附及組裝結(jié)構(gòu)，如利用掃描隧道顯微技術(shù)(STM)通過(guò)探針表面原子與樣品之間的隧道電流探測(cè)樣品在界面的吸附及組裝結(jié)構(gòu)，達(dá)到原子級(jí)的超高分辨率27,28；利用原子力顯微技術(shù)(AFM)14可以探測(cè)到納米材料表面特征及蛋白質(zhì)在界面的吸附組裝形貌。通過(guò)光譜技術(shù)還可以探測(cè)到蛋白質(zhì)分子與納米材料相互作用過(guò)程中結(jié)構(gòu)的變化，如圓二色光譜(CD)29在遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)的信號(hào)主要由肽鍵的電子躍遷引起，通過(guò)譜帶位置及強(qiáng)度的分析，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)吸附蛋白質(zhì)的主鏈構(gòu)象，包含α-螺旋、β-折疊、β轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；傅里葉紅外光譜(FTIR)30可以通過(guò)蛋白質(zhì)分子酰胺I帶及酰胺II帶的吸收變化來(lái)分析蛋白質(zhì)在納米材料表面的吸附類型及結(jié)構(gòu)變化；三維熒光光譜(3DEEMFS)31通過(guò)與主成分分析結(jié)合可以獲得納米材料與蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程中吸附蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的信息。另外，動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)32還可以表征蛋白質(zhì)分子與納米材料結(jié)合的粒徑分布及zeta電位的變化，得到更多兩者相互作用的有效信息。

通常，蛋白質(zhì)分子在納米材料表面的組裝過(guò)程是由兩者之間各種因素所共同決定的，由分子與分子之間多種相互作用力所共同驅(qū)動(dòng)的。蛋白質(zhì)與納米材料之間相互作用23的非共價(jià)驅(qū)動(dòng)力主要有分子間疏水相互作用、靜電力相互作用、π－π相互作用、氫鍵相互作用、范德華及鹽橋相互作用等，不同作用力之間的比較見表1。

范德華力是蛋白質(zhì)分子與納米材料界面相互作用最常見的短程弱相互作用力，兩者之間的距離越小，吸引力越大，并且每個(gè)原子都對(duì)相互作用有貢獻(xiàn)。通常在范德華力的驅(qū)使下，蛋白質(zhì)分子與納米材料界面達(dá)到最大的接觸面積。因此，較大的納米顆粒與構(gòu)象比較靈活的蛋白質(zhì)之間會(huì)有比較強(qiáng)的范德華作用力23。由于大部分納米材料與蛋白質(zhì)之間都存在范德華作用力，以下主要從疏水相互作用、靜電相互作用、π－π相互作用、氫鍵相互作用等方面介紹蛋白質(zhì)分子與納米材料界面相互作用的分子機(jī)制以及納米材料物化性質(zhì)對(duì)兩者界面相互作用的影響。

2.1 疏水相互作用

蛋白質(zhì)由疏水氨基酸和親水氨基酸構(gòu)成，通常蛋白質(zhì)的折疊由疏水相互作用所驅(qū)動(dòng)，疏水的側(cè)鏈包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，形成疏水核心，而親水氨基酸則暴露于表面。蛋白質(zhì)在疏水的納米材料界面，可能會(huì)暴露出疏水殘基，與材料界面發(fā)生疏水相互作用。而納米材料表面的親疏水性也會(huì)通過(guò)影響蛋白質(zhì)接觸角而決定二者在界面的相互作用。研究證實(shí)疏水相互作用在核殼結(jié)構(gòu)的材料組裝及淀粉樣纖維的形成中發(fā)揮著重要作用33。蛋白質(zhì)比較容易吸附在疏水性表面，而且疏水性越強(qiáng)，蛋白質(zhì)的吸附就越強(qiáng)34。

表1 蛋白質(zhì)分子與納米材料之間相互作用力比較23Table 1 Comparison of different interactions between proteins and nanomaterials23

石墨烯由于在結(jié)構(gòu)、機(jī)械、光、熱、電性能方面的優(yōu)點(diǎn)在很多領(lǐng)域得到了應(yīng)用35,36。石墨烯、石墨炔、碳納米管等碳納米結(jié)構(gòu)的疏水界面、可功能化的性質(zhì)也使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用嶄露頭角。HIV-1碳端的DNA結(jié)合域整合酶蛋白在溶液中形成二聚體，并且有一個(gè)比較明顯的疏水界面。Luan等37通過(guò)分子模擬(MD)分別研究了石墨炔與HIV-1整合酶蛋白四種變體(Sim-1、Sim-2、Sim-3和Sim-4)二聚體的動(dòng)力學(xué)結(jié)合過(guò)程(圖1)。初始狀態(tài)下，石墨炔平面平行于蛋白質(zhì)二聚體的疏水界面，經(jīng)過(guò)幾十納秒之后，其穿過(guò)Sim-1和Sim-4的界面，使得蛋白質(zhì)變?yōu)閱误w狀態(tài)，蛋白質(zhì)單體與單體之間的接觸面積變?yōu)?。研究證實(shí)石墨炔與蛋白質(zhì)二聚體界面疏水氨基酸(LEU242、TRP243、ALA248、VAL250、ILE257及VAL259)之間的疏水作用力要強(qiáng)于蛋白質(zhì)單體與單體之間的作用力，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)二聚體被石墨炔片層分隔開。另外，蛋白質(zhì)的疏水核心很容易暴露于納米材料的疏水表面，引起蛋白質(zhì)變性等38,39。

2.2 靜電相互作用

兩個(gè)物體在接觸并吸附的過(guò)程中，界面上由基團(tuán)解離的相反電荷相互吸引，形成雙電層。DLVO理論認(rèn)為溶膠的穩(wěn)定性取決于膠粒之間相互作用的位能，包括范德華吸引位能及雙電層引起的靜電排斥位能。而蛋白質(zhì)是一種生物大分子，具有膠體的性質(zhì)。其表面的親水基團(tuán)能吸引水分子，形成水化膜，與膠粒表面所帶的電荷一起維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。蛋白質(zhì)除了兩側(cè)的氨基和羧基可以解離外，氨基酸側(cè)基中的基團(tuán)在一定的pH條件下也可以解離成帶正電或帶負(fù)電的基團(tuán)，如組氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。它們通常有比較強(qiáng)的親水性而位于蛋白質(zhì)的表面，從而通過(guò)電荷的分布與納米材料荷電表面產(chǎn)生靜電力相互作用。靜電力是一種常見的作用力，它也決定著蛋白質(zhì)與納米材料的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)這些氨基酸位于蛋白質(zhì)內(nèi)部時(shí)，還可能通過(guò)去折疊暴露出相關(guān)氨基酸，通過(guò)側(cè)基與納米材料之間的靜電力發(fā)生相互作用。溶液pH會(huì)通過(guò)影響納米材料及蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài)，從而影響二者之間的靜電力相互作用。研究證實(shí)，蛋白質(zhì)在帶電荷的納米材料表面比較容易吸附，其吸附程度略弱于疏水材料表面40。另外，蛋白質(zhì)中一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基相互靠近時(shí)，通過(guò)靜電力吸引還會(huì)形成鹽橋。雖然鹽橋的數(shù)量較少，但它們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定十分重要，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部、蛋白質(zhì)與納米材料之間鹽橋的產(chǎn)生和破壞對(duì)于二者的相互作用也至關(guān)重要。

通過(guò)調(diào)控納米材料的界面電荷可以調(diào)控蛋白質(zhì)在表面的吸附量和吸附構(gòu)象。轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白Cry1Ab單體在SiO2等帶負(fù)電的基底表面的吸附，在靜電力的調(diào)控下吸附是可逆的，因此確保了蛋白Cry1Ab在基底表面比較高的構(gòu)象穩(wěn)定性，保證了其在土壤中生物活性不受損失41。另外，研究還發(fā)現(xiàn)并不是所有的氨基酸都參與組裝，Cry1Ab蛋白在SiO2表面的靜電力吸附并不能靠其凈電荷來(lái)解釋，而是受帶電氨基酸與界面之間的靜電力吸引所致42。

因?yàn)椴煌陌被嵝蛄袝?huì)造成蛋白質(zhì)的電荷分布、疏水界面、氫鍵形成能力等的差異，所以不同材料表面對(duì)于蛋白質(zhì)或者多肽的結(jié)合可能具有序列特異性。研究者們通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出與五種單晶半導(dǎo)體材料GaAs(100)、GaAs(111)A、GaAs(111)B、InP(100)及Si(100)有特異性結(jié)合的多肽序列43，通過(guò)重復(fù)洗脫來(lái)提高結(jié)合的特異性。研究發(fā)現(xiàn)與GaAs(100)基底表面結(jié)合的多肽表現(xiàn)出了氨基酸序列的相似性，他們包含一些能夠給電子的官能團(tuán)，例如絲氨酸和蘇氨酸的側(cè)鏈都包含羥基，天冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈都包含胺，只是分子組成上相差一個(gè)亞甲基，他們通過(guò)界面電荷之間相互作用在材料表面吸附和組裝。這種不同表面的多肽吸附的選擇性為工程化修飾納米材料表面提供了依據(jù)。GBP1是第一批基因工程篩選得到的可結(jié)合金表面的多肽，其序列為MHGKTQATSGTIQS44。一般基因工程通過(guò)多肽的重復(fù)序列來(lái)提高其結(jié)合活性，研究發(fā)現(xiàn)GBP1序列需要至少重復(fù)三次(3rGBP1)才能實(shí)現(xiàn)其與金表面的高親和性45,46。多肽3rGBP1溶液是無(wú)序結(jié)構(gòu)，包含了重復(fù)的MHGKTQA無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)及TSGTIQS延展結(jié)構(gòu)47。研究證明，多肽分子帶電氨基酸(賴氨酸或組氨酸)的側(cè)鏈與金表面的靜電相互作用為多肽在晶面的組裝提供驅(qū)動(dòng)力。另外，多肽分子間的相互作用也為維持其構(gòu)象穩(wěn)定做出一定的貢獻(xiàn)，在組裝的過(guò)程中使得多肽的構(gòu)象重新調(diào)整，形成反平行的β片層結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到分子內(nèi)部的穩(wěn)定14,44。

圖1 石墨炔片層與蛋白質(zhì)二聚體相互作用的動(dòng)力學(xué)模擬Fig.1 Dynamics simulation of the interaction of the graphyne sheet with the protein dimer

2.3 π－π相互作用

蛋白質(zhì)在納米材料表面的吸附強(qiáng)度不同，因序列和氨基酸的不同而異。某些芳香族分子(例如色氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等)之間存在π－π堆疊相互作用，這種弱相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的組裝、結(jié)構(gòu)及材料的調(diào)控起著重要的作用。兩種芳香環(huán)分子π－π相互作用的最常見構(gòu)象是平行及T型。π－π堆疊的平均距離比范德華作用距離稍大，并且對(duì)sp2雜化碳納米材料與蛋白質(zhì)之間的相互作用影響較大23。由于極少數(shù)的氨基酸含有芳香環(huán)，并且這些氨基酸通常會(huì)包覆于蛋白質(zhì)的疏水核心，蛋白質(zhì)與納米材料之間的π－π堆疊相互作用具有一定的特異性。

由于在電子及機(jī)械方面的優(yōu)良性能，碳納米管在分子電子學(xué)及超靈敏生物傳感器方面有很大的潛能48。利用噬菌體和細(xì)胞展示技術(shù)篩選得到的與碳納米管特異性結(jié)合的多肽在納米管的分散、操縱及發(fā)展基于碳納米管的傳感器方面打開了新的大門。研究發(fā)現(xiàn)這些多肽的序列兩端是對(duì)稱的親水序列，作為表面活性劑與溶劑相互作用，中間是與碳納米管作用的疏水氨基酸，但是這些非特異性的疏水序列并不能主導(dǎo)多肽與碳納米管的結(jié)合強(qiáng)度49。而通過(guò)對(duì)碳納米管結(jié)合肽的肽鏈構(gòu)象統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)的計(jì)算，單個(gè)氨基酸出現(xiàn)頻率的分析，以及多肽序列的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)富含芳香環(huán)的色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸等氨基酸與納米材料之間的π－π堆疊相互作用力為其表面的吸附及結(jié)合發(fā)揮了重要作用50。其可以經(jīng)受200°C的高溫，維持納米管的穩(wěn)定性，對(duì)材料的發(fā)展及藥物的設(shè)計(jì)也十分重要。

富勒烯C60及其派生物可以通過(guò)與β-粉樣多肽(Aβ)的核心序列KLVFF的緊密結(jié)合來(lái)抑制其聚集51。包含KLVFFAE序列的Aβ多肽分別與C60、C60團(tuán)簇(3C60)及C180共同作用，通過(guò)結(jié)構(gòu)模擬及能量計(jì)算，發(fā)現(xiàn)3C60和C180比C60更能降低Aβ多肽的β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而抑制其纖維化。通過(guò)AFM的表征還發(fā)現(xiàn)，富勒烯對(duì)Aβ纖維長(zhǎng)度及高度的抑制跟濃度成正比。這種抑制作用是由于C60空腔與苯丙氨酸芳香族側(cè)鏈之間發(fā)生了π－π堆疊相互作用，從而破壞了纖維的穩(wěn)定性52。研究還指出，多肽苯丙氨酸與富勒烯π－π堆疊相互作用的距離為0.45 nm(圖2)，C60與蛋白質(zhì)相互作用首先由形狀互補(bǔ)所驅(qū)動(dòng)，氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾到C60空腔。其次，芳香族及帶電氨基酸與C60之間的π－π堆疊為其結(jié)合提供驅(qū)動(dòng)力。另外，研究還發(fā)現(xiàn)C60與其抗體Ab形成的穩(wěn)定C60-Ab復(fù)合物也是由C60與色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸側(cè)鏈之間的π－π堆疊作用機(jī)制所主導(dǎo)的53。

圖2 富勒烯C60及其衍生物對(duì)Aβ多肽纖維化的抑制Fig.2 Inhibition of fullerene C60and its derivatives for theAβ peptide fibrosis

2.4 氫鍵相互作用

氫鍵是蛋白質(zhì)組裝及與材料結(jié)合的主導(dǎo)驅(qū)動(dòng)力，其形成是由于一個(gè)電負(fù)性較強(qiáng)的原子與氫原子鍵合后，又與另一個(gè)電負(fù)性較強(qiáng)的原子鍵合。氫鍵比范德華作用力強(qiáng)很多，但是納米材料與蛋白質(zhì)之間氫鍵相互作用的總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于范德華力作用。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)如α-螺旋、β-折疊和β轉(zhuǎn)角，就是靠氫鍵維持的。一些蛋白質(zhì)構(gòu)象病的致病機(jī)理是由于蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊形成纖維54,55，而纖維形成的主要驅(qū)動(dòng)力就是多肽分子間氫鍵。往往蛋白質(zhì)在與材料界面發(fā)生相互作用后，會(huì)發(fā)生包括二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，過(guò)程中伴隨著氫鍵的打開與生成。

通過(guò)功能化的納米材料吸附具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，可以提高蛋白質(zhì)的功能、穩(wěn)定性等。酶的固定對(duì)于其生物傳感器應(yīng)用、臨床檢驗(yàn)、污水處理等應(yīng)用至關(guān)重要，納米材料的高比表面積、可功能化特性為高效酶固定提供了可能。碳納米管是出色的蛋白質(zhì)固定支撐材料，并且有著較高的穩(wěn)定性，可以有效地解決這些問題。多層碳納米管(MWCNTs)通過(guò)表面氧化再選擇性地去除某些含氧官能團(tuán)(如羧酸、酚類、酐、內(nèi)酯和醌類)，可以有效地提高過(guò)氧物酶的固定效率、催化活性、熱穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性56。研究證明，過(guò)氧物酶通過(guò)氫鍵與MWCNT400表面修飾的羥基基團(tuán)相互作用形成MWCNT400-過(guò)氧物酶生物共軛體，從而提高了其熱穩(wěn)定性57。

GO基于其出色的電子、力學(xué)及熱力性質(zhì)，在高分子材料、能源材料、傳感器及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域很多方面有著良好的應(yīng)用，是近幾年來(lái)備受關(guān)注的二維材料58－60。其具有大量的疏水表面和共軛電子結(jié)構(gòu)，可以和蛋白質(zhì)的殘基通過(guò)靜電力、疏水相互作用及π－π堆積相互作用，并且不通過(guò)任何交聯(lián)劑就可以達(dá)到很高的負(fù)荷量。研究發(fā)現(xiàn)，GO可與與II型糖尿病相關(guān)多肽hIAPP結(jié)合61。分子動(dòng)力學(xué)模擬和圓二色光譜的結(jié)果顯示，GO可以誘導(dǎo)hIAPP的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低及無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量上升(圖3)。另外，GO還可以抑制hIAPP的聚集，降低對(duì)細(xì)胞NIT-1的毒性。這是由于GO的碳原子可以與hIAPP的芳香族氨基酸通過(guò)π－π堆疊相互作用，其羥基還可以與多肽的極性氨基酸結(jié)合形成氫鍵。兩者之間較強(qiáng)的相互作用抑制了多肽的自組裝。

2.5 納米材料物化性質(zhì)對(duì)界面相互作用的影響

生命體是一個(gè)龐大復(fù)雜的系統(tǒng)，其各個(gè)組織、器官及循環(huán)系統(tǒng)富含大量的生物分子，尤其是豐富的蛋白質(zhì)。當(dāng)納米材料進(jìn)入到生物體系時(shí)，其表面和蛋白質(zhì)分子及其他生物分子相互接觸，形成動(dòng)態(tài)的納米材料-蛋白質(zhì)冠62。隨著蛋白質(zhì)的吸附與解離，最終親和力高的蛋白質(zhì)在納米材料表面吸附及組裝，通過(guò)界面相互作用降低其表面能，從而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。同時(shí)，納米材料的組成及表面物理化學(xué)性質(zhì)會(huì)隨著時(shí)間發(fā)生變化，而這些變化反過(guò)來(lái)又會(huì)影響其在生物體內(nèi)的吸收、生物轉(zhuǎn)化及生物相容性等63,64。納米材料的尺寸形狀、形貌及化學(xué)性質(zhì)可以決定蛋白質(zhì)的空間排列，從而影響蛋白質(zhì)分子與納米材料之間的結(jié)合方式，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能及性質(zhì)。

2.5.1 尺寸對(duì)納米材料-蛋白質(zhì)相互作用的影響

納米材料在生物體內(nèi)被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞之后處于酸性的環(huán)境，經(jīng)過(guò)吸附、分布、代謝及排泄幾個(gè)過(guò)程，最后排出生物體。材料的生物降解速率及動(dòng)力學(xué)過(guò)程受納米材料的大小和組成影響。大尺寸納米顆粒(尺寸大于100 nm)由于實(shí)體瘤的EPR效應(yīng)在其血管的高度聚集可以實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的被動(dòng)靶向。另外，動(dòng)力學(xué)直徑小于5 nm的納米顆?？梢院芊奖愕乇簧矬w排泄，從而避免了其在組織器官不必要的集聚65。

納米材料的尺寸還會(huì)影響相關(guān)蛋白質(zhì)的聚集形式，例如GO對(duì)淀粉樣多肽Aβ(33－42)的聚集表現(xiàn)出尺寸效應(yīng)66。制備從50到478 nm一系列尺寸大小的GO與淀粉樣多肽Aβ(33－42)共孵育。研究發(fā)現(xiàn)，尺寸較小的GO實(shí)驗(yàn)組，多肽形成纖維，而隨著GO尺寸的增大，Aβ(33－42)的β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)含量逐漸減少，形成的淀粉樣纖維也越來(lái)越少，甚至消失形成薄膜。究其機(jī)理，可能是由于GO尺寸越小，其邊緣越多，能夠?yàn)榈矸蹣永w維的形成提供更多的臨界成核點(diǎn)。

圖3 氧化石墨烯(GO)與多肽hIAPP結(jié)合的效應(yīng)Fig.3 Effects of GO binding on peptide hIAPP

2.5.2 形狀對(duì)納米材料-蛋白質(zhì)相互作用的影響

納米材料的曲率半徑可以影響其與蛋白質(zhì)的結(jié)合。其曲率半徑越小，蛋白質(zhì)與納米顆粒之間的親和力就越低。這是由于曲率半徑降低，納米材料與蛋白質(zhì)的接觸面積減小，二者之間的相互作用力被削弱。而且，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用也為其在納米材料的吸附提供額外的驅(qū)動(dòng)力，降低曲率半徑，就會(huì)增大吸附蛋白的偏轉(zhuǎn)角，從而降低蛋白質(zhì)的吸附67。另外，納米材料的縱橫比還會(huì)影響其被細(xì)胞攝入的速率。例如由于尺寸的等效性，金納米微粒比金納米星更容易被細(xì)胞內(nèi)吞68，而桿狀的納米顆粒也更容易通過(guò)蛋白質(zhì)分子結(jié)合而被生物體內(nèi)吞。

2.5.3 表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)納米材料-蛋白質(zhì)相互作用的影響

納米材料界面的化學(xué)性質(zhì)在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞攝取及催化方面扮演著重要的角色。其成分、涂層、電荷、配體的位置及表面濕潤(rùn)度對(duì)蛋白質(zhì)的吸附、生物分子的結(jié)構(gòu)及功能有重要影響。具有電荷或者疏水表面的納米顆粒比親水表面更容易與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，而且顆粒的疏水性越強(qiáng)，越容易與血漿中蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)合，從而提高其分散性69。疏水相互作用還可以促進(jìn)顆粒的聚集，使之不會(huì)輕易被機(jī)體清除50。

通常，以診斷和治療為目的的納米材料為了到達(dá)細(xì)胞及疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，會(huì)在其表面修飾特定的生物分子(多肽、配體等)或化學(xué)官能團(tuán)。而通過(guò)改變這些修飾物的類型及密度還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)材料與靶點(diǎn)受體之間的相互作用強(qiáng)度的調(diào)控70。材料表面的電荷性會(huì)影響其在生物體內(nèi)的分布和代謝。例如，細(xì)胞的外表面是帶負(fù)電荷和親水的，提高材料表面正電荷的量可以促進(jìn)其與細(xì)胞的結(jié)合，從而更容易被細(xì)胞攝取而進(jìn)入細(xì)胞，在醫(yī)學(xué)上可以達(dá)到載藥的目的。研究證明，材料表面修飾聚乙烯亞胺(PEI)的效果要優(yōu)于聚乙二醇(PEG)71，且聚合物長(zhǎng)鏈的效果優(yōu)于短鏈。但隨著分子量增大，高密度的陽(yáng)離子會(huì)破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)胞毒性。最優(yōu)的分子量為10 kDa或者低于10 kDa72。另外，納米材料在特定的生物應(yīng)用方面要盡可能降低與蛋白質(zhì)的吸附，可以通過(guò)在材料表面修飾親水或中性聚合物，如PEG、多糖或者聚乙烯來(lái)實(shí)現(xiàn)73。

此外，研究發(fā)現(xiàn)ZnO和CuO納米顆粒在含有和不含胎牛血清(FBS)改良的eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液中都可以分散得很好74。證明納米顆粒可以在生物環(huán)境中與其他生物分子形成復(fù)合物，并且不依賴于血清蛋白。ZnO和CuO納米顆粒與培養(yǎng)基中各種成分表現(xiàn)出了不同的親和力(圖4)。例如，ZnO顆粒與Na的結(jié)合多于Ca，而CuO顆粒與Ca的結(jié)合要多于Na。這種選擇性的吸附與納米材料-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成相似，都是由于材料表面的化學(xué)性質(zhì)不同所導(dǎo)致的75。另外，DMEM培養(yǎng)基中含有和不含F(xiàn)BS，ZnO納米顆粒結(jié)合P和Cl量的多少完全相反。由此看出生物環(huán)境對(duì)納米材料的吸附特性也有一定的影響。通過(guò)DMEM培養(yǎng)基含有和不含F(xiàn)BS的X射線光電子能譜對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BS可以影響納米顆粒與離子的結(jié)合。而結(jié)合能峰位的偏移說(shuō)明FBS蛋白質(zhì)分子與納米顆粒結(jié)合形成蛋白冠。ZnO納米顆粒在去離子水中的zeta電位為負(fù)值，而在DMEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)變?yōu)檎怠＿@是由于納米顆粒結(jié)合了溶劑中的離子所致，與ZnO和CuO納米顆粒的選擇性吸附結(jié)果一致。

圖4ZnO及CuO納米顆粒在緩沖液中分散及選擇性吸附Fig.4 Disperse and selective binding of ZnO and CuO nanoparticles in the buffer

功能化修飾的GO由于具有超高比表面，在生物體系中可以用來(lái)運(yùn)輸小分子藥物及生物分子，例如DNA及小干擾RNA等。GO表面的化學(xué)修飾可以對(duì)其界面的生物學(xué)特性帶來(lái)改變，例如，PEG修飾的氧化石墨烯nGO-PEG對(duì)動(dòng)物沒有太大的毒性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)76，GO在血漿中能夠非特異性吸附大量的蛋白質(zhì)，而nGO-PEG不僅降低了對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合，還提高了對(duì)特定蛋白質(zhì)分子的選擇性結(jié)合(圖5)。六種已知的特異性蛋白質(zhì)中有四種蛋白質(zhì)是與免疫相關(guān)的因子，包含C3a/C3a(des-Arg)。而C3a/C3a(des-Arg)是由C3分裂產(chǎn)生的，在肥胖癥、糖尿病及心血管疾病等病人體內(nèi)含量較高，與肥胖癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。nGO-PEG與C3a/C3a(des-Arg)的特異性結(jié)合降低了血漿中C3a/C3a(des-Arg)的含量，對(duì)相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)具有重要意義。

3 納米材料對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生的影響

蛋白質(zhì)分子通過(guò)各種相互作用在納米材料界面吸附和解吸附，最終達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其原有的構(gòu)象可能會(huì)被破壞，產(chǎn)生新的構(gòu)象。其各種二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的比例77,78及高級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，并影響蛋白質(zhì)的聚集動(dòng)力學(xué)、酶的活性、與配體的結(jié)合等生物功能及活性。本文結(jié)合一系列結(jié)構(gòu)及其他表征技術(shù)從分子水平上揭示了蛋白質(zhì)分子與納米材料界面相互作用對(duì)蛋白質(zhì)分子組裝結(jié)構(gòu)、聚集形貌以及生物效應(yīng)帶來(lái)的影響。

3.1 蛋白質(zhì)聚集動(dòng)力學(xué)的變化

利用SPR及QCM對(duì)多肽3rGBP1與金表面較強(qiáng)的結(jié)合力79進(jìn)行表征，研究表明其結(jié)合能與自組裝單層膜SAM相當(dāng)，兩者在一個(gè)數(shù)量級(jí)。二者在水溶液里的結(jié)合速度很快(20 min內(nèi)可以達(dá)到90%的覆蓋率)80，且在很寬的pH范圍內(nèi)都保持構(gòu)象穩(wěn)定。高分辨AFM結(jié)果顯示多肽3rGBP1分子在金表面形成六次軸對(duì)稱的圖案，與金表面的晶格對(duì)稱性相一致11，且吸附滿足朗格繆爾吸附模型81。研究還發(fā)現(xiàn)多肽分子在金表面多肽在金(111)表面的吸附不僅依賴于濃度，而且還是時(shí)間依賴的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。3rGBP1分子在金表面隨著時(shí)間由最初的均勻分散單體，到樹枝狀納米結(jié)構(gòu)，最終形成均勻的單層膜，其主要經(jīng)歷兩個(gè)組裝動(dòng)力學(xué)階段15：第一階段，多肽在基底表面形成均勻的單體吸附，并且擴(kuò)散形成胞核，進(jìn)而移動(dòng)合并達(dá)到臨界的長(zhǎng)度(50－100 nm)，形成延伸的網(wǎng)狀團(tuán)簇。第二階段，網(wǎng)狀團(tuán)簇緩慢成熟，并且俘獲剛剛吸附的單體，逐漸占據(jù)表面的空隙。之后，網(wǎng)狀團(tuán)簇逐漸合并，金表面的覆蓋率逐漸增大。并且第二階段的生長(zhǎng)速度低于第一階段，主導(dǎo)著多肽薄膜的形成過(guò)程。

圖5GO表面的PEG修飾的表征及對(duì)GO結(jié)合血漿蛋白的影響Fig.5 Characterization of the PEGylation on GO surface,and the effects on GO binding serum proteins

多肽GrBP5是篩選出來(lái)的與石墨表面有較強(qiáng)結(jié)合力的多肽14，通過(guò)AFM觀測(cè)其在HOPG表面的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)多肽形成高度為1.4 nm，長(zhǎng)度為幾個(gè)微米的統(tǒng)一有序自組裝單分子薄膜，其生長(zhǎng)方向沿著石墨的晶向，并且形成比較緊湊的折疊結(jié)構(gòu)14。當(dāng)多肽與HOPG(highly oriented pyrolytic graphite)共孵育10 min時(shí)，形成離散的多肽簇。共孵育60 min時(shí)，多肽在形成非晶相(AP)和有序相(OP)兩相。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到180 min時(shí)，多肽在完全形成有序相(OP)，其高度均為一個(gè)多納米。因此，多肽在HOPG表面的組裝可分為兩個(gè)階段：(1)多肽在石墨表面的聚集，包括與石墨表面的結(jié)合及形成團(tuán)簇；(2)多肽的密集化及有序組裝過(guò)程，伴隨著多肽的相轉(zhuǎn)變(圖6)。其分子機(jī)制如下GrBP5羧基端芳香結(jié)構(gòu)域III包含兩個(gè)酪氨酸14，其芳香環(huán)能夠通過(guò)π－π堆疊50,51與石墨基底產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用。芳香結(jié)構(gòu)域III是多肽GrBP5與石墨表面結(jié)合的最初錨定點(diǎn)，是多肽初步聚集階段團(tuán)簇形成的重要條件。研究證實(shí)氨基端疏水域I與中部親水域II形成的兩親片段與HOPG相互作用，再加上多肽分子之間相互作用，為多肽大范圍的有序組裝提供驅(qū)動(dòng)力，使之在HOPG表面更穩(wěn)定。

通過(guò)測(cè)量多肽3rGBP1與金表面的結(jié)合力及利用高分辨AFM對(duì)3rGBP1分子在金表面的組裝表征，從分子層面探究了3rGBP1在金表面的聚集動(dòng)力學(xué)。同樣，通過(guò)AFM對(duì)多肽GrBP5分子在石墨表面隨時(shí)間的組裝結(jié)構(gòu)表征，從分子水平揭示了GrBP5分子在石墨表面的組裝及聚集動(dòng)力學(xué)。

圖6 多肽GrBP5在HOPG表面的組裝過(guò)程Fig.6 Assembly process of peptide GrBP5 on HOPG surface

3.2 蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化

大多數(shù)與納米材料相互作用的吸附蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生構(gòu)象發(fā)生變化，其程度與納米材料的表面化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。帶電或者疏水的納米顆粒比中性電荷或者親水的納米材料更容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生較大的構(gòu)象變化。而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也對(duì)變化的程度有影響。例如，維持蛋白質(zhì)內(nèi)部穩(wěn)定的二硫鍵和鹽橋表現(xiàn)出了出色的抗變形恢復(fù)能力82。另外，蛋白質(zhì)是機(jī)體的物質(zhì)基礎(chǔ)，與生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起，其構(gòu)象對(duì)于調(diào)節(jié)某些生理功能至關(guān)重要83。納米材料對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的改變也會(huì)影響其生物活性及功能。因此，蛋白質(zhì)基于納米材料界面相互作用產(chǎn)生的構(gòu)象變化，對(duì)其相關(guān)的生理功能及疾病的調(diào)控也具有重要意義78,84。本課題組基于多肽在HOPG表面的組裝及構(gòu)象研究，取得了以下進(jìn)展。

多肽DELERRIRELEARIK在溶液其及晶體中有著穩(wěn)定的α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且已被CD光譜和X射線晶體衍射證實(shí)85?；诮缑骈g相互作用，本課題組成功地利用HOPG表面對(duì)多肽構(gòu)象進(jìn)行了調(diào)控86。利用STM對(duì)多肽在HOPG表面的組裝進(jìn)行表征，結(jié)果顯示多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，其條隴方向垂直于軸線。利用CD光譜技術(shù)檢測(cè)多肽溶液在加入石墨顆粒(模擬HOPG)前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在加入HOPG前，多肽有著穩(wěn)定的α-螺旋構(gòu)象。加入石墨顆粒后，溶液出現(xiàn)了β-折疊的典型峰位，證實(shí)多肽被誘導(dǎo)成了β-折疊結(jié)構(gòu)(圖7B)。取其離心母液進(jìn)行測(cè)量，β-折疊負(fù)峰依然存在。由此證實(shí)HOPG能夠誘導(dǎo)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生β-折疊的轉(zhuǎn)變，而且轉(zhuǎn)變之后的構(gòu)象十分穩(wěn)定。

人類免疫缺陷1型病毒HIV-1能夠侵染不分裂的細(xì)胞87,88，在相關(guān)疾病的演化中扮演著重要的角色。而病毒蛋白R(shí)(Vpr)89包含96個(gè)氨基酸，是HIV-1的附屬蛋白，是病毒前期感染的重要影響因素90－93。Vpr13－33的疏水殘基及其α-螺旋結(jié)構(gòu)是Vpr與細(xì)胞蛋白相互作用及調(diào)節(jié)相關(guān)生理功能的重要因素。本課題組基于GO與多肽之間的疏水相互作用83，實(shí)現(xiàn)了GO對(duì)Vpr13－33生理功能的調(diào)控。圓二色譜證實(shí)多肽Vpr13－33在溶液中主要形成α-螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入GO之后，被誘導(dǎo)β-折疊及β-轉(zhuǎn)角等(圖7E)。通過(guò)引入4′4-聯(lián)吡啶(4Bpy)，在HOPG表面觀測(cè)到Vpr13－33與4Bpy形成共組裝的β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)。AFM觀測(cè)結(jié)果顯示多肽只能形成細(xì)小的原纖維，而在GO的誘導(dǎo)下形成較長(zhǎng)的纖維，變得像富含β-折疊的淀粉樣多肽一樣易于聚集。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Vpr13－33對(duì)成纖維細(xì)胞瘤SH-SY5Y及T細(xì)胞均有毒性。而在一定范圍內(nèi)，加入GO之后，可以明顯降低由Vpr13－33誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其生理功能的調(diào)控。

圖7 納米材料誘導(dǎo)的多肽構(gòu)象的變化Fig.7 Conformation changes of peptides induced by nanomaterials

多肽在HOPG表面沉積并形成β-折疊結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，多肽亮度與序列特異性有關(guān)94。設(shè)計(jì)R4G4H8及F4G4H8兩條多肽，包含四種氨基酸(Arg、Gly、His和Phe)。苯丙氨酸Phe可以通過(guò)π－π堆疊95,96與HOPG相互作用，帶正電荷的精氨酸Arg可以通過(guò)胍基相互作用。通過(guò)比對(duì)兩條模型多肽在HOPG表面的組裝圖像發(fā)現(xiàn)，每條多肽由明暗不同的三段組成。以H8的襯度作為參比歸一化，得到亮度的排序?yàn)镻he>His>Arg>Gly。而通過(guò)分子模擬(MD)計(jì)算得到的氨基酸殘基與HOPG之間的作用能，遵循同樣的順序(圖8)。這項(xiàng)工作闡釋了殘基襯度與其電子能態(tài)之間的關(guān)系，對(duì)研究多肽相關(guān)的界面相互作用具有重要的意義。

淀粉樣多肽折疊位點(diǎn)的研究對(duì)其聚集動(dòng)力學(xué)及相關(guān)抑制劑的探尋具有重要意義。為了探究hIAPP的折疊結(jié)構(gòu)97，引入4Bpy分子，在HOPG表面探究hIAPP8－37與4Bpy分子的共組裝結(jié)構(gòu)。由于4Bpy分子能夠標(biāo)記和固定多肽分子的C端，測(cè)量長(zhǎng)度能夠得到hIAPP8－37分子C端的穩(wěn)定組裝長(zhǎng)度。為了得到hIAPP8－37的關(guān)鍵折疊位點(diǎn)，引入hIAPP37－8序列，其氨基酸序列與hIAPP8－37完全相同，N端和C端互為顛倒。通過(guò)兩端的長(zhǎng)度比對(duì)，得到其β折疊位點(diǎn)(圖9)，并且與固體核磁XRD和NMR得到的關(guān)鍵片段一致。其研究結(jié)果對(duì)于淀粉樣多肽的復(fù)雜折疊結(jié)構(gòu)及形態(tài)研究有很大的幫助。

本課題組通過(guò)STM對(duì)多肽DELERRIRELEARIK及Vpr13－33的高分辨掃描，獲得了其在HOPG表面的精細(xì)組裝結(jié)構(gòu)，并且根據(jù)CD對(duì)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的表征，從分子水平證實(shí)了多肽分子在納米材料表面組裝結(jié)構(gòu)的變化；結(jié)合STM對(duì)多肽R4G4H8及F4G4H8在HOPG表面的組裝結(jié)構(gòu)表征及分子模擬，本課題組從分子水平探究了多肽在HOPG組裝后，其襯度與氨基酸之間的關(guān)系；另外，本課題組通過(guò)利用STM對(duì)多肽hIAPP8－37正反序列組裝結(jié)構(gòu)的表征研究，還獲得了hIAPP8－37分子組裝的關(guān)鍵折疊位點(diǎn)。這些工作都從分子水平揭示了多肽分子在材料界面相互作用的結(jié)構(gòu)信息。

圖8 多肽在HOPG表面組裝的STM圖像及分子模擬結(jié)果Fig.8 STM images of peptides assemblies on HOPG surface and the molecular simulation results

4 蛋白質(zhì)對(duì)納米材料性能產(chǎn)生的影響

圖9 淀粉樣多肽hIAPP8－37關(guān)鍵折疊位點(diǎn)的STM研究Fig.9 STM study of the key folding sites of amyloid hIAPP8－37

圖10 納米材料的多層次異相有序組裝及修飾Fig.10 Multi-level heterogeneous ordered assemblies and the modifications of nanomaterials

納米材料與蛋白質(zhì)相互作用形成的納米材料-蛋白質(zhì)復(fù)合物會(huì)影響納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)及其在生物系統(tǒng)中的分布及生物效應(yīng)，例如納米材料的團(tuán)聚，等離激元共振的偏移，量子發(fā)光效率的改變，生物兼容性的提高及生物毒性的降低等98－102，在人工支架、人工組織等醫(yī)療方面得到了很好的應(yīng)用。利用蛋白質(zhì)或多肽在納米材料表面的組裝可以優(yōu)化納米材料的合成103，實(shí)現(xiàn)納米材料的功能化修飾。通過(guò)基因技術(shù)篩選出與金屬(Pt、Au、Ag)，氧化物(ZnO、Cu2O、CaCO3)，半導(dǎo)體(CdS、ZnS、GaAs)及其他基底具有親和力的基因工程多肽(GEPIs)14,43,80,104。這些多肽在納米科技領(lǐng)域最主要的應(yīng)用是作為無(wú)機(jī)材料的組裝及連接分子對(duì)納米材料表面功能化修飾，或者通過(guò)與材料表面的識(shí)別與組裝介導(dǎo)材料形成多功能有序的異質(zhì)組裝結(jié)構(gòu)，是納米材料組裝、生長(zhǎng)及表面功能化很好的模板(圖10)。通過(guò)多肽分子將納米材料靶向到其他表面可形成多層次納米結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的探測(cè)。另外，通過(guò)引入另一條多肽還可實(shí)現(xiàn)兩種材料的結(jié)合。如多肽AuBP1和QBP1可以分別識(shí)別金表面及硅表面，多功能多肽AuBP1-QBP1可以實(shí)現(xiàn)金納米顆粒在硅表面的修飾105。基于生物分子識(shí)別機(jī)制，還可以引入量子點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)表面等離子激元增強(qiáng)熒光。通過(guò)引入具有π共軛電子的材料識(shí)別多肽，可以實(shí)現(xiàn)生物材料與電子元件之間的連接和電子傳輸，在生物傳感及疾病診斷有所應(yīng)用106。與羥磷灰石(HA)具有高親和力的多肽HABP1在溶液中的組裝可以調(diào)控磷酸鈣的形成107及晶體形貌，實(shí)現(xiàn)特定組織的修復(fù)及重生等108。基于與蛋白質(zhì)界面間相互作用的材料制備109，為納米材料在微電子、納米科技及生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了新的途徑。

5 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)/多肽分子與納米材料界面之間相互作用的研究涉及眾多領(lǐng)域，有著重要的科學(xué)價(jià)值。但是其相互作用的分子機(jī)制還有待于深入研究。另外一方面，隨著化妝品、醫(yī)藥、食品及洗護(hù)用品等納米材料產(chǎn)品的大量生產(chǎn)，其不僅給社會(huì)及生活帶來(lái)了便利，同時(shí)也帶來(lái)了挑戰(zhàn)。納米材料在使用及食用過(guò)程中不可避免進(jìn)入人體。我們?cè)诎l(fā)掘其潛力的同時(shí)必須認(rèn)識(shí)到其可能的安全隱患，包括其在生體內(nèi)的代謝途徑、細(xì)胞毒性及環(huán)境污染等。納米材料的安全性是社會(huì)各界關(guān)心的重要問題，其評(píng)估是一個(gè)不可逃避的科學(xué)問題，也是一個(gè)社會(huì)及倫理學(xué)問題。納米材料安全性評(píng)估急需臨床及醫(yī)學(xué)調(diào)查及毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化。總之，人類應(yīng)該高度重視納米材料的潛在風(fēng)險(xiǎn)，推動(dòng)其理性使用，從而服務(wù)人類，造福人類。

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Molecular Mechanisms of Interface Interactions between Nanomaterials and Proteins

HOU Jing-Fei YANG Yan-Lian*WANG Chen*
(National Center for Nanoscience and Technology,CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety,CAS Key Laboratory of Standardization and Measurement for Nanotechnology,CAS Center for Excellence in Nanoscience,Beijing 100190,P.R.China)

Nanomaterials have excellent properties and have been used widely in chemical engineering, electronics,mechanics,environment,energy,aerospace,and many other fields in recent years.Besides, nanomaterials have attracted increasing attention in the biomedical field.The interactions between nanomaterials and protein molecules are not only significant to the basic science of the biomedical field,but also crucial for the evaluation of biomedical applications and biosafety of nanomaterials.The interfacial interactions between proteins and nanomaterials could induce a series of changes to the structures and functions of proteins,such as the transformation of protein conformations,and the modulation of aggregation states,which would influence the functions of the protein molecules.Interfacial interactions can also influence the physicochemical features of nanomaterials,including morphology,size,hydrophilicity/hydrophobicity,and surface charge density.In this review we explained the molecular level mechanisms for the interactions between nanomaterials and proteins at the interface based on the detection technologies,and discussed the changes in physical and chemical features,structures,and functions.We envision this review could be helpful for the deeper understanding of the complicated interactions between nanomaterials and proteins,and could be beneficial for promoting the healthy,safe,and sustainable development and application of nanomaterials in the biological and medical fields.

Nanomaterial;Protein;Interface;Interaction;Biological and medical application; Molecular mechanism

O647

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10.3866/PKU.WHXB201608233www.whxb.pku.edu.cn

Received:June 1,2016;Revised:August 22,2016;Published online:August 23,2016.

*Corresponding authors.YANG Yan-Lian,Email:yangyl@nanoctr.cn;Tel:+86-10-82545559.WANG Chen,Email:wangch@nanoctr.cn; Tel:+86-10-82545561.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21273051).

國(guó)家自然科學(xué)基金(21273051)資助項(xiàng)目?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica