范為之，姜心禪，關(guān)永格，李坤寅

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

裸鼠人來源性子宮腺肌病造模方法的比較

范為之1，姜心禪1，關(guān)永格2，李坤寅1

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

目的 通過不同的造模方法建立裸鼠人來源性子宮腺肌病模型，篩選出理想的造模方法，為研究子宮腺肌病發(fā)病機制及相關(guān)治療方案提供理想的動物模型。方法 將80只雌性裸鼠隨機分為腹腔種植組、皮下種植組、腹腔注射組和皮下注射組，每組20只。各模型組分別采用不同造模方法建立裸鼠人來源性子宮腺肌病模型，術(shù)后4周觀察移植物的體積及組織形態(tài)學(xué)。結(jié)果 腹腔種植組建模成功率95%，皮下種植組建模成功率45%，腹腔注射法及皮下注射法成模率0%。結(jié)論 腹腔種植法建立子宮腺肌病裸鼠模型成模率高，穩(wěn)定性良好，是一種理想的人來源性子宮腺肌病動物模型。

子宮腺肌??；人來源性；動物模型；裸鼠

子宮腺肌病近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，已成為婦科常見疑難病[1]。漸進(jìn)性痛經(jīng)、不孕為子宮腺肌病最主要的臨床表現(xiàn)，痛經(jīng)發(fā)生率高達(dá)77.8%[2]，嚴(yán)重影響患者生活和工作。多年來，對于子宮腺肌病生理病理機制以及治療效果的探索仍存在諸多空白，但因在人體中很難進(jìn)行對照研究，限制了子宮腺肌病的研究進(jìn)展。因此，建立一種理想的子宮腺肌病動物模型來深入探討和研究子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展和治療，是目前迫切需要解決的問題。本研究采用4種造模方式對裸鼠進(jìn)行造模：腹腔種植法、腹腔注射法、皮下種植法和皮下注射法[3-5]，并篩選優(yōu)化出成模率高、穩(wěn)定性良好的人來源性子宮腺肌病裸鼠模型。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級BALB/C-nu裸小鼠80只，6～8周齡，雌性，體重(19.12±0.46)g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0034]，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗室[SYXK(粵)2013-0092]，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，光照：150～200 lx，12 h/12 h明暗交替，噪音<50 db，每只籠內(nèi)飼養(yǎng)5只裸鼠，自由飲食，按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的動物實驗倫理審查(編號：TCMF1-2015048)。

80只裸鼠隨機分為四組進(jìn)行實驗造模，分別為腹腔種植組、皮下種植組、腹腔注射組、皮下注射組，每組各20只裸鼠。

1.2 手術(shù)器械及試劑

12.5 cm持針器、12.5 cm止血鉗、10 cm眼科剪、10 cm眼用有齒鑷、10 cm眼用有鉤鑷(上海金鐘醫(yī)療手術(shù)器械廠)；4/0帶針可吸收縫線(上海金環(huán)醫(yī)用縫線廠)；電子游標(biāo)卡尺；注射用青霉素鈉(蘇州潤澤制藥公司，批號：15062002)；水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150325)、烏拉坦(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150723)；BioCoatTMMatrigel基質(zhì)(BD公司)；PBS緩沖液(Hyclone公司，批號NZM1300)；青-鏈霉素溶液(Hyclone公司，批號J130054)。

1.3 移植標(biāo)本來源

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院要求手術(shù)的子宮腺肌病患者1例，取其部分病灶組織用于移植。同時取部分病灶組織用于子宮腺肌病原代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4 移植標(biāo)本的采集及處理

1.4.1 腹腔種植組及皮下種植組的標(biāo)本采集和處理

手術(shù)室無菌獲取標(biāo)本，用手術(shù)刀切開子宮后壁(一般病灶均位于子宮后壁)或者腺肌瘤處切取標(biāo)本組織2 cm×2 cm×2 cm，放入冰浴PBS緩沖液，0.5 h內(nèi)送實驗室進(jìn)行腹腔移植(術(shù)后冰凍病理檢查結(jié)果不符合者及時剔出)。用無齒鑷將病灶組織在小瓶中用PBS緩沖液(加入青-鏈霉素溶液200 U/mL)沖洗，去除組織液及血液，反復(fù)沖洗3次。在培養(yǎng)皿中用眼科剪刀剪碎組織(均為2 mm×2 mm×2 mm的組織塊)。

1.4.2 腹腔注射組及皮下注射組的標(biāo)本采集和處理

手術(shù)室無菌獲取離體子宮或病灶組織,用手術(shù)刀切開病灶組織,切取大小約1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm組織，放入冰浴PBS緩沖液,0.5 h內(nèi)送細(xì)胞實驗室處理，參考相關(guān)文獻(xiàn)步驟[4]進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)?

1.5 動物造模

1.5.1 腹腔種植組的動物造模

手術(shù)當(dāng)日早晨對欲行手術(shù)的裸鼠禁食水，術(shù)前稱重。裸鼠行腹腔麻醉(5%水合氯醛+12.5%烏拉坦1∶1混合溶液,5 mL/kg)[5]，宜手術(shù)麻醉深度：動物由興奮轉(zhuǎn)為抑制后，動物四肢緊張度明顯降低，角膜反射遲鈍，皮膚痛覺消失。全麻成功后，取仰臥位固定于操作板上，碘伏消毒腹部，并鋪巾，充分暴露手術(shù)視野。取中下腹正中0.5 cm縱切口，依次切開腹壁、筋膜、腹膜層，將已備標(biāo)本種植于裸鼠盆、腹腔不同部位，每只裸鼠植入2塊。種植后依次縫合腹膜、腹壁切口。大腿肌注青霉素3 d預(yù)防感染。

1.5.2 皮下種植組的動物造模

裸鼠依照上法術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉后，取俯臥位固定于操作板上，碘伏消毒背部皮膚。取后背正中下1/3處做0.5 cm橫切口，切開皮膚后，將已備標(biāo)本組織自切口置入，用眼科鑷將標(biāo)本沿皮下與淺筋膜的間隙推至腋下皮膚松弛處，每只裸鼠植入2塊，縫合皮膚。大腿肌注青霉素3 d預(yù)防感染。

腹腔種植組及皮下種植組的手術(shù)操作由4位技術(shù)熟練的實驗人員同時進(jìn)行，標(biāo)本獲取后至移植結(jié)束2 h內(nèi)完成。術(shù)后裸鼠置于干凈飼養(yǎng)籠內(nèi)，使用暖光燈照射保溫至蘇醒。術(shù)后注意裸鼠排便、進(jìn)食、飲水、皮色情況。

1.5.3 腹腔注射組的動物造模

將子宮腺肌病原代細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿后，進(jìn)行計數(shù)。用I型膠原酶洗脫貼壁細(xì)胞并離心。將人子宮腺肌病原代細(xì)胞5×106個與0.5 mL Matrigel膠注射至裸鼠腹腔內(nèi)。

1.5.4 皮下注射組的動物造模

將人子宮腺肌病原代細(xì)胞5×106個與0.5 mL Matrigel膠注射至裸鼠腋下皮下。

1.6 造模成功的觀測指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)

1.6.1 移植物外觀觀察

造模后4周于造模部位取材，測量各組裸鼠病灶組織的最大直徑(L)及最大橫徑(W)，計算病灶體積(V)，V=L×W2/2，比較植入病灶組織體積增大情況。

1.6.2 鏡下病理檢查鑒定與標(biāo)準(zhǔn)

造模后4周取造模部位腫物置于4%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，倒置顯微鏡檢查并拍照。移植物組織內(nèi)，見周圍平滑肌組織內(nèi)散在包裹子宮內(nèi)膜腺體和疏松水腫的間質(zhì)，內(nèi)膜腺體腔內(nèi)可有分泌物和炎細(xì)胞存在，可見泡沫細(xì)胞反應(yīng)。內(nèi)膜樣組織旁可見含鐵血紅素顆粒狀沉積。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 裸鼠存活及成模情況

80只建模裸鼠，其中1只(腹腔種植組)因麻醉過深抑制呼吸心率，術(shù)后2 h未能蘇醒并死亡。存活79只裸鼠，均于4周后取材鑒定造模結(jié)果。

腹腔種植組裸鼠取材后，造模移植部位呈深紅色，表面欠規(guī)則球狀，質(zhì)地較硬，直徑1.8～2.5 mm，基底部與盆腹壁連接處見有血管生成(圖1 A)。組織學(xué)觀察可見：組織血供良好，可見平滑肌組織內(nèi)可見散在子宮內(nèi)膜腺體，伴含鐵血紅素著色。平滑肌細(xì)胞肥大，間質(zhì)疏松水腫，19例均符合子宮腺肌病表現(xiàn)(圖2)。建模成功率為95%(19/20)。

皮下種植組裸鼠取材后，造模移植部位呈深紅色或淡黃色橢圓狀，質(zhì)地硬，直徑1.2～2.0 mm，周邊未見明顯血液供應(yīng)(圖1 B)。組織學(xué)觀察可見：部分移植標(biāo)本(9例)可見平滑肌組織透明變性，偶見萎縮的子宮內(nèi)膜腺體(圖3)。余11例均為平滑肌組織變性機化，伴局部鈣化。建模成功率為45%(9/20)。

腹腔注射組20例取材時見盆腹腔廣泛粘連，大網(wǎng)膜、腸管、腹部粘連明顯，無法確定成模位置，取粘連嚴(yán)重部位組織行HE染色鑒定，組織學(xué)觀察見：鏡下均為疏松結(jié)締組織及脂肪組織，未見子宮腺肌病樣改變。建模成功率為0%(0/20)。

皮下注射組中3例在造模后第1周見注射處腋下皮下成瘤，約6 mm×6 mm×4 mm，第2～4周腫塊逐漸減小至完全消失，余下17例未見外觀形態(tài)學(xué)變化。造模后4周，取造模處皮下組織行HE染色鑒定，組織學(xué)觀察見：大量淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，未見子宮腺肌病樣改變。建模成功率為0%(0/20)。

2.2 病灶移植物體積變化

建模后第4周取材并測量病灶移植物體積，腹腔種植組病灶體積(8.83±1.06)mm3，皮下種植組病灶體積(6.92±0.53)mm3，腹腔注射組及皮下注射組未見明顯病灶組織生成。

四組建模方法比較后發(fā)現(xiàn)：移植物體積及成模率各組差異有顯著性(發(fā)病率χ2=54.0659，P<0.05；移植物體積F=23.46，P<0.05)。腹腔種植組成模率高于其余各組(P<0.05)，移植物體積腹腔種植組與其余各組差異有顯著性(P<0.05)。

3 討論

子宮腺肌病目前造模方法大致可分為藥物誘導(dǎo)及手術(shù)誘導(dǎo)兩種。藥物誘導(dǎo)有長期飼喂雌激素(大于6個月)[6]、雌孕激素聯(lián)合[7]、孕激素、催乳素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)誘導(dǎo)[8]。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)誘導(dǎo)法為最主要的藥物誘導(dǎo)子宮腺肌病裸鼠模型的方法，其特點為發(fā)病快,發(fā)病率高。Mehasseb等[9]給新生CD-1小鼠出生第2～5天口服TAM 1 mg/kg，每日1次,10 d時已觀察到子宮腺肌病灶的形成，42 d時發(fā)病率為100%。但藥物誘導(dǎo)子宮腺肌病動物模型常常并發(fā)子宮內(nèi)膜異常增生和子宮內(nèi)膜癌，且其發(fā)病機制不符合人子宮腺肌病內(nèi)膜異位侵襲的過程。手術(shù)誘導(dǎo)方式中子宮丘腦移植法是建立鼠子宮腺肌病模型的經(jīng)典方法，將小鼠的垂體移植到同種異體的小鼠子宮腔內(nèi)或腎包膜下均可誘導(dǎo)小鼠子宮腺肌病的形成。但這一方法對手術(shù)技巧要求較高、成模時間較長[10]，可操作性較差，同時它造成了小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂,模型鼠出現(xiàn)高泌乳素血癥幾率較高[11]。

注：A．腹腔種植組子宮腺肌病病灶；B.皮下種植組子宮腺肌病病灶。圖1 子宮腺肌病病灶Note. A.Adenomyosis lesion formed after intraperitoneal implantation. B. Adenomyosis lesion formed after subcutaneous implantation.Fig.1 Gross appearance of the uterine adenomyosis lesions

注：A. 腹腔種植組子宮腺肌病病灶(×200)；B. 腹腔種植組子宮腺肌病病灶(×400)圖2 腹腔種植組移植物HE染色切片Note. A.Adenomyosis lesion formed after intraperitoneal implantation. ×200. B. The same lesion,×400.Fig.2 Histological appearance of the adenomyosis lesions formed after intraperitoneal implantation at 4 weeks after surgery

注：A.皮下種植組子宮腺肌病病灶(×200)；B. 皮下種植組子宮腺肌病病灶(×400)。圖3 皮下種植組移植物HE染色切片Note. A. Adenomyosis lesion,×200. B. The same lesion,×400.Fig.3 Histological appearance of the adenomyosis lesions formed at 4 weeks after subcutaneous implantation

子宮腺肌病與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理相似，均是子宮內(nèi)膜在被覆宮腔以外的地方種植生長。子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型發(fā)展成熟，研究周期較短，可作為新的子宮腺肌病裸鼠模型參考。筆者在參考國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選取并采用了4種方法對裸鼠進(jìn)行子宮腺肌病裸鼠造模。曾有研究認(rèn)為腹腔種植及皮下種植建模成功率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[6,12]，但本研究中腹腔種植成功率高于皮下種植，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。究其原因，可能因為腹腔種植法能夠模擬子宮腺肌病灶在腹腔內(nèi)自然生長過程以及適應(yīng)腹腔微環(huán)境的變化，同時腹膜血運較為豐富，移植物能與周圍組織建立良好的血運關(guān)系進(jìn)而存活。皮下種植法雖然無需縫合固定移植物，創(chuàng)傷較小，但皮下及淺筋膜間血運較差，移植物易被周圍結(jié)締組織包裹機化，失去生物活性。腹腔注射法操作簡單，但是病灶在腹腔內(nèi)的定位盲目，容易遺漏。腹腔注射造模后廣泛粘連的大網(wǎng)膜、腸管、腹壁，可能與Matrigel基質(zhì)膠具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞生長，促進(jìn)組織纖維酶原活化的作用有關(guān)。皮下注射法雖可直接觀察移植物的大小，但無法體現(xiàn)移植物在腹腔內(nèi)自然生長的臨床特點[13]。從另一個角度思考，子宮腺肌病為良性腫瘤，其侵蝕性遠(yuǎn)低于惡性腫瘤細(xì)胞，具有侵入性的腺體及間質(zhì)經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后也必然存在活性下降的情況。因此，本實驗中皮下注射法無法穩(wěn)定成瘤。

本實驗造模中的幾點體會：有文獻(xiàn)指出，廣泛的粘連導(dǎo)致的腸梗阻和感染是導(dǎo)致建模動物死亡的主要原因[14]，故術(shù)前建模動物應(yīng)禁食水，腸道空虛可以降低術(shù)中腹腔操作誤傷腸道，而且可以減少腸梗阻的發(fā)生率，能有效降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率。但術(shù)前裸鼠禁食水應(yīng)當(dāng)從術(shù)晨開始，到獲得手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行移植(約為4 h)。因裸鼠體重較輕且體質(zhì)脆弱，如參考人類術(shù)前禁食水時限(術(shù)前夜22:00)，易造成裸鼠脫水、或因饑餓互相撕咬而受傷、失血，上述兩種情況都將大大降低裸鼠麻醉、手術(shù)耐受性，造成術(shù)后裸鼠死亡率上升。術(shù)中固定移植物、縫合傷口的縫線應(yīng)當(dāng)選擇可吸收線[15]，可以有效的降低術(shù)后因異物絲線造成的腹腔內(nèi)粘連以及并發(fā)癥?？p合皮膚時縫線尾端應(yīng)當(dāng)盡可能剪短，防止裸鼠蘇醒后啃咬縫線，致使術(shù)后切口裂開，增加感染、死亡風(fēng)險。術(shù)后麻醉復(fù)蘇階段應(yīng)當(dāng)將裸鼠置于溫暖恒溫處，加快蘇醒時間，可以減少因體溫過低、呼吸心率過慢而造成的死亡。

綜上所述，使用腹腔種植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型成模率高，穩(wěn)定性良好，且能夠模擬子宮腺肌病病灶在腹腔內(nèi)自然生長過程以及腹腔微環(huán)境的變化，是一種提高子宮腺肌病建模成功率、符合人體機制的新方法，能夠為探索子宮腺肌病病理生理機制以及治療方法提供理想的動物模型。

[1] Elisa G, Serafini A, Inversetti A, etal. Adenomyosis and its impact on women fertility[J].Iran J Reprod Med. 2015, 13(6): 327-336.

[2] 王珺, 張恒輝, 段華. 雌激素受體-α在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)中的表達(dá) [J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2010, 90(27): 1914-1917.

[3] 崔陽陽,孫偉偉,趙瑞華. 子宮內(nèi)膜異位癥動物模型研究進(jìn)展[J]. 中國實驗動物學(xué)報,2013, 21(5):86-89+94.

[4] 王帥. 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌病MAPK/ERK信號通路干預(yù)機制[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué),2015.

[5] 張全鵬,王慧,陳旦,等.水合氯醛、烏拉坦及其1:1混合液在SD大鼠麻醉中的效果比較及應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011, 11(7):1208-1212.

[6] Mori T, Singtripop T, Kawashima S. Animal model of uterine adenomyosis: Is prolactin a potent inducer of adenomyosis in mice？[J].1991;165:231-234．

[7] Ostrander PL, Mills KT, Bern HA. Long-term responses of the mouse uterus to neonatal diethylstilbestrol treatment and to later sex hormone exposure[J].J Natl Cancer Inst, 1985;74:121-135．

[8] Green AR, Styles JA, Japan EL, etal. Neonatal tamoxifen treatment of mice leads to adenomyosis but not uterine cancer[J]. Exp Toxicol Pathol，2005, 56(4/5):255-263.

[9] Mehasseb MK, Bell SC, Habiba MA. The effects of tamoxifen and estradiol on myometrial differentiation and organization during early uterine development in the CD-I mouse[J]. Reproduction, 2009, 138(2):340-350．

[10] 饒妍妍, 項雙衛(wèi). 舒必利與垂體移植誘發(fā)小鼠子宮腺肌病的比較[J]. 中國實驗動物學(xué)報,2010,18(3):258-261.

[11] Medina MG, Lebovic DI.Endometriosis-associated nerve fibers and pain[J].Acta Obstet Gynecol Scand. 2009, 88(9):968-975.

[12] 彭艷，何援利.大鼠子宮內(nèi)膜異位癥動物模型建立方法的比較[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012,41(25): 2619-2620.

[13] 孫俊杰, 尹利榮. 子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型的建立與血管生成研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(7):979-982.

[14] 哈春芳,肖成明,張晟寧,等.開放法大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立與評價[J]．山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2011, 49(1):62-66．

[15] 伍明. 可吸收線(快薇喬4/0)連續(xù)縫合家兔頭皮與普通慕絲線(4/0)間斷縫合的優(yōu)劣對照研究[D].中南大學(xué),2007.

Comparison of four establishment methods of nude mouse models of human-derived uterine adenomyosis

FAN Wei-zhi1，JIANG Xin-chan1，GUAN Yong-ge2， LI Kun-yin1

(1. Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405)

Objective The purpose of this study was to compare the adenomyosis models in nude mice generated by four different methods,and to find out an optimal modeling method, and to provide an ideal animal model for exploring pathogenesis and experimental treatment of uterine adenomyosis.Methods 1. 80 female healthy nude mouse were divided randomly into 4 groups: Intraperitoneal implantation group,subcutaneous implantation group, intraperitoneal injection group, and subcutaneous injection group. The transplants were taken for pathological examination at 4 weeks after surgery.Results The success rate of intraperitoneal implantation group was 95%，and that of the subcutaneous implantation group was 45%，while the success rate of intraperitoneal injection group and subcutaneous injection group was 0%.Conclusions Establishment of a nude mouse model of uterine adenomyosis by intraperitoneal implantation method has a high success rate and with good stability, and is an ideal mouse model of human-derived uterine adenomyosis.

Adenomyosis; Human uterine adenomyosis; Mouse model; Nude mouse

LI Kun-yin，E-mail: lky0303@gzucm.edu.cn

國家自然科學(xué)基金項目(NO 81473715)。

范為之(1990-)，女，博士研究生，研究方向：補腎活血法治療婦科腫瘤及月經(jīng)病研究。

李坤寅(1962-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥防治月經(jīng)病及婦科癥瘕。E-mail： lky0303@gzucm.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0043-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.008

2016-07-13