陳愉生，陳正偉，俞梅娥，涂洵崴，李鴻茹，林凌，林如輝

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院；福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福州 350000；. 福建省呼吸四病研究室，福州 350000； 3. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福州 350000；4. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350000)

肺腺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的生物發(fā)光成像和SPECT/CT的比較

陳愉生1、2，陳正偉1，俞梅娥1，涂洵崴1，李鴻茹1、2，林凌3，林如輝4

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院；福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福州 350000；. 福建省呼吸四病研究室，福州 350000； 3. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福州 350000；4. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350000)

目的 利用穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的luc+-PC-9人肺腺癌細(xì)胞建立肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，比較生物發(fā)光成像和18F-FDG(18F-fluorodeoxyglucose，18F-氟代脫氧葡糖)SPECT/CT在肺癌轉(zhuǎn)移模型中的評(píng)估作用。方法 將luc+-PC-9細(xì)胞懸液經(jīng)左心室注入BALB/c裸鼠建立肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，分別在第4、5周行生物發(fā)光成像、18F-FDG SPECT/CT檢查觀察裸鼠成瘤情況， 以H&E染色病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)比較兩種方法在肺癌轉(zhuǎn)移模型中的作用。結(jié)果 經(jīng)左心室注射luc+-PC-9細(xì)胞建立肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，腦轉(zhuǎn)移成功率85%。腫瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù)與發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)，具有較好的線性關(guān)系(R2=0.96)。生物發(fā)光成像能在顱腦、脊柱和股骨觀察到熒光信號(hào)，病理結(jié)果證實(shí)為轉(zhuǎn)移灶。18F-FDG SPECT/CT在腦組織未見明顯的代謝濃聚灶，在股骨或脊柱發(fā)現(xiàn)代謝濃聚灶，且病理證實(shí)均有骨髓轉(zhuǎn)移。結(jié)論 左心室注射法是建立人肺腺癌腦轉(zhuǎn)移模型的可靠方法。生物發(fā)光成像系統(tǒng)在檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移具有較高的靈敏度和特異度，能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)觀察轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)情況；18F-FDG SPECT/CT在檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移灶并不具有優(yōu)勢(shì)，更適合于檢測(cè)骨轉(zhuǎn)移灶。

肺癌； 腦轉(zhuǎn)移；骨轉(zhuǎn)移； 動(dòng)物模型； 生物發(fā)光成像；單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)

目前肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居所有惡性腫瘤之首。盡管用于治療肺癌的技術(shù)和方法在不斷進(jìn)步，但是治療效果并不理想，五年生存率僅有15%[1]。而非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有的肺癌患者80%左右，其中20%～40%的非小細(xì)胞肺癌患者在病程中出現(xiàn)顱腦轉(zhuǎn)移，自然生存時(shí)間為1～3個(gè)月[2-4]。由于肺癌腦轉(zhuǎn)移患者放、化療效果不佳，預(yù)后較差，其中位生存期僅有4～5個(gè)月[2]。故目前有很多的學(xué)者致力于肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，迫切需求合適肺癌腦轉(zhuǎn)移模型的建立以及合適的檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)左心室注射穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞建立肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，以病理切片為金標(biāo)準(zhǔn)比較生物發(fā)光成像及18F-氟代脫氧葡糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG) SPET/CT(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描)評(píng)估轉(zhuǎn)移灶的作用。為后續(xù)肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究采用合適的肺癌轉(zhuǎn)移評(píng)價(jià)方法提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裸鼠與細(xì)胞

SPF級(jí)BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2012-002】，24只，體重15～17 g，4周齡，均為雌性，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物室【SYXK(閩)2012-0001】；所用的飼料、水、墊料都經(jīng)嚴(yán)格滅菌處理，并按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則給予人道的關(guān)懷。穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的luc+-PC-9細(xì)胞購自上海吉?jiǎng)P公司。

1.1.2 試劑與設(shè)備

胎牛血清(杭州四季青，中國(guó))、Pen-strep雙抗(Gibco，美國(guó))、RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone，美國(guó))、0.25% Trypsin-EDTA(Gibco，美國(guó))、Luciferin底物(美國(guó) Promega)、18F-FDG由福建省立醫(yī)院PET-CT中心提供、倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)、生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱(三洋，日本)、活體成像系統(tǒng)(ZVZS LUMINA II，美國(guó)Calzper Life Science)、SPET/CT(VECTor，MILabs，Netherland)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的luc+-PC-9細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1% Pen-strep的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)用0.25% Trypsin-EDTA使貼壁細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中后1∶2傳代。

1.2.2 luc+-PC-9細(xì)胞體外生物發(fā)光活性檢測(cè)

luc+-PC-9細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中。分別接種1×105、5×104、2.5×104、1×104、5×103、1×103、500及100個(gè)luc+-PC-9細(xì)胞于黑色96孔板中，每個(gè)濃度梯度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后用PBS清洗2遍，加入Luciferin底物，使終濃度為150 μg/mL。室溫下避光放置3～5 min后，在活體成像系統(tǒng)下觀察，并讀取數(shù)據(jù)，記錄每孔的光子總數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析總光子數(shù)與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。

1.2.3 裸鼠肺癌腦轉(zhuǎn)移模型的建立

裸鼠肺癌腦轉(zhuǎn)移模型采用經(jīng)左心室注射腫瘤細(xì)胞的方法造模。裸鼠經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛麻醉后，固定于平板上，于胸骨左緣第二肋旁開2 mm處45度角進(jìn)針[1 mL針筒內(nèi)已吸取腫瘤細(xì)胞懸液0.1 mL(即1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞)并預(yù)留0.05 mL空氣]，進(jìn)針5 mm左右見血液噴射涌入說明針頭進(jìn)入左心室，然后緩慢將腫瘤細(xì)胞注射入左心室。接種后的裸鼠置于SPF環(huán)境內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng), 并每天密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、一般情況等。分別在注射腫瘤細(xì)胞第4周、5周后隨機(jī)選取10只裸鼠行生物發(fā)光成像。同時(shí)分別在10只鼠中隨機(jī)選取3只裸鼠行18F-FDG SPECT/CT成像。顯像完成后留取腦、肝、腎、股骨以及脊柱。經(jīng)脫水固定、石蠟包埋、切片、H&E染色觀察。

1.2.4 生物發(fā)光成像

將待檢測(cè)裸鼠麻醉后，腹腔注射事先配制好的濃度為30 mg/mL 熒光素酶底物(luciferin)，每只0.2 mL。10 min后放入動(dòng)物體內(nèi)可見光成像系統(tǒng)中檢測(cè)，計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)拍照。

1.2.518F-FDG SPET/CT

實(shí)驗(yàn)前10 h裸鼠禁食，但不禁水。從裸鼠尾靜脈注射約200 μCi放射性示蹤劑18F-FDG，待攝取18F-FDG 30 min后，通過吸入混有2%異氟烷的純氧實(shí)施麻醉且在整個(gè)掃描顯像過程中持續(xù)吸入，然后俯臥位固定于掃描床，打開恒溫裝置，進(jìn)行SPET/CT顯像。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，luc+-PC-9細(xì)胞數(shù)與總光子數(shù)的相關(guān)性采用線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 活體成像系統(tǒng)體外檢測(cè)luc+-PC-9的發(fā)光能力

圖1 luc+-PC-9細(xì)胞數(shù)與總光子數(shù)的關(guān)系Fig.1 Relation of numbers of luc+-PC-9 cells and total photon flux

利用活體成像系統(tǒng)檢測(cè)luc+-PC-9細(xì)胞的發(fā)光能力，結(jié)果顯示(圖1)：隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，其總光子數(shù)也相應(yīng)增加，兩者呈正相關(guān)，具有良好的線性關(guān)系(R2=0.96，回歸方程為：y=401.56x + 548 685.2658)，最低可檢測(cè)到1000個(gè)細(xì)胞發(fā)出的光子。

2.2 裸鼠的一般情況

在注射腫瘤細(xì)胞后，其中一只裸鼠立即出現(xiàn)一側(cè)肢體偏癱，并于第2天死亡。其余裸鼠于注射腫瘤細(xì)胞3周后大部分出現(xiàn)體重下降，并逐漸出現(xiàn)弓背抬高、體型消瘦、精神萎靡、呼吸急促等惡液質(zhì)表現(xiàn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，1只裸鼠在顱骨肉眼觀察到腫瘤結(jié)節(jié)，1只出現(xiàn)眼睛失明，2只出現(xiàn)肢體癱瘓。2只在整個(gè)觀察期間均未發(fā)現(xiàn)任何異常癥狀，體重也未見明顯下降。(圖2)

2.3 病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

注：A：裸鼠體型極度消瘦；B：可見裸鼠顱腦瘤結(jié)節(jié)；C：右眼失明；D：左側(cè)后肢癱瘓；E箭頭所示為顱腦轉(zhuǎn)移灶；F：箭頭所示為脊柱旁轉(zhuǎn)移灶。圖2 肺癌腦轉(zhuǎn)移模型裸鼠的一般情況Note. A: An extensively emaciated mouse；B：Tumor nodules in the brain; C: Blindness of the right eye; D: Left hind limb paralysis; E: Arrow indicates the brain metastasis; F: Arrow indicates the paravertebral metastasis.Fig.2 Gross appearances of the mouse models with brain metastasis from lung cancer

注：A：腦組織病理，箭頭所示為腦轉(zhuǎn)移灶；B：骨組織病理,箭頭所示為骨轉(zhuǎn)移灶；C：肝組織；D: 腎組織。圖3 腦、骨、肝、腎組織H&E染色病理結(jié)果(×40)Fig.3 Histological changes of the brain(A), bone(B), liver(C) and kidney tissues (D). Arrows indicate tumor metastasis.HE staining.×40

在成像結(jié)束后，人道處死裸鼠，留取腦、肝、腎、骨等靶器官行H&E染色。腦組織H&E染色結(jié)果顯示可觀察到肺癌轉(zhuǎn)移灶，表現(xiàn)為呈巣狀分布，大小不一，與正常腦組織分界清楚，轉(zhuǎn)移灶中未見明顯正常腦組織結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞可見病理核分裂(圖3A)。骨組織HE染色結(jié)果顯示：在光鏡下骨質(zhì)破壞，骨髓腔內(nèi)可見異常增生的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞大小不一，可見巨細(xì)胞，病理核分裂現(xiàn)象(圖3B)。肝、腎等組織未見明顯轉(zhuǎn)移灶。根據(jù)病理結(jié)果，經(jīng)左心室注射luc+-PC-9細(xì)胞建立肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，腦轉(zhuǎn)移率：89.5%(17/19)，骨轉(zhuǎn)移率：78.9%(15/19)，肝腎未見轉(zhuǎn)移。

2.4 生物發(fā)光成像和18F-FDG SPET/CT成像診斷效能比較

2.4.1 生物發(fā)光成像

本實(shí)驗(yàn)通過左心室注射一定數(shù)量的luc+-PC-9細(xì)胞建立肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，通過在生物活體成像系統(tǒng)下觀察肺癌轉(zhuǎn)移情況。通過電腦圖像分析，生物發(fā)光成像能檢出最小的轉(zhuǎn)移灶大小為0.3 mm3。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在第4、5周裸鼠顱腦、股骨及脊柱等位置可觀察到明顯的熒光信號(hào)，經(jīng)病理證實(shí)，在相應(yīng)的位置能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。在第4周生物發(fā)光成像的結(jié)果：生物發(fā)光成像顱腦檢測(cè)到熒光且病理證實(shí)腦轉(zhuǎn)移的6只，未見熒光但腦轉(zhuǎn)移3只，既沒有熒光，病理也未見腦轉(zhuǎn)移1只。在3只假陰性的裸鼠中，發(fā)現(xiàn)顱腦轉(zhuǎn)移灶相對(duì)較小，且個(gè)數(shù)較少。在第5周顯像的9只裸鼠中觀察到顱腦熒光信號(hào)的有9只，沒有信號(hào)的1只，H&E染色病理切片中顱腦有熒光信號(hào)的裸鼠均發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移灶，沒熒光信號(hào)的裸鼠未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。第4周和第5周生物發(fā)光成像對(duì)比，熒光信號(hào)第5周明顯增強(qiáng)(圖4)，結(jié)合病理結(jié)果，第5周比第4周腦轉(zhuǎn)移灶明顯數(shù)量較多，體積較大。轉(zhuǎn)移灶的體積越大，熒光信號(hào)越強(qiáng)，但當(dāng)轉(zhuǎn)移灶增大到一定程度，轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)液化，腫瘤細(xì)胞壞死，熒光信號(hào)強(qiáng)度反而降低。

注：A、B圖分別為第4周、第5周裸鼠生物發(fā)光成像圖片。圖4 第4周與第5周裸鼠生物發(fā)光成像對(duì)比Fig.4 Comparison of bioluminescent imaging of the mice at 4th(A) and 5th(B) weeks

2.4.218F-FDG SPET/CT成像

分別從第4、5周生物發(fā)光成像的裸鼠中隨機(jī)選擇3只行SPET/CT成像，采集的圖像由計(jì)算機(jī)處理后分別獲得CT、SPECT和兩者融合的圖像。裸鼠腦組織未見明顯的代謝濃聚；所有裸鼠的股骨或脊柱均發(fā)現(xiàn)異常18F-FDG濃聚；肝腎未見18F-FDG異常濃聚(圖5)。病理H&E染色切片證實(shí)所有裸鼠顱腦均有大小不一的轉(zhuǎn)移灶。異常代謝濃聚的股骨或者脊柱均證實(shí)有骨髓轉(zhuǎn)移。肝腎未見明顯轉(zhuǎn)移灶。

注：A：顱腦SPECT/CT圖像，可見顱骨(箭頭)處代謝濃聚灶，腦組織未見明顯濃聚灶；B: 在股骨處(箭頭)可見代謝濃聚灶；C: 同一只裸鼠同時(shí)行生物發(fā)光成像和SPECT/CT。圖5 生物發(fā)光成像與SPECT/CT成像比較Fig.5 Comparison of bioluminescence imaging and SPECT/CT.A:An abnormal concentration in the skull (arrow)rather than in the brain tissue;B:A abnormal concentration in the femurs(arrows);C:The same mouse detected by both bioluminescence imaging and SPECT/CT

3 討論

目前建立腫瘤腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的方法，可以采用尾靜脈注射、原位種植、勁動(dòng)脈注射、左心室注射等。左心室注射法[5]能很好的模仿了腫瘤細(xì)胞血道轉(zhuǎn)移，符合腦轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性，腫瘤細(xì)胞所形成的轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移部位、病理形態(tài)，影像學(xué)表現(xiàn)都與臨床較相似。結(jié)合實(shí)驗(yàn)前期對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的摸索，左心室注射法是一種簡(jiǎn)便、損害較少、成功率較高的，能較好模擬肺癌腦轉(zhuǎn)移生理病理過程的造模方法[6]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的病理結(jié)果，在第4周即可檢出轉(zhuǎn)移灶，腦轉(zhuǎn)移率89.5%(17/19)，骨轉(zhuǎn)移率78.9%(15/19)，提示所選擇的肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9具有較好的腦轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移傾向，可以為后續(xù)研究腦轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移提供一定的參考價(jià)值。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)：有一只裸鼠在注射相同細(xì)胞懸液后立即出現(xiàn)偏癱，并于第2天死亡。分析可能的原因是：此裸鼠注射時(shí)間相對(duì)較后，可能出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊，或者細(xì)胞懸液不充分，存在細(xì)胞團(tuán)塊，在注射過程中，細(xì)胞團(tuán)塊堵塞腦血管引起的偏癱。故我們建議在構(gòu)建動(dòng)物模型時(shí)，細(xì)胞懸液放置的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，且細(xì)胞需充分消化，盡量不存在細(xì)胞團(tuán)塊。本實(shí)驗(yàn)所選取的細(xì)胞懸液濃度經(jīng)我們前期研究發(fā)現(xiàn)為較合適的濃度。當(dāng)濃度過大時(shí)，容易形成細(xì)胞團(tuán)塊，且裸鼠的生存期較短，死亡率較高；但濃度過小時(shí)，腦轉(zhuǎn)移的成功率反而下降。

目前在動(dòng)物腫瘤模型研究中，不同的影像技術(shù)如X線、CT、MRI、超聲、活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像、PET/CT、SPECT/CT等發(fā)揮著重要的作用，其各有優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的方法就顯得格外重要。本研究采用生物發(fā)光成像及18F-FDG SPECT/CT成像評(píng)價(jià)肺癌轉(zhuǎn)移模型?；铙w動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)包括熒光和生物發(fā)光兩種技術(shù)。熒光發(fā)光需要外源激發(fā)光使熒光基團(tuán)GFP發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射光，但生物體內(nèi)存在多種物質(zhì)在激發(fā)光的作用下也可發(fā)出非特異性熒光，從而影響檢測(cè)的靈敏度。而生物發(fā)光成像相對(duì)于熒光成像，其靈敏度較高。生物發(fā)光成像不需要激發(fā)光，僅需利用熒光素酶報(bào)告基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞使之穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，在熒光素底物、氧氣、Mg2+以及ATP作用下將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，且動(dòng)物本身不發(fā)光，生物發(fā)光成像具有極低的背景[7,8]。有研究[9-11]認(rèn)為：熒光發(fā)光技術(shù)適用于對(duì)淺表部位腫瘤或體外細(xì)胞水平的成像研究，而生物發(fā)光成像適用于研究深部組織原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶腫瘤。所以生物發(fā)光成像技術(shù)在腫瘤轉(zhuǎn)移模型研究上比熒光發(fā)光技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)。雖然如今PET/CT在腫瘤學(xué)研究中已經(jīng)占有相當(dāng)重要的作用，但是SPECT/CT在某些腫瘤影像中仍有其獨(dú)到之處，同樣可以定位放射性核素濃聚，通過核素濃聚的量化來評(píng)估病灶的代謝水平和良惡性鑒別。而且小動(dòng)物SPECT/CT的研究成本較PET/CT更低[12]。18F-FDG是目前臨床上使用最廣泛的腫瘤代謝顯像劑，絕大多數(shù)的腫瘤具有高代謝的特點(diǎn)，惡性腫瘤細(xì)胞的異常增殖需要過度利用葡萄糖，因此腫瘤細(xì)胞內(nèi)可異常濃聚18F-FDG，經(jīng)SPECT/CT可以顯示腫瘤的位置、形態(tài)、大小、數(shù)量、活性等。

本實(shí)驗(yàn)采用生物發(fā)光成像以及18F-FDG SPECT/CT評(píng)價(jià)肺癌轉(zhuǎn)移模型的成功率。經(jīng)體外腫瘤細(xì)胞發(fā)光活性檢測(cè)，發(fā)光強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞數(shù)目具有很好的線性關(guān)系，最低可檢測(cè)到103個(gè)細(xì)胞，與既往報(bào)告結(jié)果一致[13]。對(duì)比第4、5周生物發(fā)光成像結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第5周熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于第4周，結(jié)合病理結(jié)果：轉(zhuǎn)移灶的體積和數(shù)量越多，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。結(jié)合體外發(fā)光活性檢測(cè)結(jié)果，可根據(jù)熒光強(qiáng)度的多少，在一定程度上可以評(píng)估腫瘤細(xì)胞的多少，為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在活體動(dòng)物成像中能檢出的最小轉(zhuǎn)移灶大小為0.3 mm3，但受轉(zhuǎn)移灶的在顱腦中位置深淺的影響，會(huì)存在一定的偏差。生物發(fā)光成像在第4周檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移時(shí)有3只裸鼠漏診，通過觀察病理切片，分析原因可能為腦轉(zhuǎn)移灶較小且發(fā)出的光子經(jīng)腦組織后衰減，不能為機(jī)器設(shè)備檢測(cè)到導(dǎo)致漏診。生物發(fā)光成像在深部組織的小轉(zhuǎn)移灶監(jiān)測(cè)靈敏度有待進(jìn)一步的提高。Wetterwald等[14]發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光成像能發(fā)現(xiàn)0.5 mm3骨轉(zhuǎn)移灶，且能在X線檢查發(fā)現(xiàn)之前早期檢測(cè)出骨髓轉(zhuǎn)移。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光成像在骨轉(zhuǎn)移診斷上也具有較高的靈敏度和特異度，且能早期發(fā)現(xiàn)骨髓轉(zhuǎn)移。類似于PET/CT，SPECT/CT也是一種將SPECT和CT影像融合的設(shè)備，與PET相同，SPECT通過顯影異常核素濃聚灶與CT解剖異常部位相融合。在臨床應(yīng)用中，18F-FDG SPECT/CT較少用于診斷腦轉(zhuǎn)移瘤，更多的是使用18F-FDG PET/CT。但PET/CT也存在其局限性，當(dāng)轉(zhuǎn)移灶較小，且被大腦皮層的高代謝本底所掩蓋時(shí)，容易出現(xiàn)漏診[15]。且有動(dòng)物研究報(bào)告[5]18F-FDG示蹤劑在腦轉(zhuǎn)移瘤PET/CT上診斷同樣不具有明顯的優(yōu)勢(shì)，且18F-FDG作為非特異性腫瘤顯像劑，除腫瘤外，其他正常生理組織、炎癥等也可攝取，容易造成假陽性的結(jié)果。對(duì)于18F-FDG SPECT/CT檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移瘤，在本實(shí)驗(yàn)中均未在顱腦的位置發(fā)現(xiàn)明顯的異常濃聚灶。分析可能的原因是：首先，裸鼠大腦皮層的基礎(chǔ)代謝較高，導(dǎo)致18F-FDG在大腦皮層的本底較高，可能會(huì)覆蓋轉(zhuǎn)移灶的顯影。其次，轉(zhuǎn)移灶的體積較小，受設(shè)備分辨率的限制，不能發(fā)現(xiàn)較小轉(zhuǎn)移灶的顯影。所以18F-FDG SPECT/CT診斷腦轉(zhuǎn)移灶方面不具有優(yōu)勢(shì)，不適合于腦轉(zhuǎn)移瘤研究，期待將來能開發(fā)出靈敏度和特異度更高的示蹤劑。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)18F-FDG SPECT/CT在診斷骨轉(zhuǎn)移時(shí)具有較高的準(zhǔn)確率，而且相比X線、CT等只能在骨質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)才能發(fā)現(xiàn)，18F-FDG SPECT/CT能更早的發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。目前臨床上及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中SPECT/CT對(duì)骨轉(zhuǎn)移研究使用較多的是99TCmMDP，診斷骨轉(zhuǎn)移瘤的準(zhǔn)確度為96%[16]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，18F-FDG SPECT/CT診斷骨轉(zhuǎn)移同樣具有較高的準(zhǔn)確率，而且還能顯像其他器官的轉(zhuǎn)移情況，相對(duì)于99TCmMDP可能更具優(yōu)勢(shì)。

生物發(fā)光成像與18F-FDG SPECT/CT相比，在檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移具有靈敏度高，特異度高，無放射性，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。生物發(fā)光成像只能觀察到腫瘤的多少，但不能評(píng)估腫瘤細(xì)胞的代謝能力和活躍程度，且不能對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行精準(zhǔn)定位，有時(shí)不能區(qū)分是腦轉(zhuǎn)移還是顱骨轉(zhuǎn)移。而SPECT/CT能實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移灶的精準(zhǔn)定位，能反映腫瘤細(xì)胞的代謝情況，而且周期較短，在檢測(cè)骨轉(zhuǎn)移具有較高的靈敏度和特異度。

綜上，通過左心室注射luc+-PC-9細(xì)胞成功建立肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，為研究肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。生物發(fā)光成像是檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移敏感、準(zhǔn)確、無創(chuàng)的顯像方法。18F-FDG SPECT/CT不適合于檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移，但對(duì)骨轉(zhuǎn)移具有較好的準(zhǔn)確率。生物發(fā)光成像和18F-FDG SPECT/CT為肺癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立提供了先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，為腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究和藥物開發(fā)提供新的有用的工具。

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Comparison between bioluminescence imaging and SPECT/CT of mouse models of brain metastasis from lung adenocarcinoma

CHEN Yu-shen1,2, CHEN Zheng-wei1, YU Mei-e1, TU Xun-wei1,LI Hong-ru1,2, LIN Ling2, LIN Ru-hui3

(1.Department of Respiratory & Critical Care Medicine, Fujian Provincial Hospital, Provincial Clinical Medical College,Fujian Medical University, Fuzhou 350000 China; 2.Fujian Institute of Respiratory Diseases, Fuzhou 350000; 3.School of Basic Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350000; 4. Academy of Integrated Traditional and Western Medicine, Fuzhou 350000)

Objective To establish a mouse model of lung adenocarcinoma brain metastasis with human luc+-PC-9 cells stably expressing luciferase and to compare the evaluation values of bioluminescence imaging and18F-FDG (18F-fluorodeoxyglucose) SPECT/CT in these models. Methods Suspension of luc+-PC-9 cells was injected into the left ventricle of BALB/c nude mice to establish a mouse model of brain metastasis from lung cancer. Bioluminescence imaging and18F-FDG SPECT/CT were used to evaluate the metastasis of tumors as compared with HE-staining pathology as a golden standard. Results The success rate of brain metastases was 85% through injecting luc+-PC-9 cells into the left ventricle. The number of tumor cells was positively related to the intensity of light, with a linear correlation (R2=0.96). Fluorescence was observed in the brain, spine and femur by bioluminescence imaging, and the metastases were confirmed by H&E pathological examination.18F-FDG SPECT/CT observed abnormal density collective foci in the spine or femur but not in the brain. Conclusions Injection of tumor cell suspension into the mouse left ventricle is a good method to establish a brain metastasis of lung cancer. Bioluminescence has a higher sensitivity and specificity in detecting brain metastasis and bone metastasis, with advantages of real-time, dynamical and non-invasive detection of tumor metastasis growth.18F-FDG SPECT/CT does not have superiority in detection of brain metastases but is suitable for detecting bone metastasis.

Lung cancer; Brain metastasis; Bone metastasis; Animal model; Bioluminescence imaging; Single-photon emission computed tomography/computed tomography

CHEN Yu-shen， E-mail: slyyywb@126.com

國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科研基金-福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(WKJ-FJ-17)；福建省立醫(yī)院優(yōu)秀青年醫(yī)師項(xiàng)目(2014YNQN03)；福建省自然科學(xué)基金(2015J01376)。

陳愉生(1957年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師。Email： slyyywb@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0036-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.007

2016-07-10