薛雄燕，朱嫦琳，潘練華，黃少珍，李煒煊

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 528000)

DN不同中醫(yī)證型NF-κB信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)及意義*

薛雄燕，朱嫦琳，潘練華，黃少珍，李煒煊△

(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 528000)

目的 探討糖尿病腎病(DN)不同中醫(yī)證型核因子-κB(NF-κB)通路相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)差異及其臨床意義。方法 選取該院146例DN患者，按中醫(yī)辨證進(jìn)行分型，檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8水平，并與62例健康體檢者(對(duì)照組)比較。結(jié)果 不同中醫(yī)證型DN各組的TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平比較，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各個(gè)證型DN患者中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著DN病程進(jìn)展，各細(xì)胞因子水平均呈逐步升高的趨勢(shì)，且DN不同證型升高的幅度與時(shí)間不一致。結(jié)論 NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8與DN不同中醫(yī)證型具有相關(guān)性，可能在DN不同證型的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用。

糖尿病腎病；NF-κB；細(xì)胞信號(hào)通路；細(xì)胞因子類；中醫(yī)證型

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是終末期腎病最常見(jiàn)的致病原因和糖尿病致死的主要原因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的核因子-κB(NF-κB)與無(wú)并發(fā)癥的糖尿病患者及健康人之間有明顯差異[2]，提示NF-κB在DN的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。由于直接檢測(cè)NF-κB不易在臨床中開(kāi)展，本研究通過(guò)檢測(cè)不同中醫(yī)證型DN患者NF-κB信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子的水平及其在不同病程的變化，進(jìn)一步闡明NF-κB在DN發(fā)生、發(fā)展中的作用，為DN證型實(shí)質(zhì)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月至2015年3月在本院就診并確診為DN Ⅲ～Ⅴ期的患者共146例(觀察組)，其中男83例，女63例；年齡42～73歲，平均(56.13±8.74)歲；糖尿病病程10～24年，平均(13.47±6.88)年；DN病程0.25～8.00年，平均(2.18±0.95)年；納入病例均符合《腎臟病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中Ⅲ期82例，Ⅳ期43例，Ⅴ期21例。排除合并原發(fā)性腎臟疾病、嚴(yán)重心血管疾病、嚴(yán)重肝臟疾病、孕婦及哺乳期婦女和腫瘤患者。選擇同期本院健康體檢者62例作為對(duì)照組，其中男36例，女26例；年齡44～71歲，平均(55.87±7.96)歲。兩組對(duì)象性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn) 參照中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)腎病分會(huì)2007年的試行方案[4]，綜合各種證型及臨床表現(xiàn)，DN最常見(jiàn)類型可歸納為氣陰兩虛血瘀型(48/146，32.88%)、陰陽(yáng)兩虛血瘀型(52/146，35.62%)、脾腎陽(yáng)虛濕濁瘀阻型(18/146，12.33%)及其他證型(28/146，19.18%)4型。

1.2.2 檢測(cè)方法 采集兩組對(duì)象靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和IL-8的測(cè)定采用德國(guó)西門子公司的全自動(dòng)免疫分析儀(型號(hào)：Immune 1000)及配套試劑；IL-1的測(cè)定采用的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(型號(hào)：AB2202)；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司(型號(hào)：ELX-800)。以上檢測(cè)均嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 DN患者的病程分期情況 146例DN患者的病程分期情況，見(jiàn)表1。

2.2 不同中醫(yī)證型DN中NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)比較 DN不同證型的TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰陽(yáng)兩虛血瘀型的各個(gè)細(xì)胞因子水平明顯高于其他3種證型(P<0.05)；氣陰兩虛血瘀型的TNF-α、IL-6和IL-8明顯高于脾腎陽(yáng)虛濕濁瘀阻型和其他證型(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 DN患者的病程分期情況[n(%)]

表2 不同中醫(yī)證型DN中NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與陰陽(yáng)兩虛血淤型比較；c：P<0.05，與氣陰兩虛血瘀型比較。

2.3 NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子在DN不同階段的水平 隨著DN病程進(jìn)展，各細(xì)胞因子水平均呈逐步升高的趨勢(shì)。DN Ⅲ期時(shí)，陰陽(yáng)兩虛血瘀型TNF-α及IL-1水平顯著高于其他各組；至DN Ⅴ期時(shí)，氣陰兩虛血瘀型TNF-α水平快速升高，與陰陽(yáng)兩虛血瘀型基本一致，其余兩型升高不明顯。而各型IL-1及IL-6均穩(wěn)步上升。IL-8水平在DN Ⅲ期時(shí)各證型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；至Ⅴ期時(shí)，陰陽(yáng)兩虛血瘀型升高最明顯，其次為氣陰兩虛血瘀型，其余兩型升高不明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子在DN不同階段的變化

3 討 論

DN是終末期腎病最常見(jiàn)的致病原因，也是糖尿病致死的主要原因之一，在我國(guó)，約有30%的糖尿病患者最終進(jìn)展為DN[5]。由于DN可造成患者慢性腎衰竭，需要進(jìn)行血液透析與腎移植，給患者家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。DN在中醫(yī)學(xué)中屬下消、腎消范疇，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未發(fā)現(xiàn)滿意的治療方法，中醫(yī)是DN診治良好的補(bǔ)充手段。從長(zhǎng)期的臨床工作中發(fā)現(xiàn)，DN最常見(jiàn)類型可歸納為氣陰兩虛血瘀、陰陽(yáng)兩虛血瘀、脾腎陽(yáng)虛濕濁瘀阻及其他證型，而氣陰兩虛血瘀型最為常見(jiàn)。有研究指出，DN的病理分子機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)，NF-κB及其相關(guān)基因作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)眾多基因表達(dá)，參與DN的發(fā)生、發(fā)展[6]。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，臨床期DN患者、無(wú)并發(fā)癥的糖尿病患者和健康人之間NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β水平有顯著差異，提示NF-κB活性異常在DN發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要作用。此外，臨床相關(guān)分析表明，NF-κB活性與糖化血紅蛋白水平及血漿脂質(zhì)的超氧化物標(biāo)志物呈正相關(guān)[8]，提示NF-κB與DN的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此，本研究選取NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步明確NF-κB在DN發(fā)生、發(fā)展中的作用。

NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等。NF-κB活化可增強(qiáng)TNF-α和IL-1的基因轉(zhuǎn)錄，使二者產(chǎn)生和釋放增多，此外，NF-κB活化后還可使IL-6和IL-8產(chǎn)生和釋放增多，導(dǎo)致炎癥信號(hào)進(jìn)一步放大[9]，因此，TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平的變化可反映NF-κB信號(hào)通路的激活情況。本研究結(jié)果顯示，所有證型的DN患者血清中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8水平均明顯高于對(duì)照組，提示DN患者體內(nèi)NF-κB通路被激活，導(dǎo)致通路相關(guān)細(xì)胞因子分泌增加。其中，陰陽(yáng)兩虛血瘀型的患者TNF-α、IL-1及IL-8水平均明顯高于其他3種證型，IL-6水平與氣陰兩虛血瘀型患者相當(dāng)，明顯高于脾腎陽(yáng)虛濕濁瘀阻型和其他證型，提示NF-κB與DN的發(fā)生及DN中醫(yī)證型具有一定的相關(guān)性。

Dabhi等[10]研究顯示，TNF-α可刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，可激活I(lǐng)L-1、IL-6等細(xì)胞因子，促進(jìn)腎小球細(xì)胞釋放膠原酶，促進(jìn)DN發(fā)病。本研究也發(fā)現(xiàn)隨著DN病程進(jìn)展，各細(xì)胞因子水平均呈逐步升高的趨勢(shì)，與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道一致，DN不同病程分期中，陰陽(yáng)兩虛血瘀型TNF-α水平升高最為明顯，各組IL-1及IL-6均穩(wěn)步上升，其發(fā)生機(jī)制可能與TNF-α和IL-6可通過(guò)促進(jìn)系膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞增生而導(dǎo)致腎小球硬化有關(guān)。IL-1是重要的炎性因子之一，也是熱原質(zhì)成分，具有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用，可受各種刺激因子誘導(dǎo)，與DN的病理過(guò)程密切相關(guān)[13]。IL-6是一種炎性反應(yīng)啟動(dòng)因子，同時(shí)具有促炎和抗炎的作用，在DN各個(gè)證型患者血清中水平顯著升高。但與氣陰兩虛血瘀型患者TNF-α水平至DN Ⅴ期時(shí)才快速升高的變化不一致的是，IL-6在氣陰兩虛血瘀型DN中升高程度與陰陽(yáng)兩虛血瘀型基本一致，不可作為鑒別這兩種證型的指標(biāo)，同時(shí)也提示IL-6升高可能比TNF-α發(fā)生更早。IL-8主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有中性粒細(xì)胞趨化、脫粒、釋放溶酶、加強(qiáng)炎癥防護(hù)等作用。有研究表明，IL-8在DN早期開(kāi)始增高，并隨著DN的發(fā)展逐漸升高[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-8在DN各個(gè)證型中均明顯升高，在DN Ⅲ期時(shí)各型無(wú)明顯差異，至Ⅴ期時(shí)，陰陽(yáng)兩虛血瘀型升高最明顯，其次為氣陰兩虛血瘀型，其余兩型升高不明顯，與TNF-α變化規(guī)律基本一致，可作為DN不同中醫(yī)證型的鑒別指標(biāo)，用于指導(dǎo)治療。

綜上所述，NF-κB通路相關(guān)細(xì)胞因子與DN不同中醫(yī)證型具有相關(guān)性，在DN不同證型的發(fā)生、發(fā)展起一定作用，可作為DN不同中醫(yī)證型的鑒別指標(biāo)。然而，由于DN的中醫(yī)辨證分型缺乏統(tǒng)一性，本研究中醫(yī)分型參考DN患者虛證與實(shí)證情況并結(jié)合長(zhǎng)期的臨床工作經(jīng)驗(yàn)，將納入研究的DN病例進(jìn)行分型，未包括DN所有中醫(yī)證型，因此，仍需加大樣本量進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討NF-κB在DN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的確切機(jī)制。

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Detection and significance of cytokines related to NF-κB signaling pathway in patients with different TCM syndrome types of diabetic nephropathy*

XueXiongyan,ZhuChanglin,PanLianhua,HuangShaozhen,LiWeixuan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FoshanMunicipalFirstPeople′sHospital,Foshan,Guangdong528000,China)

Objective To explore the expression difference of cytokines related to nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway among different traditional Chinese medicine (TCM) syndromes in the patients with diabetic nephropathy (DN).Methods Serum tumor necrosis factor-α (TNF-α),interleukin-1 (IL-1),interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8) in 146 patients with DN and 62 individuals undergoing healthy physical examination in the control group were measured.Results The levels of serum TNF-α,IL-1,IL-6 and IL-8 in various DN groups were significantly higher than those in the control group (P<0.05).The levels of serum TNF-α,IL-1,IL-6 and IL-8 were significantly different among groups of different TCM syndromes (P<0.05).With the progression of DN,all cytokines levels showed a gradually increasing trend,moreover the increased extents and time were different in different TCM syndrome types of DN.Conclusion The levels of serum TNF-α,IL-1,IL-6 and IL-8 related to NF-κB signaling pathway are correlated with different TCM syndromes types and may play a role in the occurrence and progression of different TCM syndrome types of DN.

diabetic nephropathy;NF-kappa B;cell signaling pathway;cytokines;traditional Chinese Medicine syndrome

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.011

佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014AB00287)。 作者簡(jiǎn)介：薛雄燕(1977-)，副主任技師，本科，主要從事醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及細(xì)胞因子研究?！?/p>

，E-mail:lwx21cn@163.com。

R446.1

A

1671-8348(2017)07-0898-03

2016-07-19

2016-11-17)