段海霞，李東紅，暴 蕾，李 歡，高紅敏

(陜西省西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科 710004)

NF-κB信號通路介導(dǎo)楤木皂甙抗宮頸癌作用及機(jī)制研究*

段海霞，李東紅△，暴 蕾，李 歡，高紅敏

(陜西省西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科 710004)

目的 探討楤木皂苷對人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，揭示核因子-κB(NF-κB)在楤木皂苷抑癌過程中的分子機(jī)制。方法 以體外培養(yǎng)的人宮頸癌細(xì)胞HeLa系為研究對象，實驗分為對照組、楤木皂苷(200 μg/mL)處理組(觀察組)，48 h后觀察兩組HeLa細(xì)胞增殖能力的改變。運(yùn)用Western blot檢測NF-κB的表達(dá)及酵母自噬基因Atg5/Vps30的同源基因(Beclin 1)、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)的改變。結(jié)果 楤木皂苷能夠顯著抑制HeLa細(xì)胞的增殖；楤木皂苷能夠抑制NF-κB信號通路及促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、Atg 5、LC3B的表達(dá)。結(jié)論 楤木皂苷能夠抑制NF-κB信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生影響宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖和遷移。

宮頸腫瘤；楤木皂苷；自噬；NF-κB

宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的惡性腫瘤，并具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。其發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與高危型人乳頭瘤病毒(high risk-human papillomavirus，HR-HPV)的持續(xù)感染相關(guān)[2]。針對宮頸癌的治療以手術(shù)結(jié)合放療、化療為主，但目前針對宮頸癌的治療仍存在一定的局限性。因此，盡早找尋能夠抑制宮頸癌發(fā)展的藥物是當(dāng)今相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

自噬是細(xì)胞程序性死亡的一種，也被稱為二型程序性死亡，當(dāng)細(xì)胞受到例如饑餓、病毒感染、外源性刺激、細(xì)胞內(nèi)異常蛋白蓄積時就會誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[3-4]。正常水平的自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)定的一種生理過程，然而過度的自噬則會引起細(xì)胞的死亡。核因子-κB(NF-κB)信號通路是抗腫瘤研究中較為重點(diǎn)的一條信號通路，作為一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛地參與免疫應(yīng)激、生長分化、細(xì)胞增殖等生命活動[5-6]。楤木皂苷是我國重要的中藥藥材之一，具有保肝護(hù)肝、降血糖降血脂、抗氧化抗病毒等功能。有研究表明，楤木皂苷具有一定的抗腫瘤作用，本課題前期結(jié)果也證實楤木皂苷能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。因此，研究楤木皂苷對宮頸癌的抑制作用具有一定的理論基礎(chǔ)。另外研究、開發(fā)楤木皂甙的抗宮頸癌作用，將會為宮頸癌的生物學(xué)治療提供更多理論基礎(chǔ)和分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細(xì)胞由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗醫(yī)學(xué)中心提供；楤木皂苷由西京醫(yī)院藥劑科提供；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Invitrogen 公司；肌動蛋白(Actin)、酵母自噬基因Atg5/Vps30的同源基因(Beclin 1)、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)和NF-κB抗體購自Abcam 公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Amressco 公司；二甲基亞砜(DMSO)購自天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)條件培養(yǎng)Hela細(xì)胞，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件。

1.2.2 Hela細(xì)胞生長抑制及遷移的檢測 實驗分為對照組、楤木皂苷(200 μg/mL)處理組(觀察組)。48 h后加入新配置的5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)放入孵箱4 h，棄去上清液后每孔加入150 μL的DMSO，震蕩混勻。運(yùn)用490 nm的酶標(biāo)儀檢測吸光度。

1.2.3 Western blot檢測信號通路及自噬相關(guān)蛋白 收取蛋白樣品，運(yùn)用蛋白定量檢測的方法測定蛋白水平。50 μg蛋白加入上樣緩沖液后進(jìn)行凝膠電泳，再電轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。孵育一抗和二抗，用化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光、顯影、定影。以Actin作為內(nèi)參照。條帶用薄層掃描儀掃描，再運(yùn)用軟件分析各條帶灰度值，計算各蛋白(Beclin 1、LC3B、NF-κb)的相對水平。

1.2.4 激活NF-κB信號通路對抑制自噬的發(fā)生及促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖的影響 運(yùn)用NF-κB受體的激動因子(receptor activator of NF-kappa B ligand，RANKL)干預(yù)后(RANKL組)，與楤木皂苷共同處理(聯(lián)合組)，并觀察各組細(xì)胞NF-κB信號通路激活的情況。

2 結(jié) 果

2.1 兩組Hela細(xì)胞增殖活力比較 MTT細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，觀察組與對照組比較，細(xì)胞增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 運(yùn)用Western blot檢測了兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、Atg 5、LC3B的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組能夠顯著促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白的水平，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與對照組比較。

圖1 兩組Hela細(xì)胞增殖活力比較

a：P<0.05，與對照組比較。

圖2 兩組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.3 兩組細(xì)胞NF-κB信號中p65蛋白表達(dá)比較 運(yùn)用Western blot檢測了NF-κB信號通路中p65蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示觀察組NF-κB信號通路處于抑制狀態(tài)，與對照組比較，觀察組p65蛋白受到抑制，見圖3。

2.4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)比較 采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活NF-κB信號通路能夠抑制自噬的發(fā)生及促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖，運(yùn)用RANKL干預(yù)后，能夠引起NF-κb信號通路激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楤木皂苷誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬性死亡降低，促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5、LC3B的表達(dá)(圖4)；自噬相關(guān)蛋白表達(dá)受到抑制，楤木皂苷引起的細(xì)胞增殖活力降低得到了逆轉(zhuǎn)，見圖5。

a：P<0.05，與對照組比較。

圖3 兩組細(xì)胞NF-κB信號中p65蛋白表達(dá)比較

1：對照組；2：觀察組；3：RANKL組；4：聯(lián)合組；a：P<0.05，與對照組比較，b：P<0.05，與觀察組比較。

圖4 Western blot 檢測各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

a：P<0.05，與對照組比較，b：P<0.05，與觀察組比較。

圖5 各組Hela細(xì)胞的增殖活力比較

3 討 論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，并具有較高的發(fā)病率和病死率，每年約有20萬婦女死于此病[7]。我國宮頸癌的發(fā)病率較高，其中西北地區(qū)該病的死亡率最高。其發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與HR-HPV的持續(xù)感染相關(guān)。宮頸癌的遷移與侵襲是該病治愈較難的主要原因，一些鄰近器官均會受到癌細(xì)胞的侵蝕。目前針對宮頸癌的治療主要以手術(shù)結(jié)合放、化療為主。但均未有很好的療效，因此尋找治療宮頸癌的新藥具有重要的意義。

楤木皂苷是我國重要的中藥藥材之一，具有保肝護(hù)肝、降血糖降血脂、抗氧化抗病毒等功能[8]。另有研究表明楤木皂苷具有一定的抗腫瘤作用，本課題前期結(jié)果也證實楤木皂苷能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。因此，研究楤木皂苷對宮頸癌的抑制作用具有一定的理論基礎(chǔ)。另外研究、開發(fā)楤木皂甙的抗宮頸癌作用，將會為宮頸癌的生物學(xué)治療提供更多理論基礎(chǔ)和分子靶點(diǎn)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬作為程序性死亡的一種，在腫瘤細(xì)胞存活的命運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用，諸多抗腫瘤藥物的作用機(jī)制均與自噬的發(fā)生相關(guān)[3]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞自噬過度發(fā)生后，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，楤木皂苷處理后能夠顯著促進(jìn)自噬水平的升高。這種自噬水平的增高可能與楤木皂苷抑制Hela細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān)。之前的研究表明，調(diào)控自噬發(fā)生的機(jī)制中，主要以mTOR信號通路為主。NF-κB信號通路與腫瘤的增殖和遷移關(guān)系密切[10-14]。RANKL是NF-κB信號通路的激動劑。在前期的研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，楤木皂苷能夠抑制Akt/NF-κB信號通路的活性。NF-κB信號通路與自噬水平的增強(qiáng)存在一定的關(guān)聯(lián)性。本研究運(yùn)用NF-κB信號通路的激動劑后，觀察Hela細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NF-κB信號通路被抑制后，自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3B水平降低。以上結(jié)果提示，NF-κB信號通路參與了楤木皂苷誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬性死亡。

綜上所述，楤木皂苷對Hela細(xì)胞的抑制作用可能與促進(jìn)其自噬的發(fā)生有關(guān)，并且自噬的發(fā)生受到了NF-κB信號通路的調(diào)控。楤木皂苷很可能會成為一種臨床上治療宮頸癌的有效藥物。

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Research on anti-cervical cancer effect of araloside mediated by NF-kappa B signaling pathway and its mechanism*

DuanHaixia,LiDonghong△,BaoLei,LiHuan,GaoHongmin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,Xi′anMunicipalFourthPeople′sHospital,Xi′an,Shaanxi710004,China)

Objective To explore the inhibition role of araloside on cervical cancer HeLa cell proliferation and migration to reveal the molecular mechanism of NF-κB in HeLa cell in the process of tumor suppression.Methods The in vitro cultured cervical cancer HeLa cell line served as the research object.The experiment was divided into the control group and araloside(200 μg/mL) treatment group(observation group).The change of proliferation and migration ability after 48 h were observed in the two groups.Western blot was used to detect the expression of NF-κB molecule and change of autophagy involved protein Beclin 1 and LC3B.Results Araloside could significantly inhibit the proliferation and migration of HeLa cells and the NF-κB signaling pathway,and promoted the expression of autophagy related molecule Beclin 1，Atg 5 and LC3B.Conclusion Araloside could inhibit the NF-κB signaling pathways,thus induces autophagy occurrence and influences the proliferation and migration of cervical cancer HeLa cells.

uterine cervical neoplasms;araloside;autophagy;NF-kappa B

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.008

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃基金資助項目(2013K12-03-22)。 作者簡介：段海霞(1983-)，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事宮頸癌的機(jī)制研究?！?/p>

，E-mail：lidonghong2014@126.com。

R737.33

A

1671-8348(2017)07-0889-03

2016-08-20

2016-11-03)