韓曉芳

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017）

Th9細(xì)胞與其分泌的細(xì)胞因子在自身免疫性疾病病程中發(fā)揮重要作用。本文擬利用ICOS轉(zhuǎn)基因小鼠及其對(duì)照小鼠作為RA模型，初步探討共刺激信號(hào)ICOS調(diào)控Th9在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用，為后續(xù)RA的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Anti-mouse CD4 FITC，anti-mouse IL-9 PE，anti-mouse ICOS （CD278）PE等流式抗體均購(gòu)買自eBioscience公司；RPMI1640、PMA、BFA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；IL-9sandwich ELISA 試劑盒購(gòu)買自eBioscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立

RA小鼠模型的制備

ICOS轉(zhuǎn)基因小鼠、對(duì)照小鼠各30只，后進(jìn)行如下操作：

（1）膠原-佐劑混合乳劑的配制

①將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 M冰醋酸溶液中，濃度為2 mg/mL，4℃過夜；②在無菌的條件下，用1 mL的注射器吸取牛Ⅱ型膠原，置于一潔凈的器皿中；③用1 mL的注射器吸取等量佐劑，置于含牛Ⅱ型膠原的潔凈器皿中；④用注射器來回推拉，使牛Ⅱ型膠原和佐劑充分混勻，至液體呈乳白色。整個(gè)操作過程均在冰上進(jìn)行，以防止膠原變形。

（2）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的制備

每只實(shí)驗(yàn)小鼠背部取4-6點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，總共200μl膠原-完全弗氏佐劑混合乳劑，三周后，用同樣的方法將不完全弗氏佐劑與牛Ⅱ型膠原乙酸溶液等量混合并乳化，于每只小鼠尾根部取3-5點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，總共100μl，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tfh/Th9細(xì)胞群比例

制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，用0.01MPBS洗2次，每個(gè)流式管內(nèi)加入細(xì)胞術(shù)為1×106個(gè)。以下操作均在冰上，檢測(cè)CD3+CD8-IL9+標(biāo)記的Th9細(xì)胞，避光4℃孵育30 min后，冰凍PBS離心（300～400 g）洗滌3次，棄上清，重懸細(xì)胞，流式送檢，用Flowjo7.6軟件分析。

1.2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的檢測(cè)

采用ELISA雙抗夾心法測(cè)定并觀察IL-9細(xì)胞因子在小鼠不同病期脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphpadPrism5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（CA公司，美國(guó)）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ICOS轉(zhuǎn)基因小鼠不同病期脾細(xì)胞中Th9細(xì)胞群的表達(dá)特征

RA小鼠脾細(xì)胞中Th9細(xì)胞群從6周到12周逐漸上升，ICOS轉(zhuǎn)基因RA小鼠脾細(xì)胞Th9亞群比例在6周和12周均明顯高于野生型小鼠（6w：4.94+1.42vs2.45+1.09）（12w：13.85+3.32vs8.93+2.56，P＜0.05）。

2.2 ICOS轉(zhuǎn)基因RA小鼠不同病期脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-9檢測(cè)

RA小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-9表達(dá)從6周到12周逐漸上升，ICOS轉(zhuǎn)基因RA小鼠IL-9的表達(dá)在6周和12周均明顯高于野生型小鼠（6w：6.15+1.63vs2.41+0.96；12w：10.76+2.16vs7.86+1.77，P＜0.05）。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，RA小鼠隨著病情的進(jìn)展，Th9的表達(dá)率增多，并且ICOS轉(zhuǎn)基因RA小鼠外周血Th9較正常對(duì)照表達(dá)明顯升高，推測(cè)可能是RA發(fā)病的重要原因，而ICOS在其中發(fā)揮了重要作用。此外，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-9的表達(dá)經(jīng)ELISA檢測(cè)的結(jié)果提示，ICOS轉(zhuǎn)基因RA小鼠的IL-9的表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)。進(jìn)一步提示，ICOS參與了Th9的炎癥效應(yīng)。

目前Th9細(xì)胞被認(rèn)為是最重要的誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的效應(yīng)T細(xì)胞亞群[1-2]，同時(shí)區(qū)別于Th1、Th2、Th17及Trey，但是又有很多相關(guān)聯(lián)的機(jī)制，在很多種自身免疫性疾病發(fā)病的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究[3]，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論提示RA等免疫失調(diào)的疾病與Th9細(xì)胞的異常增多或者細(xì)胞相關(guān)的效應(yīng)分子的異常表達(dá)是有聯(lián)系的，故將Th9細(xì)胞的相關(guān)分子作為靶點(diǎn)下調(diào)有望為免疫性疾病的治療提供新的機(jī)遇。

[1] 康 霞.ICOS+Treg細(xì)胞和B10細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及作用機(jī)制研究[D].南方醫(yī)科大學(xué),2014.

[2] 張 娜.黃芪糖蛋白干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠T細(xì)胞免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京中醫(yī)藥大學(xué),2016.